Potentiel neuroprotecteur du verbascoside isolé des feuilles d’Acanthus mollis L. par son inhibition enzymatique et sa capacité de piégeage des radicaux libres
Référence : Antioxidants 2020. — PMC7759776/PMID 33266151 · DOI 10.3390/antiox9121207 Type : etude in vitro · Plante : Acanthe a feuilles molles · Propriété → Neuro & cognition Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Le phénomène du vieillissement de la population actuelle a accru l’intérêt pour la recherche de nouvelles substances actives qui retardent l’apparition et le développement des maladies neurodégénératives. À cet égard, la recherche de composés naturels, principalement des composés phénoliques, dotés d’une activité neuroprotectrice est devenue le centre d’un intérêt croissant. Le verbascoside est un phényléthanoïde qui a déjà présenté plusieurs activités pharmacologiques. Le but de cette étude est d’isoler et d’identifier le verbascoside à partir de feuilles d’Acanthus mollis. Par conséquent, sa capacité neuroprotectrice par inhibition enzymatique et sa capacité de piégeage des radicaux libres ont été analysées à la fois in vitro et dans des essais en culture cellulaire. La capacité antioxydante du verbascoside a été évaluée in vitro par des essais de capacité antioxydante totale, et d’activité de piégeage du DPPH•, du •OH et de l’O2•−. L’effet du verbascoside sur les niveaux intracellulaires d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) des lignées cellulaires HepG2 et SH-SY5Y a été étudié en culture normale et sous stress oxydatif induit. La capacité inhibitrice du phényléthanoïde contre plusieurs enzymes impliquées dans les maladies neurodégénératives (tyrosinase, MAO-A et AChE) a été analysée in vitro. L’activité neuroprotectrice du verbascoside est liée, au moins en partie, à sa capacité de piégeage des radicaux libres. L’effet du verbascoside sur la production de ROS suggère son potentiel dans la prévention de modifications redox cellulaires délétères et dans le renforcement de la neuroprotection.
1. Introduction
Au cours des 100 dernières années, l’espérance de vie humaine a considérablement augmenté, et avec elle l’âge moyen de la population. Ce vieillissement progressif de la société est associé à une plus grande prévalence des maladies liées à l’âge, ce qui constitue un problème majeur de santé publique. Une grande proportion des personnes âgées de plus de 60 ans souffrent d’un déclin cognitif, de déficits mnésiques et de modifications de la structure cérébrale. La maladie d’Alzheimer (MA) et la maladie de Parkinson (MP) sont devenues les troubles neurodégénératifs les plus fréquents. À cet égard, le stress oxydatif est fortement impliqué dans la progression de la dégénérescence neuronale.
Le renforcement de la transmission cholinergique a été considéré comme l’un des principaux objectifs thérapeutiques pour le traitement de la MA. Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase (AChE) peuvent atténuer les déficits cholinergiques et augmenter la neurotransmission en élevant les niveaux d’acétylcholine, ce qui entraîne une amélioration de la fonction cognitive de ces patients.
La tyrosinase catalyse l’oxydation de la tyrosine, qui constitue une étape limitante de la synthèse de la mélanine. Par conséquent, cette enzyme joue un rôle fondamental dans la pigmentation de la peau, des yeux et des cheveux humains. En outre, il existe également une relation entre le mélanome, la MP et cette enzyme. Les altérations liées à la mélanine sont associées à l’apparition de cancers cutanés, tels que le mélanome, tandis que ces altérations de la neuromélanine sont corrélées aux maladies neurodégénératives telles que la MP. Ce fait suggère que la mélanine, et donc la tyrosinase, pourraient être des facteurs significatifs dans la modification de la vulnérabilité à ces affections, bien que les mécanismes précis de leur implication restent encore à élucider.
Les deux isoformes de la monoamine oxydase (MAO), A et B, catabolisent les neurotransmetteurs monoaminergiques et constituent donc des cibles thérapeutiques pour les maladies neuropsychiatriques et neurodégénératives. Les inhibiteurs de la MAO-A augmentent les niveaux de noradrénaline et de sérotonine dans le cerveau et sont employés pour traiter l’anxiété et la dépression. En revanche, les inhibiteurs de la MAO-B sont utiles pour le traitement symptomatique de la MP.
Un autre facteur clé de la neurotoxicité et de la mort cellulaire est le stress oxydatif, qui est responsable, au moins en partie, de l’apparition et du développement des troubles neurodégénératifs. Le stress oxydatif est directement lié à la production et à l’augmentation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), d’espèces réactives de l’azote et de radicaux superoxyde. Les radicaux libres provoquent des dommages oxydatifs dans des biomolécules cellulaires essentielles, telles que les protéines, les lipides et les acides nucléiques, en altérant leur structure et en affectant leur fonction. Par conséquent, ils pourraient déclencher des processus d’apoptose cellulaire. Au cours du vieillissement cellulaire, la quantité de ces radicaux augmente, et une forte production de ROS suppose donc un facteur de risque dans la pathogenèse et la progression de nombreuses maladies.
Le verbascoside (également connu sous le nom d’actéoside et de kusaginine) est un glycoside phényléthanoïde : 2-(3,4-dihydroxyphényl)éthyl-1-Ο-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(4-Ο-Ε-caféoyl)-β-D-glucopyranoside (Figure 1). Ce composé phénolique est un produit de la voie de l’acide shikimique, mais la synthèse et les enzymes qui y sont impliquées n’ont pas encore été complètement élucidées.
