Potentiel anti-néphrotoxique in vitro d’Ammi visnaga, Petroselinum crispum, Hordeum vulgare et Cymbopogon schoenanthus : extraits de graines ou de feuilles supprimant les médiateurs nécrotiques, le stress oxydant et l’inflammation
Référence : BMC Complementary and Alternative Medicine 2019. — PMID 31238921 · DOI 10.1186/s12906-019-2559-8 Type : étude in vitro · Plante : Ammi visnage · Propriété → Voies urinaires Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Contexte Le rein est un organe essentiel dont le corps a besoin pour accomplir plusieurs fonctions importantes. La néphrotoxicité est l’une des complications rénales les plus répandues, résultant de l’exposition à un agent toxique extrinsèque ou intrinsèque, ce qui accroît le besoin d’acquérir des remèdes appropriés. Récemment, les remèdes naturels gagnent une grande attention en raison du fait qu’ils ont moins d’effets secondaires que la plupart des médicaments conventionnels.
Méthodes La présente étude a consigné un nouveau rôle thérapeutique des plantes médicinales bien connues pour les calculs rénaux [Ammi visnaga (AVE), Petroselinum crispum (PCE), Hordeum vulgare (HVE) et Cymbopogon schoenanthus (CSE)]. Ainsi, les extraits aqueux de ces plantes ont été examinés contre la toxicité induite par le CCl₄ dans des cellules rénales de mammifère (cellules Vero).
Résultats Ces extraits ont montré la présence de quantités variables de composés phénoliques et triterpénoïdes, ainsi que de vitamine C. En raison du potentiel antioxydant de ces constituants, les extraits ont supprimé significativement (p < 0,05) le stress oxydant induit par le CCl₄ en piégeant les espèces réactives de l’oxygène et en renforçant les indices antioxydants cellulaires. De plus, ces extraits ont significativement (p < 0,05) réduit l’inflammation induite par le CCl₄ en inhibant l’expression génique de NF-κB, de l’iNOS et, de ce fait, le taux d’oxyde nitrique. Par conséquent, l’aspect morphologique des cellules Vero, la nécrose cellulaire et l’expression génique de la molécule-1 de lésion rénale (kidney injury molecule-1, un marqueur de lésion rénale) après ces traitements ont été améliorés. L’AVE a amélioré le stress oxydant et inflammatoire induit par le CCl₄ dans les cellules Vero et a montré un effet plus puissant que le médicament alpha-cétoanalogue couramment utilisé (kétostéril) dans la plupart des tests étudiés.
Conclusion Ainsi, les extraits de plantes étudiés, en particulier l’AVE, peuvent être considérés comme des extraits prometteurs dans la prise en charge de la néphrotoxicité et d’autres maladies chroniques associées au stress oxydant et à l’inflammation. Résumé graphique [ ]
1. Contexte
Le rein est un organe essentiel dont le corps a besoin pour accomplir plusieurs fonctions importantes, notamment le maintien de l’homéostasie, la détoxification et l’excrétion des métabolites toxiques et des médicaments. L’exposition constante aux médicaments ou aux réactifs chimiques expose les reins à la néphrotoxicité, qui est l’un des problèmes rénaux les plus courants. L’aspirine (analgésique), la fluoxétine (antidépresseur), la diphénhydramine (antihistaminique) et l’adéfovir (antirétroviral) peuvent provoquer une néphrotoxicité. De même, certains hydrocarbures halogénés comme le tétrachlorure de carbone (CCl₄), couramment utilisé dans la synthèse des chlorofluorocarbures, les anthelminthiques et les fumigants pour céréales, peuvent induire une néphrotoxicité. Ce type de toxicité est associé à une hémodynamique intraglomérulaire altérée, à une toxicité des cellules tubulaires, à une inflammation, à une néphropathie cristalline, à une rhabdomyolyse et à une microangiopathie thrombotique. Tous ces effets dommageables conduisent à une rétention de sodium et d’eau, à une hyperkaliémie, à une acidose métabolique, à une glomérulonéphrite et à une réduction du débit de filtration glomérulaire. Les traitements disponibles pour les patients atteints de néphrotoxicité reposent sur l’utilisation de médicaments synthétiques qui provoquent de nombreux effets secondaires. De plus, la restriction protéique prolongée avec l’utilisation de médicaments alpha-cétoanalogues tels que le kétostéril (Ks) doit être suivie. Ces médicaments pourraient améliorer les carences nutritionnelles causées par les régimes à restriction protéique grâce à la capacité de leurs composants à se convertir dans le corps en acides aminés essentiels. En outre, les alpha-cétoanalogues retardent l’initiation de la dialyse chez les patients néphropathiques chroniques en raison de leur capacité efficace à réduire les taux sanguins d’urée et d’ammoniac. Cependant, ces médicaments agissent uniquement comme compléments alimentaires et sont incapables de préserver la fonction rénale. Par conséquent, les professionnels de santé recherchent continuellement des thérapies alternatives telles que les remèdes à base de plantes en raison de leur efficacité, de leur disponibilité et de leurs moindres effets secondaires.
Les plantes ethnomédicinales présentent de nombreux avantages par rapport aux médicaments sur ordonnance ou à la médecine traditionnelle. Elles sont capables de synthétiser des milliers de constituants bioactifs divers, notamment des alcaloïdes, des terpénoïdes, des caroténoïdes, des isoprénoïdes, des flavonoïdes, des acides phénoliques, des phytoœstrogènes, etc. Ces molécules peuvent fonctionner comme agents antioxydants, anticancérigènes, hypoglycémiants et anti-inflammatoires, faisant des plantes médicinales de bons candidats pour le traitement de plusieurs maladies, dont les atteintes rénales. Ammi visnaga (AV), Petroselinum crispum (PC), Hordeum vulgare (HV) et Cymbopogon schoenanthus (CS) ont suscité une attention significative dans le traitement de plusieurs calculs rénaux et d’autres troubles. L’AV est une espèce de plante à fleurs de la famille de la carotte, reconnue sous de nombreux noms communs, notamment bisnaga, herbe aux cure-dents et khella. L’Europe, l’Asie et l’Afrique du Nord sont ses habitats natifs. Les anciens Égyptiens l’utilisaient comme médecine à base de plantes pour la colique néphrétique, et l’un de ses composants (la khelline) était utilisé comme relaxant du muscle lisse et possède des effets pléiotropes sur la lithiase urinaire. Le PC (persil) appartient à la famille des Umbelliferae et il est largement répandu en Asie occidentale, en Méditerranée et dans plusieurs pays européens. Diverses activités pharmacologiques, telles que des actions antioxydante, anti-inflammatoire, diurétique, néphroprotectrice, anti-lithiase urinaire, anticancéreuse, modulatrice d’enzymes et antihypertensive, ont été rapportées pour cette plante. Le HV appartient à la famille des Gramineae ou Poaceae et il est localement connu sous le nom d’« orge » ou « jav ». Il possède plusieurs activités médicinales telles que le traitement des calculs urinaires ainsi que du diabète et de l’hyperlipidémie. Le CS est une espèce désertique qui pousse dans les endroits pierreux et secs, et il est communément connu sous le nom de citronnelle (lemongrass), herbe à chameau, sakhbar, izkhir ou athkhar. Cette plante est bien connue dans la médecine populaire égyptienne pour ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, détoxifiantes, antispasmodiques, anti-rhumatismales, anti-anorexiques et chimioprotectrices. La prise orale de son extrait aqueux est utilisée comme remède diurétique puissant contre les calculs rénaux dans le Sahara aride d’Afrique du Nord.
