Activité antiproliférative in vitro et mécanisme d’action d’Anemone nemorosa
Source : PMID non indiqué dans le fichier source — PMCID PMC6429291 — DOI 10.3390/ijms20051217 (International Journal of Molecular Sciences, 2019). Type : article de recherche, texte intégral.
Objectif
Anemone nemorosa (anémone des bois) appartient au genre Anemone (Renonculacées, ordre des Ranunculales), qui compte plus de 150 espèces. Diverses parties de la plante ont été utilisées traditionnellement pour traiter de nombreuses affections : maux de tête, fièvres tierces, goutte rhumatismale, lèpre, léthargie, inflammation des yeux, ulcères malins et corrosifs. Les plantes du genre Anemone contiennent divers composés médicinaux à activités anticancéreuse, immunomodulatrice, anti-inflammatoire, antioxydante et antimicrobienne. À ce jour, aucun usage de la plante dans le traitement du cancer n’avait été rapporté. Cependant, en raison de l’abondance rapportée de saponines — qui exercent habituellement une activité anticancéreuse via l’arrêt du cycle cellulaire et l’induction de l’apoptose —, les auteurs ont étudié le mode de mort cellulaire induit par un extrait aqueux d’A. nemorosa sur des cellules HeLa (cancer du col de l’utérus). Le cisplatine a servi de témoin positif. L’extrait aqueux a été retenu à la suite d’un criblage antiprolifératif préliminaire d’extraits éthanolique, hydro-éthanolique et aqueux.
Méthodes
Matériel végétal et extrait. La partie aérienne d’A. nemorosa a été récoltée à Piatra Neamţ (comté de Neamţ, avril 2014) et l’identité établie par comparaison avec des spécimens d’herbier du Jardin botanique « Dimitrie Brandza » de Bucarest (spécimen de référence n° 405889). L’extrait aqueux a été préparé en broyant environ 10 g de matériel, puis en extrayant avec 3 × 100 mL d’eau à reflux, suivi de concentration par évaporation rotative et de lyophilisation à −55 °C, avec un rendement de 16,67 % d’extrait sec. L’extrait a été reconstitué dans le DMSO à 100 mg/mL. La teneur totale en polyphénols (TPC) était de 23,98 mg d’équivalents acide gallique/g d’extrait sec, et la teneur totale en flavonoïdes (TFC) de 1,12 mg d’équivalents quercétine/g.
Cultures cellulaires. Cellules HeLa maintenues en milieu RPMI 1640 supplémenté en 10 % de sérum de veau fœtal, à 37 °C sous 5 % de CO2.
Analyses. Cytotoxicité par double marquage Hoechst 33342/iodure de propidium (IP) sur cellules HeLa, MeWo et HepG2. Analyse du cycle cellulaire et test des micronoyaux (marquage NucRed Live 647). Phosphorylation de l’histone H3 (anticorps phospho-H3 Ser10). Translocation de la phosphatidylsérine (kit Annexine V-FITC/IP). Analyse du potentiel de membrane mitochondriale (TMRE). Activation des caspases 8 et 3 (immunofluorescence, anticorps anti-caspase clivée). Production d’espèces réactives de l’oxygène (CellRox orange). Induction de l’autophagie (Lysotracker Deep Red). Imagerie sur système ImageXpress Micro XLS. Analyse statistique par test t de Student (au moins trois expériences).
Résultats
Cytotoxicité. Les valeurs de concentration inhibitrice à 50 % (CI50) obtenues étaient de 20,33 ± 2,480 µg/mL (HeLa), > 200 µg/mL (MeWo) et 27,66 ± 12,27 µg/mL (HepG2). Les cellules HeLa ayant été les plus sensibles, toutes les expériences ultérieures ont porté sur cette lignée aux concentrations CI10, CI25, CI50 et CI75. Pour qu’un extrait brut soit considéré comme prometteur en application systémique, la CI50 doit être inférieure à 100 µg/mL in vitro ; celle d’A. nemorosa (20,33 µg/mL) satisfait ce critère.
Cycle cellulaire. A. nemorosa a bloqué les cellules HeLa de manière dose-dépendante dans la phase M précoce du cycle après 24 h, alors que le cisplatine bloquait les cellules en phase G2. Après 48 h, le blocage en phase M précoce par A. nemorosa était moins prononcé.
Phosphorylation de l’histone H3. La phosphorylation de l’histone H3 en Ser10 est considérée comme un marqueur de l’entrée en mitose. Aucune augmentation significative n’a été observée après 24 ou 48 h, sauf pour le traitement à la CI75 d’A. nemorosa. Une diminution de l’histone H3 phosphorylée après 48 h a été notée, cohérente avec le faible pourcentage de cellules en phase M précoce à ce stade. Le faible niveau de phosphorylation suggère un arrêt mitotique en métaphase, relativement précoce dans la mitose.
Micronoyaux. Une augmentation significative de la formation de micronoyaux a été observée après 24 h et 48 h d’exposition à A. nemorosa aux CI50 et CI75, suggérant l’apparition possible d’une catastrophe mitotique.
Translocation de la phosphatidylsérine (PS). La translocation de la PS est considérée comme une caractéristique précoce de l’apoptose. Davantage de PS était présente après 48 h de traitement. Des augmentations significatives ont été observées pour tous les traitements d’A. nemorosa de façon dose-dépendante, la plus forte augmentation du nombre de cellules apoptotiques étant enregistrée pour la CI75.
Potentiel de membrane mitochondriale (PMM). Une diminution significative de l’intensité cytoplasmique moyenne du TMRE a été observée après 24 et 48 h, suggérant une dépolarisation de la membrane mitochondriale et donc l’implication des mitochondries dans le déclenchement de l’apoptose.
Caspases 8 et 3. Des augmentations significatives et dose-dépendantes de l’intensité cellulaire moyenne pour les caspases 8 et 3 ont été observées après 24 et 48 h. L’activation des deux caspases suggère l’implication à la fois de la voie extrinsèque et de la voie intrinsèque dans l’exécution de l’apoptose.
Espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le traitement par A. nemorosa a augmenté significativement les niveaux de ROS, avec des augmentations plus marquées après 24 h qu’après 48 h. Les ROS contribuent ainsi à l’induction de l’apoptose.
Autophagie. Des diminutions significatives du marquage Lysotracker ont été observées pour A. nemorosa (contrairement aux augmentations observées avec le cisplatine) après 24 et 48 h. Ce marquage diminué peut être attribué à l’absence d’autophagie, possiblement par inhibition, ou traduire une orientation en faveur de l’induction de l’apoptose.
Conclusion
Pris ensemble, les résultats démontrent que l’extrait aqueux brut d’A. nemorosa peut avoir un potentiel anticancéreux. Le traitement des cellules HeLa par A. nemorosa induit l’apoptose ; ce mécanisme s’accompagne d’un arrêt du cycle cellulaire en phase M précoce, de l’induction d’une catastrophe mitotique, d’une dépolarisation de la membrane mitochondriale, de l’activation des caspases et de la génération d’espèces réactives de l’oxygène. Les études futures porteront sur l’isolement et l’identification du ou des composants actifs et sur la caractérisation précise du mécanisme d’action induit par A. nemorosa.