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De nos jours, les études sur les composés phénoliques suscitent un intérêt croissant en raison de leurs bénéfices potentiels pour la santé, par exemple dans la prévention du cancer et des maladies cardiovasculaires, et même des troubles neurodégénératifs tels que la MA. À cet égard, les plantes contenant de fortes quantités de verbascoside ont traditionnellement été utilisées à diverses fins, ce qui a suscité l’intérêt pour ce composé.
Plusieurs effets bénéfiques ont été rapportés pour ce composé, notamment des effets antibactériens, cytoprotecteurs, antitumoraux, cicatrisants, antioxydants, gastroprotecteurs, neuroprotecteurs et photoprotecteurs, entre autres.
Le verbascoside bloque le dépôt amyloïde et réduit la toxicité du peptide amyloïde β. Ce phényléthanoïde inhibe l’oligomérisation du peptide amyloïde β et améliore sa dégradation. Du fait de ces activités, l’actéoside apparaît comme un agent thérapeutique prometteur pour la MA. Les effets neuroprotecteurs sont également indirectement améliorés par les effets antioxydants de cette molécule. À cet égard, elle augmente les principales enzymes antioxydantes cellulaires telles que la glutathion peroxydase et réductase, la catalase et la superoxyde dismutase.
Acanthus mollis L. est une plante herbacée de la famille des Acanthaceae. Originaire du bassin méditerranéen, elle possède de nombreux usages médicinaux traditionnels. Ses feuilles sont utilisées comme diurétique et analgésique pour les douleurs digestives et urinaires. Leur infusion est employée dans le sud de l’Italie, à Porto Santo et à Madère pour le traitement du psoriasis, de la dermatite atopique, d’autres troubles cutanés irritatifs, des tumeurs, des ulcères, et comme anti-inflammatoire pour les jambes enflées. En Sardaigne, en Espagne et au Portugal, les feuilles sont bouillies et appliquées en cataplasme comme émollient ou comme protection cutanée. Elles sont également recommandées pour le traitement des plaies et des brûlures, des hémorroïdes, des maux de dents et de l’inflammation de la cavité buccale. À ce jour, plusieurs études pharmacologiques ont rapporté la capacité anti-inflammatoire et antihémorroïdaire des feuilles d’A. mollis, ainsi que la capacité antifongique et antioxydante de certains extraits.
Le but de cette étude était d’analyser la capacité neuroprotectrice et de piégeage des radicaux libres, par des essais in vitro et en culture cellulaire, du verbascoside isolé des feuilles d’A. mollis. Chaque évaluation antioxydante diffère par les radicaux générés, les stratégies analytiques, la capacité antioxydante évaluée et la sensibilité de l’essai. Ainsi, l’antioxydation doit être évaluée par une variété d’essais afin de comprendre le mécanisme d’action de la molécule. Dans cette étude, la capacité de piégeage des radicaux DPPH• et •OH a été analysée, de même que l’effet du verbascoside sur le système xanthine/xanthine oxydase (en étudiant à la fois l’effet contre l’enzyme et l’activité de piégeage du superoxyde) et l’activité antioxydante totale. Le potentiel neuroprotecteur in vitro a été évalué par l’analyse de l’effet du phényléthanoïde contre plusieurs enzymes impliquées dans les maladies neurodégénératives : tyrosinase, MAO-A et AChE. Pour les études en culture cellulaire, deux lignées cellulaires ont été utilisées : HepG2 comme modèle d’hépatocyte humain et SH-SY5Y pour évaluer la neuroprotection. L’effet du verbascoside sur les niveaux intracellulaires de ROS de ces cellules a été évalué en culture normale et sous stress oxydatif induit.
2. Materials and Methods
2.1. General Experimental Procedure and Chemicals
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)-d6 sur un spectromètre Bruker Avance 500 fonctionnant à 500 MHz (1H) et 125 MHz (13C). Les déplacements chimiques (δ, en ppm) ont été référencés au tétraméthylsilane (TMS), et J a été exprimé en Hz. La FAB-MS a été réalisée sur un spectromètre de masse Thermo Scientific TSQ 8000 Evo Triple Quadrupole (70 eV) (Thermo Fisher Scientific, USA). Le spectre UV-Vis a été enregistré dans du méthanol sur un spectrophotomètre Shimadzu UV-1800 avec chromatographie sur colonne de gel de silice (Merck, 107734, Darmstadt, Allemagne). L’éthanol, le méthanol, l’éther de pétrole, l’acétate d’éthyle et le n-butanol ont été obtenus auprès de Panreac® (Barcelone, Espagne). Tous les produits chimiques étaient de qualité réactif analytique. Une quantité de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) sous forme radicalaire libre et l’acétylcholinestérase (AChE) ont été achetées auprès de Sigma (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne).