Sur la base de l’efficacité bien connue de l’AV, du PC, du HV et du CS contre différents calculs rénaux, la présente étude a examiné pour la première fois l’efficacité de leurs extraits aqueux contre la néphrotoxicité induite par le CCl₄. En outre, cette étude a comparé l’efficacité de ces extraits avec le médicament actuellement utilisé pour les patients néphropathiques (Ks) afin d’évaluer leur degré de puissance. Ici, nous avons utilisé des cellules Vero (cellules rénales de singe vert d’Afrique) comme modèle in vitro pour l’étude. Ceci parce qu’il est désormais devenu crucial et courant d’utiliser les cultures cellulaires pour soutenir la recherche avant les études sur les animaux et les essais cliniques sur l’homme. Les rôles anti-néphrotoxiques de ces extraits ont été évalués en étudiant leurs effets suppresseurs sur le stress oxydant et l’inflammation (médiateurs nécrotiques) induits par le CCl₄. Pour expliquer ces activités probables, les composés phytochimiques et les capacités antioxydantes des extraits ont été examinés.
2. Méthodes
Produits chimiques
Le réactif de Folin-Ciocalteu, l’acide 4-hydroxycinnamique (4-HCA), la catéchine, la quercétine (QR), l’acide ursolique (UA), l’hydroxytoluène butylé (BHT), l’acide 2,2-azino-bis(3-éthylbenzthiazoline-6-sulfonique) (ABTS), l’α,α-diphényl-β-picrylhydrazyle (DPPH), le CCl₄, la sonde diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescine (DCFH-DA), le bromure d’éthidium (EB), l’acridine orange (AO), l’acide thiobarbiturique (TBA), le glutathion réduit (GSH), l’iodure de propidium (PI), le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) et le tétraméthoxypropane (TMP) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). Le médicament Ks a été fabriqué par la société Fresenius Kabi (Hambourg, Allemagne), où un comprimé pelliculé contient l’α-cétoanalogue de l’isoleucine, de la leucine, de la phénylalanine, de la valine, de la méthionine avec d’autres acides aminés dont la L-lysine, la L-thréonine, le L-tryptophane, la L-histidine et la L-tyrosine. Le milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), le sérum de veau fœtal (FBS) et la trypsine ont été obtenus chez Lonza, États-Unis. Le kit de purification d’ARN Gene JET, le kit de synthèse d’ADNc et le kit de master mix 2X SYBR green ont été fournis par ThermoScientific, États-Unis. Les amorces pour le facteur nucléaire-kappa (NF-κ) B et l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) ont été achetées chez Bioneer, Corée. Les autres produits chimiques ont été obtenus avec un haut degré de pureté.
Matériel végétal et extraction
Les graines d’AV (NCBI:txid1053409), de PC (NCBI:txid4043) et de HV (NCBI:txid4513), et les feuilles de CS (NCBI:txid79841) ont été obtenues sur le marché local en Égypte sous forme séchée. En Égypte, ces plantes sont disponibles dans les supermarchés et dans les magasins d’herboristerie. Des experts sont présents dans ces magasins pour l’identification et l’authentification des plantes. Chaque type de plante a été broyé individuellement pour obtenir la forme en poudre, qui a été passée à travers un tamis de 20 mesh avec une taille de particule de 0,9 mm. Ensuite, 50 g de chaque poudre de plante ont été extraits deux fois par macération dans 500 mL d’eau distillée autoclavée pendant 72 h à 25 °C sous agitation continue. Enfin, l’extrait a été filtré et lyophilisé (Telstar, Terrassa, Espagne) pour obtenir la forme en poudre (AVE, PCE, HVE et CSE, respectivement).
Teneur phytochimique et analyse HPLC des composés phénoliques
Les polyphénols, y compris les flavonoïdes (flavonols et anthocyanes), les tanins et les triterpénoïdes, ont été quantifiés dans les quatre extraits de plantes étudiés. Les polyphénols totaux (en équivalents HCA) ont été déterminés à l’aide de la méthode de Folin-Ciocalteu. La teneur en flavonoïdes a été évaluée par spectrophotométrie à l’aide de solutions d’AlCl₃ à 10 % et de nitrite de sodium à 5 %, et la concentration a été calculée à l’aide d’une courbe d’étalonnage à la catéchine. Les flavonols totaux ont été quantifiés à l’aide de solutions d’acétate de sodium à 50 g/l et d’AlCl₃ à 2 % ; l’absorbance a été enregistrée à 440 nm et la concentration en flavonols totaux a été calculée via une courbe d’étalonnage à la QR. Les anthocyanes ont été déterminés par le test pH-différentiel reposant sur la sensibilité de ces pigments au changement de pH ; l’absorbance de l’extrait (Aₑ) dans deux solutions tampons (pH 1,0 et pH 4,5) a été lue à 510 et 700 nm et calculée à l’aide de l’équation : [Aₑ = (A₅₁₀ − A₇₀₀) pH 1,0 − (A₅₁₀ − A₇₀₀) pH 4,5] ; la concentration en anthocyanes en équivalent cyanidine-3-glucoside (Cy-3-glc) a été quantifiée à l’aide de l’équation : [pigment anthocyanique = (Aₑ × PM × FD × 1000)/(ε × poids de l’extrait)]. Les abréviations PM et ε désignent respectivement le poids moléculaire et l’absorptivité molaire de la Cy-3-glc, tandis que FD est le facteur de dilution de l’extrait. Les tanins totaux ont été déterminés par colorimétrie à l’aide d’une courbe standard à la catéchine. La teneur en triterpénoïdes dans chaque extrait a été quantifiée à l’aide de la réaction colorée à la vanilline et d’une courbe standard à l’UA.
