Pulsatilla vulgaris inhibe la prolifération cancéreuse dans les voies de signalisation de 12 gènes rapporteurs
Source : PMID non indiqué dans le fichier source — PMCID PMC9860614 — DOI 10.3390/ijms24021139 (International Journal of Molecular Sciences, 2023). Type : article de recherche, texte intégral.
Objectif
Cette étude visait à déterminer si des extraits méthanoliques de Pulsatilla vulgaris Mill. (anémone pulsatille, « pasque flower ») peuvent inhiber la prolifération des cellules HeLa par la modulation des voies de signalisation liées au cancer. La cytotoxicité et la composition chimique des extraits de feuilles et de racines de P. vulgaris ont également été déterminées. Il s’agit de la première étude rapportant l’influence de P. vulgaris sur les voies de signalisation cancéreuses, ainsi que la première analyse phytochimique détaillée des extraits de cette espèce.
Contexte
Le genre Pulsatilla comprend 70 espèces, dont 38 taxons dans l’hémisphère Nord, avec une longue histoire d’usage en médecine traditionnelle chinoise. Les plantes de ce genre sont employées contre de nombreux maux : paludisme, infections bactériennes, bronchite, toux, asthme, insomnie, hyperactivité, stress, anxiété, névralgies, maux de tête, otalgies et rhumatismes. Les saponines triterpéniques, les flavonoïdes et les acides phénoliques sont les principales classes de métabolites spécialisés documentées dans les parties aériennes et souterraines de ces plantes.
P. vulgaris subsp. vulgaris est un représentant peu étudié de la famille des Renonculacées. Répandue en Europe centrale et orientale, elle est classée comme espèce éteinte (catégorie RE) en Pologne du fait de l’intensification agricole. Une étude antérieure des auteurs avait rapporté l’activité antifongique de ce taxon : les extraits étaient actifs contre le champignon Candida glabrata avec une CI50 de 11 µg/mL. Les études phytochimiques antérieures ont montré que P. vulgaris peut être une source de composés bioactifs, principalement des saponines triterpéniques de type oléanane et lupane, susceptibles d’avoir une activité anticancéreuse. L’extrait méthanolique de racine de P. vulgaris a révélé la présence de la saponine D de Pulsatilla (hédéragénine 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-[β-D-glucopyranosyl (1→4)]-α-L-arabinopyranoside).
D’autres espèces de Pulsatilla ont été bien davantage explorées pour leur activité antiproliférative : par exemple, une saponine oléanane de l’extrait méthanolique de racine de P. patens subsp. multifida inhibe la croissance du cancer de la peau ; les saponines A et B de Pulsatilla, isolées de la racine de P. chinensis, montrent une forte activité cytotoxique contre des cellules de cancer du poumon malin et des tumeurs hépatiques humaines. La saponine D de P. koreana inhibe la croissance des cellules cancéreuses et est employée dans le traitement de la maladie d’Alzheimer.
P. vulgaris est classée dans l’UE comme « en danger critique » (CR) en Autriche, « en danger » (EN) en Allemagne et en Suisse, « quasi menacée » par l’UICN, et « vulnérable » (VU) au Royaume-Uni, en Suède, en Slovaquie et en Ukraine. Sa faible disponibilité sur les sites naturels explique qu’elle soit surtout cultivée artificiellement en jardins botaniques et en serres, et qu’elle ait été rarement étudiée sur le plan pharmacologique.
Pour évaluer l’activité des extraits méthanoliques de racines et de feuilles, les auteurs ont sélectionné 13 vecteurs de gènes rapporteurs à luciférase, représentés par des facteurs de transcription : MYC, Ets, Notch, Wnt, Stat3, Smad, AP-1, NF-κB, E2F, Hdghog, miR-21, k-Ras, FoxO, et pTK (témoin). L’étude a porté sur la transduction du signal en présence de divers inducteurs (IL-6, TGF-β, PMA, Wnt-3a), les cellules étant exposées aux extraits pendant 4 à 6 h.
Méthodes
Matériel végétal. Les feuilles et racines d’individus fleuris de quatre ans de P. vulgaris subsp. vulgaris ont été récoltées en mai 2016–2018 dans une culture du Jardin botanique de Podlasie « The Herbal Corner » (Nord-Est de la Pologne). Le matériel a été identifié par la Prof. Grażyna Łaska (Université de technologie de Białystok). En juin 2018, les racines sèches (59,3 g) et les feuilles (28,1 g) ont été extraites par extraction accélérée par solvant (ASE, SpeedExtractor E-916, Buchi) au méthanol à 80 % (30 min, 100 °C, 120 bar). Après évaporation du méthanol, on a obtenu 1,1 g d’extrait de racines et 0,95 g d’extrait de feuilles.