2.2. Plant Material and Extract Preparation
Acanthus mollis L. (Acanthaceae) a été collecté en septembre 2016 à Aravaca (Madrid, Espagne) (40º 27´13,8” N, –3º 45´37,5” W). Un spécimen témoin (réf. 3372) a été déposé dans l’herbier de la Faculté de pharmacie, Université San Pablo, CEU Madrid. Les feuilles (300 g) de cette plante ont été séchées à température ambiante, réduites en poudre et extraites trois fois avec 3 L d’éthanol (EtOH) dans un bain ultrasonique (Ultrasons, Selecta®, Barcelone, Espagne) à 60 °C pendant 1 h. L’extrait éthanolique a été évaporé à sec (40,11 g), suspendu dans 50 mL d’eau distillée, puis extrait successivement avec de l’éther de pétrole (PET), de l’acétate d’éthyle (EtOAc) et du n-butanol (n-BuOH).
2.3. Extract Fractionation and Isolation
L’extrait d’acétate d’éthyle (4 g) a été soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice avec EtOAc:MeOH:H2O (80:3:3) pour donner le composé 1 (80 mg) sous forme d’aiguilles blanches après recristallisation avec MeOH. Ce composé a été caractérisé par des analyses spectroscopiques, comprenant RMN 1H, RMN 13C, RMN 2D (1H-1H COSY, HMBC), FAB-MS et UV.
2.4. Cell Culture
Les lignées cellulaires d’hépatocarcinome humain HepG2 et de neuroblastome humain SH-SY5Y ont été obtenues auprès de l’European Collection of Cell Cultures (Health Protection Agency, Londres, Royaume-Uni) (ECACC réf. 85011430 et réf. 94030304, respectivement). La lignée cellulaire HepG2 est un modèle qui reproduit l’hépatocyte humain et a été largement utilisée dans l’évaluation des effets antioxydants de divers composés naturels. D’autre part, SH-SY5Y est couramment utilisée comme modèle in vitro de fonction neuronale et de différenciation neuronale. Les cellules HepG2 ont été cultivées dans de l’EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) et les SH-SY5Y dans Ham’s F-12: EMEM (EBSS) 1:1, tous deux supplémentés avec 2 mM de glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels, du sérum bovin fœtal (FBS) inactivé (HyClone, Logan, UT, USA) (10 % pour HepG2 et 15 % pour SH-SY5Y), et 1 % d’antibiotiques (10 000 unités de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine). Les deux lignées HEPG2 et SH-SY5Y ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Pour les essais antioxydants, les cellules ont été incubées dans un milieu supplémenté avec seulement 1 % de FBS afin de prévenir la formation d’artefacts cytotoxiques résultant de l’interaction possible entre les composants du FBS et les composés phénoliques. Les produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne).
2.5. In Vitro Antioxidant Activity Assay
2.5.1. DPPH• Scavenging Assay
L’essai au 2,2-diphényl-β-picrylhydrazyle (DPPH) a été réalisé pour tester l’activité de piégeage des radicaux libres in vitro du verbascoside. Cet essai consiste à analyser la capacité du verbascoside à réduire le radical stable DPPH• en donnant un hydrogène, formant ainsi DPPH-H. Cette réduction entraîne un changement de couleur du DPPH, qui passe du violet (forme oxydée) (bande d’absorption 517 nm) au jaune (forme réduite). Dans une plaque à 96 puits, 100 µL de DPPH 1 mM dans du MetOH et 100 µL de verbascoside ou d’acide ascorbique ont été mélangés à diverses concentrations dans du MetOH. La plaque a été incubée pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité, et l’absorbance a été mesurée dans un lecteur de plaque Versa Max (Molecular Devices) à 517 nm.
Le pourcentage de réduction du DPPH a été calculé à l’aide de la formule : Réduction % = [(A0 − A1)/A0] × 100 (1), où A0 est l’absorbance du contrôle et A1 est l’absorbance du verbascoside ou de l’acide ascorbique à chaque concentration. Avec ces données, l’IC50 de chaque composé a été déterminée comme la concentration capable de réduire le radical DPPH de 50 %.
Les résultats ont été exprimés comme l’IC50 moyenne des trois réplicats.
2.5.2. Xanthine/Xanthine Oxidase Assay
Le système xanthine/xanthine oxydase génère des radicaux superoxyde capables de réduire le NBT (nitro blue tetrazolium). Les substances antioxydantes peuvent capturer ces radicaux et empêcher la réduction du NBT. La capacité de capture du verbascoside à diverses concentrations a été quantifiée en mesurant les changements d’absorbance à 560 nm au cours du temps. L’acide ascorbique a été utilisé comme composé de référence.
Tous les réactifs ont été préparés dans un tampon phosphate (50 mM de KH2PO4/KOH, pH 7,4). Pour la préparation du blanc, 100 µL de tampon phosphate, 10 µL d’EDTA 15 mM, 15 µL d’hypoxanthine 3 mM et 25 µL de NBT 0,6 mM ont été mélangés. Pour le contrôle positif, 75 µL de tampon phosphate 50 mM, 10 µL d’EDTA 15 mM, 15 µL d’hypoxanthine 3 mM, 25 µL de NBT 0,6 mM et, enfin, 25 µL de xanthine oxydase (1 unité par 10 mL de tampon) ont été ajoutés. Enfin, afin d’évaluer l’activité du verbascoside ou du composé de référence, dans chaque puits, 62,5 µL de tampon phosphate, 10 µL d’EDTA 15 mM, 15 µL d’hypoxanthine 3 mM, 12,5 µL de verbascoside ou d’acide ascorbique à différentes concentrations, 25 µL de NBT 0,6 mM et 25 µL de xanthine oxydase (1 unité/10 mL de tampon) ont été mélangés.