Pour l’analyse HPLC, 20 μl de chaque extrait (AVE, PCE, HVE ou CSE) ont été séparés sur une colonne Zorbax Eclipse plus C18 (100 mm × 4,6 mm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, États-Unis). La séparation a été réalisée à 284 nm à l’aide d’acétonitrile, de H₃PO₄ à 0,2 % et de méthanol par gradient d’élution linéaire ternaire. Dans les mêmes conditions chromatographiques, des étalons phénoliques purs ont été passés pour faire correspondre les temps de rétention.
Teneur en vitamine C
La concentration en vitamine C a été quantifiée dans chaque extrait à l’aide de la 2,4-dinitrophénylhydrazine (2,4-DNPH) et de vitamine standard. Chaque extrait a été déprotéinisé puis incubé avec un mélange de 2,4-DNPH (3 %), de CuSO₄ (0,05 %), de thiourée (0,4 %) et de H₂SO₄ (65 %) pendant 1,5 h à 37 °C. À la fin de la période d’incubation, du H₂SO₄ a été ajouté et l’absorbance de la solution colorée a été lue à 520 nm après 30 min.
Activités antioxydantes
La capacité antioxydante totale (TAC) et les potentiels antiradicalaires (anti-ABTS⁺, DPPH et radicaux NO) des extraits étudiés (AVE, PCE, HVE et CSE) ont été utilisés pour évaluer leurs effets antioxydants. L’évaluation de l’effet antiradicalaire de chaque extrait a été réalisée à l’aide de la valeur IC₅₀ (concentration inhibitrice à 50 %).
Un mélange de molybdate d’ammonium 4 mM, de phosphate de sodium 28 mM et de H₂SO₄ 0,6 M a été utilisé pour déterminer la TAC des extraits étudiés. Le produit coloré issu de la réduction du phosphomolybdate par chaque extrait à 95 °C (90 min) a été mesuré à 695 nm en utilisant le BHT comme antioxydant standard.
La capacité des extraits à réduire le radical ABTS⁺ en ABTS peut être indiquée par la décoloration de la couleur bleu-vert du radical à l’aide de la méthode de décoloration du cation radical ABTS⁺. Le radical ABTS⁺ a été préparé en incubant de l’ABTS 7 mM avec du persulfate de potassium 140 mM à l’obscurité pendant 16 h à 25 °C avant de le mélanger à chaque extrait ou à l’antioxydant standard (BHT). L’absorbance de la couleur bleue restante a été mesurée à 734 nm pour calculer le pourcentage d’inhibition du radical ABTS⁺. De même, la capacité de piégeage du DPPH des extraits étudiés a été déterminée en lisant l’absorbance du radical non piégé à 490 nm. La réaction de Griess utilisant le réactif de Griess (dichlorhydrate de naphtyléthylènediamine à 0,1 %, sulfanilamide à 1 % et acide phosphorique à 2 %) et le nitroprussiate de sodium a évalué l’activité de piégeage du NO des extraits ; la réaction a donné un colorant azoïque coloré (rouge-violet vif), dont l’absorbance a été mesurée à 490 nm.
Culture de cellules rénales et test de cytotoxicité
Les cellules épithéliales rénales de singe vert d’Afrique (Cercopithecus aethiops) (Vero, American Type Culture Collection « ATCC », CCL-81, États-Unis) ont été maintenues dans du DMEM contenant 5 % de FBS. Après ensemencement de 6000 cellules par puits de plaques de culture cellulaire à 96 puits et adhésion des cellules pendant 24 h, des concentrations sériées (2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/mL) de chaque extrait ont été ajoutées. Puis les plaques ont été incubées pendant 72 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂. La cytotoxicité de chaque extrait étudié a été détectée à l’aide du test MTT en ajoutant 20 μl de MTT (5 mg/mL) à chaque puits, suivi d’une incubation des plaques pendant 3 h. Après retrait du MTT, 100 μl de DMSO ont été ajoutés et l’absorbance a été mesurée avec un lecteur de microplaques (BMG LabTech, Allemagne) à 570 nm. Les concentrations correspondant à 50 et 100 % de viabilité cellulaire (respectivement IC₅₀ et EC₁₀₀) ont été déterminées par le logiciel GraphPad Instat.
Développement du modèle in vitro de néphrotoxicité et détermination de la dose efficace anti-néphrotoxicité de chaque extrait étudié
Après 24 h d’ensemencement des cellules rénales dans des plaques de culture cellulaire à 96 puits, elles ont été exposées à 0,13 mM de CCl₄ pendant 72 h pour induire la néphrotoxicité selon la méthode d’Abu-Serie et Habashy. Les cellules rénales endommagées ont été traitées avec différentes concentrations des extraits testés puis incubées à 37 °C pendant 72 h dans un incubateur à 5 % de CO₂. Le pourcentage de viabilité cellulaire dans les cellules endommagées non traitées et traitées, en comparaison avec les cellules saines, a été déterminé par le test MTT comme décrit ci-dessus. La dose efficace de chaque extrait, qui a atténué de 100 % les dommages dans les cellules rénales (ED₁₀₀), a été calculée à l’aide du logiciel GraphPad Instat. La dose efficace de chaque extrait testé et du Ks a été utilisée pour la détection des cellules rénales nécrotiques, des paramètres de stress oxydant et de l’expression génique. De plus, les changements morphologiques avant et après traitement des cellules rénales endommagées ont été étudiés à l’aide d’un microscope à contraste de phase (Olympus, Japon).
Détection des cellules rénales nécrotiques
Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits et traitées avec du CCl₄ pour l’induction de la néphrotoxicité, puis incubées dans un incubateur à 5 % de CO₂ (37 °C) avec la valeur ED₁₀₀ pour chacun des AVE, PCE, HVE, CSE ou Ks pendant 72 h. Ensuite, les cellules ont été colorées avec des doubles colorants nucléaires pour la détection des populations de cellules rénales nécrotiques à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’une cytométrie en flux. Des cellules normales non traitées (témoin négatif) et des cellules traitées au CCl₄ (témoin positif) sans traitements supplémentaires ont été incluses dans les deux tests.
