Anthyllide vulnéraire — profil phénolique et activité antiproliférative contre des lignées cancéreuses humaines
Source : PMID (non indiqué) — PMCID PMC9653624 — DOI 10.3390/molecules27217495 — Molecules, 2022 — Article intégral (texte complet)
Titre original : « Phenolic Profile, EPR Determination, and Antiproliferative Activity against Human Cancer Cell Lines of Anthyllis vulneraria Extracts »
Objectif
Évaluer les extraits de feuilles et de fleurs d’Anthyllis vulneraria pour leur caractérisation chimique (par HPLC-MS), leur capacité à piéger les radicaux méthoxy (mesurée par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, RPE/EPR) et leur activité antiproliférative in vitro contre plusieurs lignées de cellules cancéreuses humaines (sein : MCF-7 ; col de l’utérus : HeLa ; hépatocellulaire : HepG2).
L’anthyllide vulnéraire (A. vulneraria L.) est une plante médicinale de la famille des Fabacées, couramment cultivée dans différentes régions montagneuses méditerranéennes. Ses extraits ont été traditionnellement utilisés pour traiter diverses affections (plaies, brûlures, inflammations de la peau et de l’estomac, eczémas, etc.) ; la plante est aussi reconnue comme antitussive, dépurative et diurétique. Les feuilles et les fleurs sont riches en composés phénoliques (tanins, saponines, caroténoïdes, flavonoïdes, entre autres).
Dans une étude antérieure des mêmes auteurs, la teneur totale en polyphénols des extraits de feuilles et de fleurs était d’environ 83 et 134 mg d’équivalent acide gallique/g de poids sec, respectivement, et la teneur totale en flavonoïdes variait entre environ 20 et 34 mg d’équivalent quercétine/g de poids sec. La meilleure activité antioxydante correspondait aux extraits de fleurs.
Méthodes
Matériel végétal : A. vulneraria a été récoltée dans les montagnes de la région de Zaghouan, au nord de la dorsale tunisienne (latitude 36° 24′ 10″ N ; longitude 10° 08′ 34″ E). Les feuilles et les fleurs ont été séparées du reste de la plante et séchées à l’air (27 °C) pendant environ 2 semaines jusqu’à poids constant, puis broyées.
Préparation des extraits : 1 g de chaque poudre sèche (feuilles et fleurs) a été dissous dans 20 mL d’une solution d’éthanol à 50 % (v/v), pendant 24 h à 4 °C sous agitation. Les mélanges ont été centrifugés (1500 × g, 10 min), les surnageants concentrés sous flux d’azote puis lyophilisés (2 jours). Les échantillons lyophilisés ont été redissous selon l’analyse : éthanol à 50 % pour l’HPLC-MS, méthanol pur désoxygéné pour la RPE, et PBS (5 mg/mL) pour l’activité antiproliférative. Les extraits ont été filtrés (filtres stériles 0,22 µm). Toutes les analyses ont été réalisées en triple.
HPLC-MS : appareil Agilent série 1200, colonne C18. Phase A : eau ultrapure acidifiée à 0,11 % d’acide formique ; phase B : acétonitrile acidifié à 0,11 % d’acide formique ; débit 0,2 mL/min ; volume d’injection 10 µL ; température de colonne 30 °C. Identification par comparaison des temps de rétention et des ions fragments avec des standards commerciaux. Résultats exprimés en microgrammes par gramme de poids sec (µg/g PS).
Piégeage de spin et RPE : mesure de l’activité de piégeage des radicaux CH₃O⁻ par réaction compétitive en présence de DMPO. Mélange réactionnel : 300 µL de DMPO (35 mM), 150 µL de H₂O₂ (10 mM), 150 µL d’extrait (ou d’acide férulique comme référence, ou de méthanol pur comme témoin), puis 150 µL de FeSO₄ (2 mM). Spectre enregistré 10 min après ajout du FeSO₄ (spectromètre Bruker EMX 10/12-Plus). L’activité antioxydante a été déterminée par la diminution de l’intensité des bandes spectrales de l’adduit DMPO-OCH₃.
Activité antiproliférative in vitro (test MTT) : trois lignées cellulaires — MCF-7 (adénocarcinome du sein), HeLa (adénocarcinome du col de l’utérus), HepG2 (carcinome hépatocellulaire) — cultivées à 37 °C sous 5 % de CO₂ en milieu DMEM. Cellules ensemencées à 4,7 × 10⁴ cellules/puits, puis traitées par les extraits de feuilles et de fleurs à 50 µg/mL et 250 µg/mL, incubation 48 h. Absorbance mesurée à 570 nm. Témoins négatifs : cellules non traitées et cellules traitées au solvant PBS.
Analyse statistique : logiciel Minitab (v. 20). Données en triple (n = 3), résultats en moyennes ± écarts-types. Test de Tukey pour les différences significatives (α = 0,05).
Résultats
Profil phénolique. Dans l’extrait de feuilles, 17 composés phénoliques ont été identifiés : 11 acides phénoliques différents, 1 flavonoïde et 5 autres types de polyphénols. Dans l’extrait de fleurs, 15 composés ont été identifiés : 8 acides phénoliques et 7 flavonoïdes.