Les mesures d’absorbance ont été effectuées pendant 40 min à intervalles de 5 min sur le lecteur de plaque Versa Max (Molecular Devices) à 560 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition de la réduction du NBT.
Afin d’analyser la capacité du phénylpropanoïde à inhiber l’enzyme xanthine oxydase, la quantité d’acide urique produite (295 nm) a été déterminée, et les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition de la production d’acide urique. À cette fin, 600 µL de tampon phosphate 50 mM pH 7,4, 60 µL d’EDTA 15 mM, 90 µL de xanthine 0,1 mM, 75 µL de tampon ou de verbascoside à diverses concentrations et enfin 150 µL de xanthine oxydase (1 unité/10 mL de tampon) ont été mélangés. Les mesures d’absorbance ont été effectuées pendant 40 min à intervalles de 5 min sur le lecteur de plaque Versa Max (Molecular Devices). Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition de l’enzyme xanthine oxydase. Tous les tests ont été conduits en triplicat.
2.5.3. Hydroxyl Radical Scavenging Capacity
Le mélange réactionnel pour la détermination de la capacité de piégeage du radical hydroxyle du verbascoside et d’une substance de référence consistait en 1 mL de FeSO4 1,5 mM, 0,7 mL de peroxyde d’hydrogène 6 mM, 0,3 mL de salicylate de sodium 20 mM et 1 mL de différentes concentrations de verbascoside ou d’acide ascorbique (0,07-0,33 mg/mL). Après 1 h d’incubation à 37 °C, l’absorbance du complexe hydroxyle a été mesurée à 562 nm sur le lecteur de plaque Asys UVM 340.
La capacité de piégeage en pourcentage a été calculée à l’aide de l’équation suivante : Piégeage % = [1 − (A1 − A2)/A0] × 100 (2), où A0 est l’absorbance du contrôle, A1 est l’absorbance du verbascoside ou du composé de référence, et A2 est l’absorbance du verbascoside ou du composé de référence sans salicylate de sodium. Tous les tests ont été conduits en triplicat.
2.5.4. Total Antioxidant Capacity (TAC)
Pour la détermination de la capacité antioxydante totale, l’essai de réduction du phosphomolybdène a été utilisé conformément au protocole de Prieto et al. À cette fin, 300 µL de différentes concentrations d’acide ascorbique ou de verbascoside ont été ajoutés à 3 mL d’un réactif constitué de molybdate d’ammonium 4 mM, de phosphate de sodium 28 mM et d’acide sulfurique 0,6 mM. Le mélange a été maintenu à 90 °C dans un bain-marie pendant 90 min ; il a ensuite été refroidi et l’absorbance a été mesurée à 695 nm sur le lecteur de plaque Asys UVM 340. Les résultats sont exprimés en équivalents d’acide ascorbique (µg/mL). Tous les tests ont été conduits en triplicat.
2.5.5. Cell Culture Antioxidant Capacity. Intracellular ROS Measurement
Afin de déterminer l’effet du verbascoside sur la concentration de ROS intracellulaires, et donc d’établir sa capacité antioxydante en culture cellulaire, l’essai au diacétate de 2,7-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA) a été réalisé. Cette molécule traverse la membrane cellulaire et est désacétylée à l’intérieur de la cellule, formant ainsi la 2,7-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH). La DCFH en présence de ROS est oxydée en 2,7-dichlorofluorescéine (DCF) et émet une fluorescence. Par conséquent, la fluorescence détectée dans le test est directement proportionnelle à la concentration intracellulaire de ROS.
Cet essai a été conduit pour analyser l’éventuel effet antioxydant du verbascoside dans deux situations : (a) en mesurant son effet direct sur des cellules croissant dans des conditions normales ; et (b) en préincubant les cellules avec différentes concentrations de verbascoside avant d’induire un stress oxydatif avec du peroxyde d’hydrogène, ce que nous désignerons comme l’effet protecteur.
Huit mille cellules par puits ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Les plaques ont été incubées pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2.
Pour l’étude de l’effet direct, après 24 h d’incubation, le milieu a été remplacé par 200 µL/puits de DCFH-DA 0,02 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après 30 min d’incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS, et différentes concentrations de verbascoside dissous dans le milieu de culture cellulaire correspondant supplémenté avec 1 % de FBS ont été ajoutées. La mesure de la fluorescence a été initiée une fois le verbascoside ajouté.
Pour l’effet protecteur, les cellules ont été prétraitées pendant 24 h avec différentes concentrations de verbascoside dissous dans le milieu de culture approprié à chaque lignée et supplémenté avec 1 % de sérum bovin fœtal. Ensuite, le milieu a été remplacé par du DCFH-DA 0,02 mM et les plaques ont été incubées pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, et le stress oxydatif a été induit avec H2O2 200 µM pour HepG2, et 500 µM pour SH-SY5Y dans le milieu de culture. La mesure de la fluorescence a été initiée une fois le H2O2 ajouté.
Les mesures de fluorescence ont été effectuées sur un lecteur de plaque Fluostar Optima (BMG Labtech) pendant 90 min à intervalles de 15 min, à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm. Les moyennes des mesures effectuées à chaque intervalle de temps ont été calculées pour chaque concentration. Les résultats ont été exprimés sous forme de fluorescence en fonction du temps, pour chaque traitement.