Les cellules de la microplaque ont été colorées avec 100 μg/mL des colorants EB et AO, puis observées sous le microscope à contraste de phase fluorescent (Olympus, Japon). De plus, les cellules d’autres plaques ont été trypsinisées et incubées pendant 15 min avec l’annexine V/PI ; ensuite, les cellules ont été fixées et incubées pendant 15 min avec la streptavidine-fluorescéine (5 μg/mL). La cytométrie en flux (Partec, Allemagne) a été utilisée pour la quantification de la population de cellules nécrotiques colorées au PI à l’aide du détecteur de signal d’émission de la phycoérythrine (FL2) contre le détecteur de signal d’émission de l’annexine-FITC (FL1).
Évaluation des paramètres du stress oxydant
Détermination du taux intracellulaire de ROS
La sonde fluorescente extrêmement sensible DCFH-DA a été utilisée pour l’évaluation du taux de ROS. Les cellules rénales ont été préchargées pendant 30 min avec du DCFH-DA (5 μM) à 37 °C. Puis les molécules fluorescentes DCF ont été libérées après que l’oxydation par les ROS des estérases cellulaires a clivé le produit non fluorescent (H₂DCF) du DCFH-DA. L’intensité de fluorescence a été déterminée par la cytométrie en flux aux longueurs d’onde de 488 nm (excitation) et de 530 nm (émission).
Test de peroxydation lipidique
La quantité de peroxydation lipidique a été déterminée à l’aide de la méthode colorimétrique des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS). La méthode repose sur la réaction du malondialdéhyde (le produit de décomposition des peroxydes lipidiques) avec le TBA (0,67 %) dans un bain-marie bouillant. Le chromophore produit a été lu à 532 nm et la concentration de la peroxydation lipidique a été calculée à l’aide de la courbe d’étalonnage de l’étalon TMP.
Indices antioxydants et taux de protéines totales
Les indices antioxydants, y compris les taux de GSH ainsi que les activités de la superoxyde dismutase (SOD) et de la glutathion peroxydase (GPX), ont été déterminés. Le réactif d’Ellman (acide 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoïque) a été utilisé pour la détermination de la teneur en GSH. L’absorbance du produit de couleur jaune produit a été lue à 412 nm. L’activité de la Cu/Zn SOD a été déterminée par la méthode de l’auto-oxydation du pyrogallol. Le changement d’absorbance pendant 2 min a été enregistré à 420 nm. L’unité d’activité est décrite par la quantité d’enzyme qui supprime 50 % du taux d’auto-oxydation du pyrogallol (20 mM) dans les conditions standard. L’activité de la GPX a été évaluée par colorimétrie selon la méthode de Rotruck, en utilisant l’hydroperoxyde de cumène et le GSH comme substrats enzymatiques. La teneur en protéines a été évaluée à l’aide du test au bleu brillant de Coomassie de Bradford. Le complexe de couleur bleue obtenu a été lu à 630 nm et la concentration en protéines a été calculée à partir de la courbe standard de l’albumine sérique bovine.
Détermination des médiateurs inflammatoires et de la molécule-1 de lésion rénale (KIM-1)
Après 72 h de traitement des cellules avec l’AVE, le PCE, le HVE et le CSE, les cellules ont été centrifugées et le surnageant a été collecté et utilisé pour la détermination colorimétrique du NO par le nitrite à l’aide de la réaction de Griess. Tandis que les cellules ont été utilisées pour l’extraction d’ARN et la quantification de NF-κB, de l’iNOS et de KIM-1.
L’ARN total a été extrait des cellules non traitées et traitées au CCl₄, traitées à l’extrait et traitées au Ks à l’aide du kit de purification d’ARN Gene JET en suivant le protocole du fabricant. La concentration et la pureté des ARN obtenus ont été mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Chaque échantillon d’ARN a été utilisé dans la préparation d’ADNc par transcription inverse-réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR, Qiagen, Allemagne) via le kit de synthèse d’ADNc. Les taux d’expression génique de la β-actine (gène de référence) et des gènes cibles ont été mesurés par RT-PCR à l’aide des amorces spécifiques du gène (sens et antisens). Les amorces suivantes ont été utilisées : NF-κB, sens 5′-ATGGCTTCTATGAGGCTGAG-3, antisens : 5′-GTTGTTGTTGGTCTGGATGC-3′ ; iNOS, sens : 5′-GTTCTCAAGGCACAGGTCTC-3′, antisens : 5′-GCAGGTCACTTATGTCACTTATC-3′ ; KIM-1, sens : 5′-TGGCACTGTGACATCCTCAGA-3′ ; antisens : 5′-GCAACGGACATGCCAACATA-3′ et β-actine, sens : 5′-AAGCAGGAGTATGACGAGTCCG-3′, antisens : 5′-GCCTTCATACATCTCAAGTTGG-3′.
Le mélange réactionnel contenait 50 ng de matrice d’ADNc, 12,5 μL d’un master mix 2X SYBR green, 0,3 μL d’amorce sens 10 μM, 0,3 μL d’amorce antisens 10 μM, et le volume a été complété à 25 μL avec de l’eau exempte de nucléases. Le programme de qPCR a été appliqué comme suit : activation de l’enzyme (un cycle à 95 °C pendant 15 min) suivie de 40 cycles de dénaturation (95 °C pendant 15 s), d’hybridation (60 °C pendant 1 min) et d’extension (72 °C pendant 30 s). L’expression des gènes cibles a été calculée à l’aide de la méthode comparative du Ct (le nombre de cycle seuil au point de croisement entre le seuil et le tracé d’amplification). Les valeurs CT des gènes cibles ont été normalisées par rapport à celle de la β-actine selon les instructions du fabricant.
Analyse statistique
Les données sont exprimées en moyenne ± SE et les valeurs significatives ont été considérées à p < 0,05. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) par le test de Duncan a été utilisée pour évaluer la différence entre les valeurs moyennes des traitements étudiés. L’analyse a été réalisée pour trois mesures à l’aide du logiciel SPSS version 16. Les valeurs EC₁₀₀, IC₅₀ et ED₁₀₀ ont été calculées par le logiciel GraphPad Instat version 3. Les graphiques en carte thermique (heat map) ont été générés par l’outil web ClustVis (https://biit.cs.ut.ee/clustvis/).