Profilage chimique. Les échantillons ont été analysés qualitativement par LC-ESI-QTOF-MS (chromatographe Agilent 1200 Infinity couplé à un spectromètre de masse Q-ToF 6530B), en ionisation électrospray en mode négatif, après séparation sur colonne Gemini C18. L’identification s’est appuyée sur les spectres UV et de masse, comparés à la littérature et aux bases de données HMDB et PubChem.
Cytotoxicité. La cytotoxicité des extraits de racines et de feuilles a été évaluée par la méthode du rouge neutre (au NCNPR, Université du Mississippi) contre cinq lignées cancéreuses humaines (HeLa carcinome du col utérin, SK-OV-3 carcinome de l’ovaire, KB carcinome épidermoïde, SK-MEL mélanome cutané, BT-549 carcinome mammaire) et deux lignées rénales non cancéreuses (LLC-PK1 et VERO), après 48 h d’incubation. Séparément, la cytotoxicité contre HeLa et VERO a été mesurée après 72 h par le test MTT. La doxorubicine a servi de témoin positif et le DMSO de témoin négatif (véhicule). Les critères d’évaluation suivaient les recommandations du National Cancer Institute (NCI) : CC50 < 20 µg/mL = forte activité cytotoxique ; 21–200 µg/mL = modérée ; 201–500 µg/mL = faible ; > 500 µg/mL = non cytotoxique.
Transfection et tests de luciférase. Des cellules HeLa ont été transfectées avec un panel de 13 vecteurs de gènes rapporteurs à luciférase inductibles (STAT3, SMAD3/4, NF-κB, AP-1, Ets, E2F, MYC, Notch, FoxO, Wnt, Hedgehog, miR-21, k-Ras). Après 24 h, les agents testés ont été ajoutés, suivis 30 min plus tard d’un inducteur : IL-6 (50 ng/mL) pour Stat3 ; TGF-β (5 ng/mL) pour Smad ; Wnt-3a (500 ng/mL) pour Wnt ; PMA (phorbol 12-myristate 13-acétate, 77 ng/mL) pour AP-1, NF-κB, E2F, MYC, Ets, Notch et Hdghog. Aucun inducteur n’a été ajouté pour FoxO, miR-21, k-Ras et pTK (témoin, promoteur de la thymidine kinase). Après 4 h (STAT3, SMAD3/4, NF-κB, AP-1, Ets, E2F, MYC) ou 6 h (Notch, FoxO, Wnt, Hedgehog, miR-21, k-Ras) d’induction, la luminescence a été mesurée. La luciférase de luciole (Photinus pyralis) a été utilisée ; l’émission lumineuse totale est directement proportionnelle à l’activité de la luciférase et permet d’évaluer l’activité transcriptionnelle du gène rapporteur. Un analogue du resvératrol a servi de témoin positif antitumoral.
Résultats
Cytotoxicité. Les extraits de racines et de feuilles ont montré une cytotoxicité in vitro sur les lignées mammifères au test du rouge neutre. L’extrait de racines a été le plus cytotoxique (CC50 de 39–42 µg/mL pour les lignées normales et 31–57 µg/mL pour les lignées cancéreuses) comparé à l’extrait de feuilles (CC50 de 52–73 µg/mL). Selon les critères du NCI, l’extrait méthanolique de P. vulgaris peut être qualifié de modérément cytotoxique. L’inhibition la plus forte de la viabilité a été observée sur les cellules HeLa, retenues pour la suite. Au test MTT (72 h), l’extrait de racines (PVR) présentait un indice de sélectivité (SI) de 2,62, indiquant une activité anticancéreuse sélective, tandis que l’extrait de feuilles (PVL) montrait une cytotoxicité similaire envers les cellules normales et cancéreuses. Les auteurs soulignent que les résultats entre tests (rouge neutre vs MTT) ne concordent pas toujours en raison de la nature différente de chaque test ; utiliser au moins deux tests fondés sur des paramètres différents est considéré comme une bonne pratique.