Tous les essais ont été conduits en triplicat.
2.6. Neuroprotective Capacity. In Vitro Enzymatic Inhibition Capacity
2.6.1. Tyrosinase Inhibition Assay
Afin de déterminer l’effet possible du verbascoside sur l’activité enzymatique, la production de dopachrome a été mesurée à 475 nm. La réaction a été réalisée sur une plaque à 96 puits. Dans chaque puits, 10 µL de verbascoside ont été ajoutés à différentes concentrations (ou de l’acide α-kojique, qui a été utilisé comme substance de référence, ou 10 µL de H2O pour le contrôle), avec 40 µL de L-DOPA 5 mM dans un tampon phosphate 63 mM pH 6,8, 80 µL de tampon phosphate 63 mM pH 6,8 et 40 µL de tyrosinase 200 U/mL. Tous les tests ont été conduits en triplicat.
L’absorbance a ensuite été mesurée toutes les 3 min pendant 15 min sur un lecteur de plaque Spectrostar Nano (BGM Labtech) à 37 °C. Les résultats sont exprimés comme le pourcentage d’inhibition de l’enzyme pour chaque concentration. Pour le calcul de l’activité inhibitrice, la pente du changement linéaire d’absorption mesuré pour les essais avec verbascoside a été comparée à la pente des contrôles blancs. L’IC50 (concentration qui inhibe 50 % de l’activité enzymatique) a été calculée pour chacun des deux composés.
2.6.2. MAO-A Inhibition Assay
Les essais ont été conduits sur une plaque à 96 puits comme décrit précédemment par. Dans chaque puits, 50 µL de verbascoside à différentes concentrations dissous dans du DMSO ; 50 µL de clorgyline, qui a été utilisée comme substance de référence ; ou 50 µL de DMSO comme contrôle ont été mélangés avec 50 µL de solution chromogène (0,8 mM d’acide vanillique, 0,417 mM de 4-aminoantipyrine, 4 U/mL de peroxydase dans un tampon phosphate de potassium 0,2 M pH 7,6), 100 µL de tyramine 3 mM dans un tampon phosphate de potassium 0,2 M pH 7,6, et 50 µL de MAO-A 8 U/mL dans un tampon phosphate de potassium 0,2 M pH 7,6. Tous les tests ont été conduits en triplicat.
L’absorbance a été mesurée toutes les 5 min pendant 40 min sur un lecteur de plaque Spectrostar Nano (BGM Labtech, Ortenberg, Allemagne) à 37 °C. Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition enzymatique pour chaque concentration de verbascoside ou de clorgyline. À cette fin, la pente du changement linéaire d’absorption mesuré pour les essais avec verbascoside ou clorgyline a été comparée à la pente des contrôles blancs. L’IC50 (concentration qui inhibe 50 % de l’activité enzymatique) a été calculée pour chacun des deux composés.
2.6.3. Acetylcholinesterase (AChE) Inhibition Assay
Afin d’étudier l’effet du verbascoside sur l’AChE, un essai colorimétrique a été conduit, dans lequel l’acétylthiocholine a été utilisée comme substrat de l’enzyme. Le groupe thiol de la thiocholine, produit à la suite de l’hydrolyse enzymatique de l’acétylthiocholine, réagit avec le DTNB (5-5 dithiobis-2-nitrobenzoate), produisant ainsi l’anion jaune acide 5-thio-2-nitrobenzoïque, quantifiable à 405 nm.
La réaction a été conduite sur des plaques à 96 puits. Chaque puits contenait 25 µL de verbascoside à différentes concentrations dissous dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 8 A, de la galantamine, qui a été utilisée comme contrôle positif, ou du tampon Tris-HCl 50 mM pH 8 comme contrôle ; 25 µL d’acétylthiocholine 15 mM (dans de l’eau milli-Q) ; 125 µL de DTNB (acide 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoïque)) 3 mM dans un tampon C (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,1 M et MgCl2 0,02 M) ; et 50 µL de tampon B (Tris-HCl 50 mM pH 8) avec 0,1 % de BSA (albumine sérique bovine).
Après 30 s, l’absorbance a été mesurée à 405 nm (T0), puis 25 µL d’acétylcholinestérase (0,22 U/mL dans le tampon A) ont été ajoutés. L’absorbance a été mesurée toutes les 90 s pendant un total de 15 min à 37 °C sur un lecteur de plaque Spectrostar Nano (BGM Labtech, Ortenberg, Allemagne). Tous les tests ont été conduits en triplicat.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition enzymatique pour chaque concentration de verbascoside ou de galantamine. À cette fin, la pente du changement linéaire d’absorption mesuré pour les essais avec verbascoside ou galantamine a été comparée à la pente des contrôles blancs. L’IC50 (concentration qui inhibe 50 % de l’activité enzymatique) a été calculée pour chacun des deux composés.
2.7. Statistical Analysis
Une ANOVA suivie de tests de comparaisons post-hoc de Bonferroni a été effectuée dans toutes les analyses statistiques, à l’aide du programme IBM SPSS Statistics 2.0. Les statistiques avec une valeur de p < 0,05 ont été considérées comme significatives et seront indiquées dans les figures par des lettres différentes. Cela signifie que les traitements qui ne partagent pas une lettre étaient significativement différents.