3. Résultats
Caractérisation des extraits étudiés
Le rendement d’extraction de chacun des extraits étudiés est présenté dans le Tableau 1, où la valeur la plus basse a été détectée pour l’AVE. Le Tableau 1 a également élucidé la composition chimique des extraits, et les résultats ont montré que chacun contient des quantités considérables de composés phénoliques, de flavonoïdes, d’anthocyanes, de flavonols, de tanins, de triterpénoïdes et de vitamine C. Comme le montre le Tableau, l’AVE contient une quantité significativement (p < 0,05) élevée de composés phénoliques (flavonoïdes, flavonols et tanins), tandis que la teneur en triterpénoïdes du PCE était significativement (p < 0,05) élevée. Alors que le CSE contient une teneur en vitamine C significativement (p < 0,05) élevée. L’analyse HPLC a identifié différents composés phénoliques dans les extraits étudiés en comparant leur temps de rétention spécifique avec celui d’étalons phénoliques connus (Tableau 1). Ainsi, treize composés phénoliques ont été détectés dans chacun des AVE et CSE (respectivement Fig. 1a et d), onze dans le PCE (Fig. 1b) et six dans le HVE (Fig. 1c). [ ] [ ]
Activités antioxydantes des extraits étudiés
Les résultats des activités antioxydantes des extraits étudiés sont présentés dans le Tableau 1 et la Fig. 2, qui révèlent une variété dans les activités antioxydantes parmi les extraits. Les données de TAC (Fig. 2b) montrent que l’AVE possède la capacité la plus forte, suivie du HVE puis du CPE et du PCE. Le Ks a présenté une capacité antioxydante similaire en puissance à celle du HVE, mais inférieure à celle de l’AVE. Le criblage antiradicalaire des extraits testés a montré que la capacité à piéger le DPPH par l’AVE et le PCE était la plus élevée, avec une puissance égale à celle du BHT. Tandis que le HVE et le CSE ont présenté l’activité de piégeage la plus faible, mais l’activité de piégeage du DPPH de tous les extraits étudiés est restée significativement (p < 0,05) plus puissante que celle du Ks (Fig. 2c). Concernant la capacité de piégeage de l’ABTS, tous les extraits étudiés étaient significativement (p < 0,05) moins puissants que le Ks, le CSE ayant la capacité de piégeage la plus élevée, lui permettant de devenir aussi puissant que le BHT (Fig. 2d). Concernant la capacité de piégeage du NO, le Ks était inférieur à celui de tous les extraits étudiés et du BHT ; d’autre part, seuls le PCE et le HVE avaient la même efficacité que le BHT (Fig. 2e). [ ]
Viabilité des cellules Vero et effet cytotoxique des extraits étudiés
Les résultats du Tableau 2 révèlent que les extraits étudiés variaient dans leur innocuité sur les cellules Vero, mais sont plus sûrs que le Ks ; l’ordre de leur innocuité du plus élevé au plus bas est HVE > PCE > CSE > AVE. Le Tableau présente également les valeurs IC₅₀ et ED₁₀₀ des extraits étudiés, qui démontrent la plus grande puissance de l’AVE et la plus faible efficacité du Ks. [ ]
Induction de la néphrotoxicité par le CCl₄ et effets améliorateurs des extraits étudiés
Les résultats de la présente étude ont révélé que le CCl₄ induisait une nécrose et une lésion dans les cellules Vero en perturbant l’état redox cellulaire (stress oxydant) et en induisant une inflammation. Les traitements avec les quatre extraits de plantes étudiés (AVE, PCE, HVE et CSE) ont amélioré ces perturbations avec des puissances différentes, leur effet étant comparé au Ks.
Amélioration du stress oxydant induit par le CCl₄ par les extraits étudiés
L’exposition des cellules Vero au CCl₄ a entraîné une élévation des taux de ROS (467,62 %) et de peroxydation lipidique (TBARS, 70,18 %). Ceci s’est accompagné d’une déplétion du taux de GSH (6,55 %) ainsi que des activités de la SOD (41,08 %) et de la GPX (30,51 %). Ces résultats indiquent l’induction de l’état de stress oxydant dans les cellules Vero par le toxique CCl₄. Chacun des traitements par les quatre extraits étudiés a été capable d’atténuer cet effet dommageable et de préserver efficacement l’équilibre entre les ROS et le système redox dans les cellules Vero (Fig. 3). D’après la Fig. 3a, b, l’ordre de diminution de l’émission de DCF peut être décrit comme suit : AVE (59,67 %) > PCE (54,16 %) > CSE (32,66 %) > HVE (23,50 %). L’efficacité de ces extraits était significativement (p < 0,05) supérieure à celle du Ks (14,23 %), qui avait la valeur d’émission de DCF la plus élevée. La diminution du taux de ROS a été associée à une diminution du taux de TBARS (Fig. 3c), qui a été considérablement diminué après le traitement à l’AVE (65,53 %) plus que les autres extraits (11,28-21,48 %). Se référant à la puissance du Ks dans la diminution du taux de TBARS (31,89 %), il s’est révélé moins puissant que l’AVE, mais supérieur aux autres extraits. La déplétion des taux de ROS et de TBARS par les extraits étudiés a eu un grand impact sur les taux des indices antioxydants. Ainsi, le taux de GSH (Fig. 3d) et les activités des enzymes antioxydantes (Fig. 3e) ont été rétablis après les traitements aux extraits, avec les effets les plus élevés appartenant à l’AVE. Les élévations du taux de GSH correspondant aux différents traitements sont les suivantes : 157,43 % (AVE), 85,80 % (CSE), 69,53 % (HVE) et 11,72 % (PCE). En comparaison avec la puissance du Ks à stimuler le taux de GSH (147,21 %), l’AVE avait la même puissance, mais les autres extraits testés avaient une puissance moindre. [ ]
Concernant les activités des enzymes antioxydantes, l’AVE s’est révélé être l’extrait étudié le plus puissant pour restaurer les activités de la SOD et de la GPX (105,99 et 129,17 %, respectivement), avec une puissance extrêmement supérieure à celle du Ks (2,45 et 52,24 %, respectivement). De même, le traitement au PCE a été capable de réguler à la hausse les activités de ces enzymes de 65,11 et 115,06 %, respectivement, tandis que le HVE ne les a élevées que de 32,63 et 31,41 %, respectivement, et le CSE de 34,54 et 15,06 %, respectivement.