Extrait de feuilles : les acides phénoliques identifiés comprennent l’acide chlorogénique, l’acide caféique, l’acide 2,3-dihydroxybenzoïque, l’acide p-coumarique, l’acide férulique, l’acide sinapique, l’acide 4-hydroxy-2-phénylacétique, l’acide 2-hydroxybenzoïque, ainsi que les acides cinnamique et 4-hydroxyphénylpropionique. Le seul flavonoïde détecté était le kaempférol-3-O-rutinoside (6314,85 µg/g PS). Les autres polyphénols comprennent le 4-hydroxybenzaldéhyde, le 3,4-dihydroxyphénylglycol, le p-anisaldéhyde, le pyrogallol et la coumarine. L’extrait de feuilles est une source abondante d’acides phénoliques, avec des teneurs allant de 49,58 (acide p-coumaroyl tartrique) à 7985,14 µg/g PS. Les composés les plus abondants : acides chlorogénique, caféique, 2,3-dihydroxybenzoïque, p-coumarique, férulique, sinapique, 4-hydroxy-2-phénylacétique et cinnamique.
Extrait de fleurs : tous les acides phénoliques ont été identifiés en mode d’ionisation négatif — acides chlorogénique, caféique, syringique, p-coumarique, férulique, sinapique, 2,3-dihydroxybenzoïque et p-coumaroyl tartrique. Parmi les sept flavonoïdes détectés : quercétine, myricétine, épicatéchine, delphinidine 3-O-sambubioside, rutine et kaempférol-3-O-rutinoside. La teneur en flavonoïdes de l’extrait de fleurs était plus élevée que celle de l’extrait de feuilles, variant de 64,24 (delphinidine 3-O-sambubioside) à 6314,85 (kaempférol-3-O-rutinoside) µg/g PS. Les flavonoïdes les plus abondants : épicatéchine, quercétine, myricétine, delphinidine 3-O-sambubioside, rutine et kaempférol-3-O-rutinoside.
Piégeage des radicaux CH₃O⁻ (RPE). Les deux extraits ont montré une relation négative entre leur concentration et la capacité de piégeage des radicaux CH₃O⁻. Les unités arbitraires des extraits de feuilles et de fleurs diminuaient respectivement de 55 et 65 à 10 et 4, à des concentrations allant de 0 à 1500 mg d’équivalent acide férulique/L de méthanol. La présence d’une structure 3-hydroxyle dans les acides phénoliques majoritaires (acide férulique, caféique, p-coumarique, sinapique, p-hydroxybenzoïque, syringique) renforce l’activité antioxydante et antiradicalaire.
Activité antiproliférative. La viabilité des cellules cancéreuses diminuait significativement (α = 0,05) avec l’augmentation de la concentration d’extrait (de 50 à 250 µg/mL). Les extraits de feuilles présentaient une meilleure activité antiproliférative contre les trois lignées (HepG2 > HeLa > MCF-7) que les extraits de fleurs.
- À 50 µg/mL, l’extrait de feuilles réduisait la viabilité des cellules HepG2 de 99,04 %, celle des HeLa de 82,75 % et celle des MCF-7 de 46,13 %.
- À 50 µg/mL, l’extrait de fleurs réduisait la viabilité des HepG2, HeLa et MCF-7 de 58,93 %, 33,97 % et 46,13 % respectivement.
- À 250 µg/mL, l’extrait de feuilles réduisait la viabilité des HepG2, HeLa et MCF-7 de 99,37 %, 98,35 % et 98,3 % respectivement.
- À 250 µg/mL, l’extrait de fleurs éliminait 99,11 %, 97,85 % et 97 % des cellules HepG2, HeLa et MCF-7 respectivement.
La plus forte activité antiproliférative de l’extrait de feuilles pourrait être associée à ses teneurs élevées en acide chlorogénique (5 fois plus que dans l’extrait de fleurs) et en acide férulique (19 fois plus que dans l’extrait de fleurs), deux acides reconnus pour leur activité antitumorale. Les cellules HepG2 étaient les plus affectées ; leur plus grande sensibilité pourrait être liée au rôle central du foie dans le métabolisme des xénobiotiques et des médicaments. Les faibles concentrations (50 µg/mL) des deux extraits n’avaient pas d’effet significatif sur la viabilité des cellules MCF-7. Outre les acides phénoliques, les flavonoïdes (comme la delphinidine et la myricétine) pourraient aussi contribuer à l’effet antiprolifératif.
Conclusion
Les extraits de feuilles et de fleurs d’A. vulneraria sont composés de différents composés phénoliques associés à leurs puissantes activités antiradicalaire et antiproliférative. La teneur élevée en flavonoïdes et en acides phénoliques fait de l’anthyllide vulnéraire une source importante de molécules bioactives, potentiellement utilisables comme agent fonctionnel dans les produits pharmaceutiques. L’activité antiproliférative dépend de la concentration de l’extrait (250 µg/mL > 50 µg/mL), du type d’extrait (feuille ou fleur) et du type de cellule cancéreuse. Les auteurs proposent de futures études de fractionnement pour identifier précisément les composés responsables et leurs mécanismes intracellulaires.