3. Results
3.1. Isolation and Identification of Compound 1
L’extrait éthanolique de feuilles d’Acanthus mollis a été fractionné avec des solvants de polarité différente. L’extrait d’acétate d’éthyle a été séparé par chromatographie sur colonne de gel de silice et a fourni le composé 1 sous forme d’aiguilles blanches après recristallisation avec MeOH. Ce composé a été caractérisé par des analyses spectroscopiques, comprenant RMN 1H, RMN 13C, RMN 2D (1H-1H COSY, HMBC), FAB-MS et UV, et a été identifié comme verbascoside par comparaison de ses caractéristiques spectrales avec les données disponibles dans la littérature.
3.2. In Vitro Antioxidant Activity
Les résultats de la capacité de piégeage in vitro du verbascoside et de l’acide ascorbique sont résumés dans le Tableau 1. L’essai de piégeage du radical DPPH• est largement utilisé pour tester préliminairement la capacité antioxydante d’un extrait végétal ou de composés isolés. Les substances qui montrent de bons résultats dans cet essai constituent une base fiable pour de futures études in vitro et in vivo. Le verbascoside a montré une grande capacité de piégeage du DPPH• (58,1 µM ± 0,6), avec de meilleures valeurs que celles de la substance de référence (284,9 µM ± 1,2). Des études précédentes ont rapporté des valeurs similaires de piégeage du DPPH• pour l’acide ascorbique (306,7 µM), tandis que d’autres ont estimé l’IC50 de l’acide gallique à 352,7 µM. Le verbascoside, doté d’une capacité supérieure à ces composés antioxydants de référence, a été signalé comme une molécule intéressante.
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Le phényléthanoïde étudié a été capable d’empêcher la réduction du NBT pendant l’essai xanthine/xanthine oxydase. Cet effet pourrait être dû à la capacité du verbascoside à capturer le radical O2•−, ou à sa capacité à inhiber l’enzyme xanthine oxydase, par laquelle elle produit une quantité plus faible de radical superoxyde. Afin de vérifier si l’actéoside peut inhiber cette enzyme, la production d’acide urique a été étudiée au cours du temps. Des concentrations comprises entre 2,08 et 83,3 µg/mL ont été analysées. Après tracé de l’absorbance au cours du temps pour chaque concentration, les pentes de la partie linéaire des graphiques obtenus ont été comparées à celles du contrôle (trois réplicats ont été réalisés dans chaque cas). Aucune différence n’a été trouvée dans aucun des cas. On peut donc conclure que ce composé, avec l’acide ascorbique, a été capable de capturer le radical O2•− avec une efficacité similaire, mais a été incapable d’inhiber l’enzyme xanthine oxydase. Cette capacité du verbascoside pourrait être expliquée par l’action des groupes hydroxyle libres.
Le radical superoxyde peut être transformé en espèces plus réactives, telles que le radical hydroxyle, et ce fait explique son implication dans de multiples processus physiopathologiques. Par conséquent, l’anion superoxyde est impliqué dans la formation d’autres ROS, qui peuvent induire des dommages oxydatifs aux lipides, aux protéines ou à l’ADN, déclenchant ainsi l’apparition et la progression de plusieurs maladies.
Le radical hydroxyle est connu pour être extrêmement nocif, car il peut initier l’auto-oxydation, la polymérisation et la fragmentation de nombreuses molécules biologiques. Ces radicaux sont les ROS les plus réactifs et causent des dommages aux macromolécules cellulaires essentielles, ce qui conduit à la mutagenèse, à la carcinogenèse ou simplement au vieillissement. En outre, le peroxyde d’hydrogène peut conduire à des radicaux hydroxyle, et donc son élimination est cruciale pour la défense antioxydante dans le système cellulaire. Les résultats obtenus pour ce radical ont montré que l’IC50 du verbascoside pour cette capacité de piégeage radicalaire est de 357 ± 16,8 µM, tandis que pour l’acide ascorbique elle est de 1031 ± 19,9 µM. La capacité de piégeage des radicaux hydroxyle semble être directement liée à la prévention de la peroxydation lipidique.
3.3. Total Antioxidant Capacity (TAC)
L’utilisation de différents tests pour évaluer l’activité antioxydante d’un composé ne conduit pas toujours à une interprétation facile. À cet égard, le concept d’un test reflétant la capacité antioxydante totale présente un intérêt. Les résultats concernant la TAC sont montrés dans la Figure 2.
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Il existe un intérêt croissant pour la recherche de composés antioxydants provenant de sources végétales afin de trouver des molécules pharmacologiquement puissantes avec peu ou pas d’effets secondaires. Les plantes produisent de nombreux composés pour prévenir le stress oxydatif, et ces métabolites secondaires présentent une source potentielle de substances d’intérêt pharmacologique, qui pourraient remplacer les antioxydants synthétiques. Étant donné que de nombreuses maladies, telles que celles mentionnées ci-dessus, sont associées à une surproduction de radicaux libres (ischémie cérébrale, inflammation, cancer, neurodégénérescence et vieillissement), les antioxydants capables de contrer le stress oxydatif suscitent un intérêt pour leur prévention et leur traitement. Ces composés deviennent également un centre d’intérêt populaire pour l’industrie alimentaire.