Réduction des médiateurs inflammatoires induits par le CCl₄ par les extraits étudiés
Les graphiques A à C de la Fig. 4 montrent que l’incubation des cellules Vero avec le CCl₄ pendant 72 h a induit une inflammation par l’élévation de l’expression génique des médiateurs inflammatoires (NF-κB et iNOS) et du taux de NO. Les traitements avec chacun des quatre extraits étudiés ont exercé un rôle anti-inflammatoire par une déplétion significative (p < 0,05) de ces médiateurs inflammatoires. Les résultats ont montré que le CCl₄ a généré une élévation du taux de NO de 527,50 %, qui a été significativement (p < 0,05) réduite après traitement à l’AVE, au PCE et au CSE de 47,27, 19,97 et 7,54 %, respectivement ; cependant, le traitement au HVE a entraîné une réduction non significative (1,04 %) du taux de NO par rapport aux cellules traitées au CCl₄. En comparaison avec le Ks (30,46 %) dans la réduction du taux de NO, la puissance de l’AVE était supérieure, tandis que les trois autres extraits ont montré une efficacité moindre. De plus, l’expression génique de NF-κB et de l’iNOS a été significativement (p < 0,05) réduite en réponse aux différents traitements aux extraits étudiés ; le pourcentage de déplétion le plus élevé a été observé avec l’AVE (29,93 et 36,47 %, respectivement) suivi du CSE (27,00 et 9,41 %), du PCE (21,01 et 3,93 %), puis du HVE (10,09 et 2,25 %). D’autre part, le Ks a eu un effet anti-inflammatoire moindre, réduisant significativement (p < 0,05) l’expression génique de NF-κB et de l’iNOS de seulement 15,49 et 9,18 %, respectivement. Ces résultats élucident le potentiel anti-inflammatoire élevé de l’AVE par rapport au Ks et aux autres extraits étudiés. [ ]
Induction de la nécrose des cellules Vero par le CCl₄ et effet anti-nécrotique des extraits étudiés
Comme observé sous le microscope inversé (Fig. 5a), les cellules Vero non traitées ont poussé en monocouche avec une forte confluence et ont montré les cellules typiques allongées de type fibroblaste. Après le traitement au CCl₄, les cellules ont subi une diminution de la confluence avec une forme sphéroïdale et un aspect gonflé, indiquant une nécrose cellulaire et une perte d’adhérence de surface. Après traitement avec les extraits de plantes examinés, la morphologie typique de type fibroblaste des cellules Vero a été rétablie, et le nombre de cellules endommagées différait selon les puissances de ces traitements. Le traitement à l’AVE a été capable de restaurer la plupart des caractéristiques normales des cellules Vero plus que les autres extraits de plantes et le Ks. Ces résultats ont été confirmés par l’aspect morphologique des cellules Vero sous le microscope à fluorescence après leur double coloration à l’AO/EB (Fig. 5c). Les noyaux des cellules Vero viables ne peuvent être colorés qu’avec l’AO et sont donc apparus avec une fluorescence verte. L’exposition des cellules Vero au CCl₄ a induit un endommagement de la membrane cellulaire facilitant la diffusion de l’EB dans les cellules et colorant leurs noyaux au stade nécrotique précoce en couleur jaune-verdâtre vif et au stade tardif en couleur rouge. Le traitement avec les extraits de plantes étudiés a amélioré l’aspect morphologique des cellules Vero, ce qui peut être observé par le déclin de la population de cellules nécrotiques précoces avec l’absence de cellules nécrotiques tardives. De plus, quelques amas de cellules viables ont été visualisés. Le traitement à l’AVE a été plus efficace pour restaurer les aspects morphologiques des cellules Vero que les trois autres extraits de plantes et le Ks. En harmonie avec les résultats morphologiques, l’analyse par cytométrie en flux annexine V/PI (Fig. 5d, e) a révélé une élévation du pourcentage de populations de cellules Vero nécrotiques après exposition au CCl₄ (5860,75 %). Cependant, le traitement avec les extraits étudiés a considérablement réduit le nombre de ces populations cellulaires, où les extraits étudiés ont exercé une puissance significativement (p < 0,05) supérieure à celle du Ks (25,56 %). Les extraits les plus efficaces étaient l’AVE (54,61 %) et le CSE (53,81 %) suivis du PCE (46,64 %) puis du HVE (28,65 %). [ ]
Déplétion de l’expression génique de KIM-1 par les extraits étudiés
Le potentiel anti-nécrotique des extraits examinés a été confirmé par les résultats de l’expression génique de KIM-1 (Fig. 4d). L’exposition au CCl₄ a régulé à la hausse de manière significative (p < 0,05) l’expression génique de cette protéine. Tandis que le traitement avec les extraits étudiés ainsi qu’avec le médicament standard a considérablement réduit cette expression. En harmonie avec les résultats morphologiques et de cytométrie en flux, l’AVE s’est révélé le plus efficace pour réduire l’expression génique de KIM-1 de 72,29 % et de ce fait diminuer la nécrose. Les trois autres extraits (PCE, HVE et CSE) ont significativement (p < 0,05) réduit son expression de 47,48, 35,05 et 74,5 %, respectivement. En comparaison avec le Ks (61,01 %), l’AVE et le CSE avaient de plus grandes capacités de réduction, tandis que le PCE et le HVE avaient des capacités plus faibles.
Analyse en carte thermique (heat map)
Le graphique en carte thermique résume les résultats des composés phytochimiques (Fig. 2a), des activités antioxydantes in vitro (Fig. 2a) et des médiateurs nécrotiques (Fig. 5b). Ce diagramme a utilisé l’outil ClustVis pour le regroupement (clustering) des valeurs de données multivariées. La couleur du graphique [blanc (faible) à bleu (élevé)] était liée à la concentration du composé, à l’IC₅₀, ou au taux/à l’expression du paramètre.
4. Discussion
De nos jours, l’utilisation des plantes traditionnelles pour améliorer les soins de santé a suscité un grand intérêt. Cela peut être lié aux constituants vitaux de ces plantes, notamment les composés phytochimiques, les caroténoïdes, les terpénoïdes, les vitamines et autres. Dans la présente étude, les quatre extraits de plantes testés ont montré la présence de différentes quantités de composés phénoliques, de flavonoïdes, d’anthocyanes, de flavonols, de tanins, de triterpénoïdes et de vitamine C. Ces constituants sont connus pour leur importance en tant qu’agents antioxydants, anti-inflammatoires, anti-âge et anticancéreux. Par conséquent, les extraits étudiés peuvent avoir un rôle essentiel dans l’amélioration de la santé humaine, permettant à ces extraits d’acquérir une grande importance médicinale à l’avenir. Les extraits étudiés ont été examinés pour leurs activités antioxydantes et ils ont présenté des efficacités différentes comme le montre le diagramme en carte thermique (Fig. 2a). En accord avec nos résultats, les études antérieures ont confirmé les potentiels antioxydants et antiradicalaires de différents extraits d’AV, de PC, de HV et de CS. Ces capacités antioxydantes peuvent être dues à certains des constituants des extraits tels que les composés phénoliques (comme les acides phénoliques, les tanins, les flavonoïdes « flavonols et anthocyanes »), les triterpénoïdes et la vitamine C. Ces molécules sont bien connues pour leurs activités antioxydantes et leurs capacités de piégeage des ROS/espèces réactives de l’azote (RNS). Un grand nombre de groupements hydroxyles des composés phénoliques sont grandement essentiels, en ce qu’ils influencent leurs capacités de piégeage des ROS/RNS. De plus, ces composés sont capables de supprimer l’activité des enzymes génératrices de ROS ainsi que de réguler à la hausse les molécules de défense antioxydante. Le potentiel antioxydant des composés phénoliques présents dans les extraits étudiés peut être amplifié de manière synergique en présence de vitamine C. Cela aidera à renforcer la capacité de piégeage et à éliminer les ROS/RNS puis à diminuer leurs taux. En outre, les activités antiradicalaires de plusieurs types de triterpénoïdes ont été rapportées précédemment. Sans aucun doute, ces capacités antioxydantes et antiradicalaires des extraits étudiés leur confèrent un usage impératif dans les domaines de la santé et de la médecine humaines.