Composition chimique. 39 constituants ont été déterminés pour la première fois chez P. vulgaris : quatorze saponines triterpéniques, seize acides phénoliques, quatre coumarines, un flavonoïde et trois acides gras. Les saponines triterpéniques et les dérivés d’acide hydroxycinnamique constituent la classe principale de métabolites spécialisés. Les saponines étaient distribuées exclusivement dans les échantillons de racines. Les squelettes de sapogénine identifiés étaient de type oléanane ou lupane. Quatre composés ont été classés comme saponines de type hédéragénine, et deux (composés 21 et 23), présents uniquement dans les racines, comme dérivés de la bayogénine. Parmi les seize acides phénoliques (dans racines et feuilles), quatre étaient des acides hydroxybenzoïques et la majorité des dérivés d’acide hydroxycinnamique ; le composé 18 a été confirmé comme acide férulique. L’acide caféoyl-féruloyltartrique, précédemment décrit chez Cichorium intybus, a été identifié pour la première fois chez P. vulgaris. Le seul flavonoïde trouvé (quercétine-O-désoxyhexoside-O-hexoside) n’était présent que dans les feuilles. Quatre coumarines ont été détectées dans les racines et les feuilles.
Activité sur les voies de signalisation dans les cellules HeLa. L’extrait méthanolique de racines de P. vulgaris s’est révélé plus puissant que l’extrait de feuilles pour inhiber l’activation de douze des voies analysées, à la seule exception de FoxO. Les composés actifs de l’extrait de racines ont fortement inhibé l’activation des voies Stat3, Smad, AP-1, NF-κB, E2F, MYC, Ets, Notch, Wnt, Hdghog, pTK (témoin), miR-21 et k-Ras. Chaque médiateur de signalisation apoptotique était inhibé plus fortement par les composés de l’extrait de racines que de feuilles. L’extrait de racines était plus puissant que l’analogue du resvératrol à toutes les concentrations étudiées, sauf pour FoxO, où l’analogue du resvératrol était plus efficace. Les plus grandes différences statistiquement significatives pour l’extrait de racines concernaient l’inhibition de l’activation de Notch, Myc, E2F et Wnt.
Effet dose–réponse. À 40 µg/mL, l’extrait de racines était plus puissant pour inhiber l’activation de six voies (Stat3, E2F, MYC, pTK, miR-21 et k-Ras), sauf FoxO. À 15 µg/mL, une activation plus forte de trois voies (NF-κB, Ets, Wnt) et un même effet sur quatre voies (Smad, AP-1, Hdghog, Notch) ont été observés. À 10 µg/mL, l’influence sur l’ensemble des voies était la plus faible. Comparée à P. patens précédemment étudiée, P. vulgaris a inhibé toutes les voies testées avec une puissance significativement supérieure : par exemple, pour k-Ras et Notch, P. patens montrait une induction de la luciférase d’environ 60 %, alors que P. vulgaris inhibait complètement ces voies.
Les auteurs précisent que l’action de l’extrait méthanolique de P. vulgaris repose sur l’inhibition de la mitose dans le cycle cellulaire des HeLa : les composés actifs amorcent l’induction de l’apoptose et provoquent une prolifération cellulaire dérégulée conduisant à la mort apoptotique et à l’inhibition de la croissance des cellules cancéreuses. Ils reconnaissent toutefois que l’influence pro-apoptotique proposée reposait sur l’étude des voies de signalisation et non sur des mesures directes de l’apoptose ; celle-ci nécessite des recherches complémentaires (mesures des caspases 3, 7, 8 ou 9, études des mutations de l’ADN et de sa fragmentation, microscopie de fluorescence ou cytométrie en flux).
Conclusion
L’étude confirme la forte inhibition de 12 voies de signalisation dans les cellules HeLa par les extraits méthanoliques de P. vulgaris. L’extrait de racines est le plus puissant pour inhiber l’activation de MYC, Notch, Wnt, E2F, Ets, Stat3, Smad, Hdghog, AP-1, NF-κB, k-Ras, miR-21 et pTK (témoin). Les extraits favorisent la mort apoptotique des cellules HeLa et dérégulent la prolifération, la différenciation et la progression vers le phénotype néoplasique en modifiant des molécules clés de la progression du cycle cellulaire. P. vulgaris est une source riche en saponines triterpéniques et acides phénoliques, dont le profil diffère de celui d’autres espèces de Renonculacées. Ces travaux pourront aider à combiner des extraits de P. vulgaris avec d’autres agents (bloqueurs de MYC, Notch, Wnt, E2F, Ets, STAT, SMAD, Hdghog, AP-1, NF-κB) pour traiter le cancer du col utérin et d’autres cancers activant ces voies.
Les auteurs soulignent qu’il n’existe encore aucune étude préclinique ni clinique confirmant clairement le bénéfice des métabolites secondaires de P. vulgaris en oncologie, et que des obstacles subsistent : la limitation des sites naturels de P. vulgaris dans l’UE et la biodisponibilité limitée des substances d’origine naturelle. Davantage d’études toxicologiques des extraits et de leurs métabolites secondaires aux niveaux cellulaire, tissulaire, organique et de l’organisme sont nécessaires.