3.4. Cell Culture Antioxidant Capacity. Intracellular ROS Measurement
L’effet du verbascoside à différentes concentrations sur les niveaux intracellulaires de ROS a été évalué en culture de lignées cellulaires d’hépatocarcinome humain et de neuroblastome (Figure 3 et Figure 4). Après traitement des cellules avec ce composé, la fluorescence a été quantifiée, celle-ci étant proportionnelle aux niveaux de ROS dans la cellule. HepG2 a été établi comme modèle cellulaire in vivo, où l’effet d’un composé chimiopréventif potentiel peut être testé de manière fiable avec des variations minimales, tandis que SH-SY5Y est fréquemment utilisé comme modèle de cellule neuronale.
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L’effet du verbascoside sur des cellules croissant dans des conditions normales est montré dans la Figure 3. Ceci est considéré comme l’effet direct du phényléthanoïde. Dans les deux lignées cellulaires, après 90 min de traitement, ce composé a augmenté significativement la fluorescence par rapport au contrôle. Cependant, il existe des différences entre les deux lignées cellulaires. Concernant HepG2, une augmentation des niveaux de ROS par rapport au contrôle a été observée, qui était significativement plus élevée dans les cellules traitées avec la plus faible concentration de verbascoside, et moins évidente avec les concentrations plus élevées testées. Ces résultats concordent avec ceux rapportés par, qui ont observé une augmentation plus importante après traitement avec les concentrations les plus faibles de verbascoside testées dans les niveaux de ROS d’ovocytes d’agneau. En revanche, dans SH-SY5Y, l’effet, également dépendant de la dose, contraste avec les résultats précédents, puisque la fluorescence la plus élevée est détectée avec les niveaux les plus élevés de verbascoside.
Ces résultats soulignent qu’en culture cellulaire, après de courtes expositions et dans les conditions testées, le verbascoside a favorisé le stress oxydatif. Cet effet de stress cellulaire pourrait être dû à la dégradation du phényléthanoïde et à la génération subséquente de H2O2, comme cela a déjà été décrit pour l’oxydation d’autres composés phénoliques dans le milieu de culture.
L’effet cytotoxique des ROS a été largement documenté pour divers types de cellules, y compris les neurones, où il provoque la mort cellulaire dans les traumatismes cérébraux, l’ischémie et les maladies neurodégénératives. Cependant, les ROS peuvent également agir comme signaux moléculaires dans des processus physiologiques tels que la prolifération, la migration et la survie cellulaire. Alors que les effets délétères du stress oxydatif causé par les ROS sont très bien documentés, les conséquences bénéfiques de ces molécules sur les neurones du système nerveux central restent sous-estimées. À cet égard, les ROS peuvent agir comme neuroprotecteurs en activant des récepteurs tyrosine kinase impliqués dans la survie neuronale et leur différenciation, ainsi que dans la structure, la fonction et la plasticité synaptiques. En conséquence, l’effet neuroprotecteur de l’exercice modéré est partiellement dû à l’activation du métabolisme cellulaire associée à la production de ROS, qui modifie les signaux redox cérébraux. Par conséquent, cette légère augmentation des niveaux de ROS causée par le verbascoside pourrait impliquer des effets protecteurs pour les neurones et pour les hépatocytes, bien qu’une étude plus approfondie soit nécessaire avant de pouvoir tirer des conclusions.
Après 90 min d’induction du stress oxydatif avec du peroxyde d’hydrogène, une augmentation significative des niveaux intracellulaires de ROS a été observée (contrôle stressé (ligne rouge) versus contrôle non stressé (ligne jaune) dans les deux lignées cellulaires) (Figure 4). Les cellules prétraitées avec le verbascoside ont été capables de réduire significativement les niveaux de ROS par rapport au contrôle stressé, bien qu’elles n’aient pas réussi à les réduire aux valeurs du contrôle non stressé. Cet effet est plus prononcé dans la lignée cellulaire HepG2. Ces résultats concordent avec ceux de Chiaino et al., qui ont récemment décrit les propriétés neuroprotectrices d’un produit nutraceutique riche en verbascoside provenant d’Olea europaea L. et d’Hibiscus sabdaria L. contre les lésions médiées par le stress oxydatif dans le neuroblastome humain SH-SY5Y.
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Les phénols peuvent réguler l’expression des enzymes antioxydantes par l’activation de la protéine kinase C. Cette kinase catalyse la phosphorylation de Nrf2 et donc sa translocation vers le noyau, où cette molécule active l’expression des enzymes antioxydantes. Cependant, le verbascoside a été décrit comme un puissant inhibiteur de la protéine kinase C ; l’effet antioxydant de cette molécule ne devrait donc pas être lié à cette voie.
Le stress oxydatif, qui conduit à des niveaux élevés de ROS intracellulaires, est nocif pour les cellules. À cet égard, la capacité de piégeage des ROS du verbascoside contribue à l’inhibition de l’apoptose à la fois in vitro et in vivo. La capacité de cette molécule à piéger les radicaux libres pourrait également être liée à sa capacité chimiopréventive en culture cellulaire sous stress oxydatif, comme le montre cette étude. Des effets similaires ont été décrits par dans des fibroblastes après induction d’un stress oxydatif par des rayons UV. Les résultats obtenus ici soutiennent l’hypothèse de la consommation de phénols comme thérapie alternative, ou au moins complémentaire, pour la prévention et le traitement de maladies dégénératives telles que la maladie d’Alzheimer. L’effet du verbascoside sur la production de ROS révèle son potentiel non seulement pour prévenir des modifications redox cellulaires délétères, mais aussi pour promouvoir la neuroprotection.