La présente étude a évalué l’effet cytotoxique de l’AV, du PC, du HV et du CS sur les cellules Vero, où les résultats ont révélé la grande innocuité et efficacité de chaque extrait, en particulier l’AVE, qui était supérieure au médicament standard. Cela augmentera la qualité et l’importance de ces extraits (particulièrement l’AVE) en tant que traitement efficace de la néphrotoxicité. De plus, les efficacités anti-néphrotoxiques de ces extraits sur les cellules Vero exposées au CCl₄ ont été examinées. L’utilisation du CCl₄ comme agent néphrotoxique reposait sur le fait qu’il est l’un des hépatotoxiques bien connus, avec un mécanisme d’hépatotoxicité bien documenté. De plus, il peut induire une toxicité dans de nombreux autres tissus tels que le cœur, le rein, le cerveau, le poumon, le testicule et le sang. En particulier, le rein est une bonne cible pour la toxicité du CCl₄ en raison de sa capacité à héberger de fortes quantités de CCl₄ après administration systémique. Le CCl₄ peut induire une toxicité tissulaire par la formation excessive de radicaux libres et, par la suite, en médiant le stress oxydant. Le rein est hautement vulnérable aux dommages du stress oxydant car il est riche en mitochondries, ce qui lui permet de produire des ROS à partir des NADPH oxydases et de la chaîne respiratoire mitochondriale. Le CCl₄ subit une déshalogénation réductrice lors de son métabolisme par le cytochrome P450 rénal (CYP2E1), formant le radical libre réactif trichlorométhyle (CCl₃•). Ce produit réactif interagira avec l’oxygène moléculaire, produisant le radical trichlorométhyle peroxyle (CCl₃OO•). Les radicaux libres générés vont soit déclencher des dommages peroxydatifs en se liant à l’ADN et aux protéines, soit attaquer les acides gras polyénoïques des membranes cellulaires, donnant des radicaux lipidiques secondaires. De ce fait, l’initiation de la peroxydation lipidique entraînera une production excessive de ROS ainsi qu’une consommation et une réduction du GSH. La SOD est la première ligne du système de défense antioxydante cellulaire, essentielle pour la dismutation de l’anion superoxyde en H₂O₂. Ceci est suivi par la GPX détoxifiant le H₂O₂ en eau en utilisant le GSH comme cofacteur et co-substrat. L’exposition des cellules Vero au CCl₄ a provoqué une réduction du taux de GSH concomitante à une déplétion des activités de la SOD et de la GPX. La perte des activités des enzymes antioxydantes peut être liée à la réduction du taux de GSH, qui peut inactiver la GPX et entraîner une accumulation de H₂O₂. Un taux élevé de H₂O₂ peut inhiber l’activité de la SOD, augmentant l’anion radical superoxyde qui inhibe également l’activité de la GPX. Par conséquent, la réduction du taux de GSH avec la perte des activités des enzymes antioxydantes dans les cellules Vero accumulera davantage de ROS, exacerbant le stress oxydant. Ces résultats sont en accord avec les études antérieures qui confirment l’induction du stress oxydant dans ce type cellulaire après exposition aux radicaux libres.
La présente étude a montré des puissances variées de l’AVE, du PCE, du HVE et du CSE sur l’effet dommageable induit par le CCl₄. Ainsi, ces extraits ont la capacité de rétablir l’équilibre entre la production de ROS et les antioxydants cellulaires (Fig. 5b). Ces observations sont en correspondance avec quelques études antérieures qui ont été menées sur le pouvoir atténuateur de ces plantes sur le stress oxydant et la toxicité induits par différents toxiques autres que le CCl₄. La présente étude in vitro confirme les puissantes activités antiradicalaires de ces extraits (Fig. 2), qui peuvent être liées à leurs ingrédients. Par conséquent, lors du traitement des cellules Vero exposées au CCl₄ avec chacun de ces extraits, ils ont piégé les ROS générés et réduit leur taux (Fig. 3a, b). Cela se traduira par une amélioration de l’état redox cellulaire et empêchera les ROS d’endommager les biomolécules cellulaires, ce qui à son tour a réduit le taux de peroxydation lipidique. De plus, le GSH et les enzymes antioxydantes ont été préservés et leurs taux et activités ont été renforcés. Cela peut être lié aux constituants phytochimiques des extraits étudiés tels que les acides phénoliques, les flavonoïdes, les tanins, la caféine, le catéchol et les triterpénoïdes (Tableau 2). L’importance de ces composés pour les plantes réside dans l’atténuation du stress oxydant, qui a été rapportée précédemment. Par ailleurs, la vitamine C peut atténuer la lésion rénale dans des modèles animaux en supprimant les dommages oxydatifs. La présente étude a montré que le Ks était capable de minimiser le stress oxydant induit par le CCl₄ dans les cellules Vero ; cependant, l’AVE a présenté une efficacité supérieure à celle du Ks ainsi qu’à celle des trois autres extraits étudiés. Cette puissance ultime de l’AVE peut être liée à ses taux plus élevés de constituants efficaces et fonctionnels (acides phénoliques, flavonoïdes, tanins et flavonols) par rapport aux trois autres extraits étudiés (Tableau 1).