Ces résultats suggèrent que l’activité neuroprotectrice du verbascoside est liée, au moins en partie, à sa capacité de piégeage des radicaux libres. Cette relation a déjà été démontrée pour d’autres activités du verbascoside, telles que sa capacité anti-inflammatoire ou protectrice contre les UV.
3.5. Neuroprotective Capacity. In Vitro Enzymatic Inhibition Capacity
3.5.1. Tyrosinase Inhibition Assay
Il s’agit d’un essai colorimétrique qui détermine la production de dopachrome due à l’activité de l’enzyme tyrosinase. L’acide α-kojique a été utilisé comme substance de référence ; la valeur d’IC50 pour cette enzyme était de 83,7 ± 4,5 µM.
La Figure 5 montre les résultats pour le verbascoside. Cette substance, loin d’inhiber l’enzyme tyrosinase, a provoqué une activation dose-dépendante, qui est significative bien que peu prononcée même aux concentrations les plus élevées. En raison de l’effet antibactérien et antifongique, le verbascoside isolé comme les extraits végétaux contenant de fortes concentrations de ce produit (Camellia sinensis (L.), Kuntze, ou Commiphora mukul (Hook. ex Stocks) Engl.) ont été proposés comme substances prometteuses pour le développement de traitements pharmacologiques contre l’acné. Nos résultats découragent cet usage en raison de la possibilité d’apparition de taches sur la peau, puisque la tyrosinase est impliquée dans la synthèse de la mélanine.
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3.5.2. MAO-A Inhibition Assay
La clorgyline a été utilisée comme inhibiteur sélectif de la MAO-A. La valeur d’IC50 pour cette substance, utilisée comme inhibiteur de référence, était de 0,122 ± 0,009 µM. L’effet inhibiteur du verbascoside est montré dans la Figure 6.
Le verbascoside montre une capacité inhibitrice significative et dose-dépendante de la MAO-A, avec une IC50 de 3,44 ± 0,06 µM. La MAO-A montre une forte sélectivité pour le neurotransmetteur sérotonine, et par conséquent les inhibiteurs de cette enzyme prolongent l’action de ce neurotransmetteur et sont utiles dans le traitement de la dépression et de l’anxiété.
Bien que la MAO-B soit l’isoforme utilisée pour le traitement de la maladie de Parkinson, la plupart de ces patients présentent des signes de dépression, et les inhibiteurs de la MAO-A sont donc également bénéfiques pour ces symptômes. En outre, les inhibiteurs de la MAO-A produisent des bénéfices symptomatiques en réduisant l’oxydation de la dopamine catalysée par cette enzyme. Bien qu’il existe une concentration plus élevée de MAO-B dans les ganglions de la base, les inhibiteurs de l’isoforme A augmentent la concentration de dopamine à ce niveau. Par conséquent, l’inhibition des deux isoformes MAO-A et B est plus efficace pour préserver les niveaux de dopamine dans les ganglions de la base que l’inhibition sélective. Le stress oxydatif dans le cerveau peut être décisif dans l’initiation et la progression de la neurodégénérescence. La capacité du verbascoside à inhiber la MAO-A et à piéger les radicaux libres pourrait contribuer de manière majeure à l’abaissement de ce stress.
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3.5.3. Acetylcholinesterase (AChE) Inhibition Assay
La galantamine est un inhibiteur bien connu de l’AChE dont l’IC50 a été estimée à 4,09 ± 0,18 µM. L’effet du verbascoside sur l’activité de cette enzyme a montré des résultats moins linéaires que les deux autres enzymes analysées (Figure 7). L’effet inhibiteur de ce composé n’a pas atteint des niveaux de 50 % à la concentration testée la plus élevée. Plusieurs études conduites avec des extraits végétaux contenant du verbascoside ont montré une puissante inhibition de cette enzyme. Cependant, les résultats obtenus dans cette étude ne concordaient pas avec ces résultats. En ce sens, les résultats provenant d’extraits complexes où différents composés pourraient agir en synergie avec le verbascoside dans l’inhibition de l’AChE ne pouvaient pas être comparés à ceux de l’actéoside isolé. Malgré cela, le verbascoside peut produire une inhibition significative de l’enzyme dès les concentrations les plus faibles testées, et il pourrait donc s’avérer intéressant comme agent thérapeutique dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Selon l’hypothèse cholinergique, la perte de mémoire chez les patients atteints de démence sénile ou d’Alzheimer est due à une déficience de la fonction cholinergique cérébrale. L’utilisation de cholinomimétiques et d’inhibiteurs de l’AChE constitue les principales stratégies thérapeutiques.
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4. Conclusions
Le verbascoside est une molécule dotée d’un potentiel thérapeutique dans la prévention et le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier par sa capacité à inhiber la MAO-A et ainsi à diminuer la dégradation des neurotransmetteurs monoaminergiques. Cette capacité, avec son aptitude à capturer les radicaux libres et à diminuer le stress oxydatif induit dans les cellules neuronales, démontre l’intérêt de ce composé dans le domaine thérapeutique et justifie de futures études visant à mieux comprendre son mécanisme d’action.