La capacité du CCl₄ à induire un stress oxydant était la principale cause de l’élévation des médiateurs inflammatoires, et donc l’inflammation est le résultat le plus courant du stress oxydant. Nos résultats concordent avec les études antérieures rapportant la capacité du CCl₄ à activer l’expression génique de divers marqueurs inflammatoires, dont NF-κB ainsi que son activation. Les taux élevés de ROS générés par le CCl₄ sont probablement impliqués dans l’activation de cette voie. Le NF-κB agit comme un facteur de transcription contrôlant l’expression de plus de 500 gènes liés à l’inflammation ainsi qu’à la tumorigenèse et à la survie/prolifération cellulaire. Le NF-κB active l’expression d’autres médiateurs inflammatoires tels que l’iNOS et le TNF-α, entre autres, pour amplifier la réponse inflammatoire. L’élévation de ces médiateurs inflammatoires amplifie le stress oxydant au sein des cellules ; par conséquent, l’élévation de l’iNOS conduira à la production de davantage de radicaux NO. Ces radicaux peuvent interagir avec les radicaux superoxydes, donnant des peroxynitrites avec d’autres RNS et augmentant les dommages cellulaires. Par conséquent, la production de médiateurs inflammatoires est concomitante au stress oxydant et vice versa.
Les effets améliorateurs des extraits étudiés sur l’inflammation induite par le CCl₄ dans les cellules Vero sont possiblement dus à la réduction du taux de ROS ainsi qu’à l’inhibition de la voie NF-κB (Fig. 5b). En accord avec ces constatations, les rôles anti-inflammatoires de l’AV, du PC, du HV et du CS ont été précédemment confirmés par quelques études in vitro et in vivo. La présence des composés phytochimiques (Tableau 1) dans les extraits étudiés est d’une grande importance en leur conférant leurs puissantes activités anti-inflammatoires. Comme détecté par l’HPLC, ces extraits étudiés contenaient certains types de composés phénoliques, qui ont été précédemment rapportés comme inhibant l’expression de NF-κB et ses médiateurs inflammatoires associés. Les polyphénols sont également capables d’interagir avec et d’inactiver NF-κB et l’iNOS, modulant par la suite la production de NO et d’autres médiateurs inflammatoires. De plus, les activités anti-inflammatoires des flavonoïdes, des tanins, des triterpénoïdes et de la vitamine C par le ciblage de la voie NF-κB ont été rapportées auparavant. Les résultats ont montré le potentiel anti-inflammatoire plus élevé de l’AVE par rapport aux autres extraits étudiés et au Ks, ce qui peut être lié à sa teneur phytochimique plus élevée.
L’exposition des cellules Vero au CCl₄ peut conduire à une nécrose rénale en raison de la production excessive de ROS/RNS qui submerge la capacité de piégeage cellulaire. Cet état peut provoquer un mode passif de mort cellulaire (nécrose cellulaire), qui est devenu impliqué dans l’augmentation des dommages inflammatoires et l’aggravation de la lésion rénale, comme observé dans la Fig. 5. Ces résultats soutiennent l’existence d’une interaction entre le stress oxydant, l’inflammation et la nécrose dans les maladies de lésion rénale. Comme discuté ci-dessus, le traitement avec les extraits étudiés a extrêmement diminué le stress oxydant et inflammatoire. Par conséquent, la nécrose a diminué et les cellules se sont régénérées à nouveau (retrouvant presque leur forme normale, en particulier avec l’AVE et le CSE plus qu’avec le PCE et le HVE). Ainsi, les antioxydants qui piègent les ROS ou stimulent le pool antioxydant cellulaire peuvent avoir un rôle thérapeutique dans la lésion rénale aiguë. KIM-1 est une protéine transmembranaire de type 1 qui agit comme une molécule d’adhésion attachant les cellules à la matrice extracellulaire et interconnectant les cellules entre elles. Cette protéine est indétectable dans le rein normal ; cependant, elle est extrêmement exprimée à la suite de l’exposition à des néphrotoxines. Ainsi, KIM-1 est considérée comme un biomarqueur sensible de la lésion rénale. La protéine générée est largement localisée sur la membrane apicale du tubule proximal, là où le tubule est le plus affecté. KIM-1 confère aux cellules épithéliales la capacité de reconnaître les cellules endommagées et de les transformer en phagocytes semi-professionnels puis de les transporter vers les lysosomes. KIM-1 est exprimée dans le rein (aucun autre organe) de nombreuses espèces (humain, rongeurs, singes, chiens et poisson-zèbre) et est libérée par les cellules in vitro et in vivo après une nécrose tubulaire aiguë. Il a été rapporté que KIM-1, en tant que marqueur, était plus sensible aux différents types d’agressions rénales (inflammation, néphrotoxicité et cancer) que la créatinine et l’urée. Ainsi, KIM-1 est un indicateur très utile dans l’évaluation des dommages rénaux et le développement de nouveaux médicaments. Dans la présente étude, le changement d’expression élevé (fold change) de cette protéine après incubation des cellules Vero avec le CCl₄ indique l’induction de la lésion des cellules rénales, et cette constatation peut être confirmée par l’étude antérieure de Huo et al. De plus, des études antérieures ont observé une élévation de l’expression génique et du taux protéique de KIM-1 qui étaient concomitants au taux élevé de ROS et à l’inflammation ayant médié la lésion rénale aiguë.
La forte diminution de l’expression de KIM-1 après traitement avec les extraits étudiés indique une restauration de l’état sain des cellules Vero, ce qui est possiblement dû à leur teneur phytochimique (Fig. 2a). Ainsi, ces ingrédients ont induit une amélioration globale des cellules Vero traitées au CCl₄ en réduisant le taux de ROS et de ce fait en prévenant les médiateurs nécrotiques, le stress oxydant et inflammatoire. Ainsi, la nécrose et la lésion des cellules rénales ont été inversées, suivies d’un déclin de l’expression de la protéine KIM-1.
5. Conclusions
Nous avons démontré que le CCl₄ était capable d’induire une toxicité et une nécrose dans les cellules Vero en élevant le stress oxydant et l’inflammation, dont il a été précédemment prouvé qu’ils sont impliqués dans les maladies rénales chroniques. Le traitement avec l’AVE, le PCE, le HVE et le CSE a surmonté la toxicité induite par le CCl₄ en inhibant les principaux médiateurs nécrotiques, tandis que l’AVE a présenté le potentiel thérapeutique le plus efficace dans la plupart des paramètres étudiés. De plus, l’efficacité de l’AVE était supérieure à celle du médicament Ks ; cela peut être dû à ses constituants importants, qui possédaient de puissantes activités antioxydantes et anti-inflammatoires, ce qui confère à l’AVE une grande importance thérapeutique.