Activités anti-inflammatoires des extraits de plante entière versus de fleurs d’Arnica montana : études analytiques, in vitro et in vivo dans un modèle d’œdème de la patte chez la souris
Référence : Plants 2023. — PMC10053944 · DOI 10.3390/plants12061348 Type : étude analytique, in vitro et in vivo · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Arnica montana est bien connu pour ses propriétés anti-inflammatoires. Si l’activité anti-inflammatoire des fleurs d’arnica (Arnicae flos) a été largement étudiée, celle de la plante entière (Arnicae planta tota) est moins caractérisée. Nous avons comparé la capacité d’extraits de plante entière et de fleurs d’arnica à inhiber la voie pro-inflammatoire NF-κB–eicosanoïdes, au moyen de plusieurs essais in vitro et in vivo. Nous avons montré que la plante entière d’arnica inhibait l’activation d’un gène rapporteur de NF-κB, avec une CI_50 de 15,4 μg/mL (contre 52,5 μg/mL pour les fleurs d’arnica). La plante entière d’arnica inhibait également l’expression, induite par le LPS, des gènes ALOX5 et PTGS2 dans des macrophages humains différenciés. ALOX5 et PTGS2 codent les enzymes 5-lipoxygénase (5-LO) et cyclooxygénase-2 (COX-2), qui initient respectivement la conversion de l’acide arachidonique en leucotriènes et en prostaglandines. La plante entière d’arnica inhibait l’activité enzymatique de la 5-LO et de la COX-2 in vitro et dans des cellules primaires humaines du sang périphérique, avec des CI_50 inférieures à celles des fleurs d’arnica. Enfin, la plante entière d’arnica appliquée par voie topique réduisait l’œdème de la patte induit par la carraghénane chez la souris plus efficacement que les fleurs d’arnica. Dans l’ensemble, la plante entière d’arnica a présenté une activité anti-inflammatoire supérieure à celle des fleurs d’arnica, ce qui suggère que les produits contenant la plante entière d’arnica pourraient être plus efficaces pour atténuer les manifestations de l’inflammation aiguë que ceux reposant uniquement sur les fleurs d’arnica.
1. Introduction
Arnica montana est utilisé depuis plusieurs centaines d’années pour traiter diverses affections, notamment les contusions, les plaies, les rhumatismes et l’inflammation. De nombreuses études ont montré la grande valeur médicinale des fleurs d’arnica (Arnicae flos), le plus souvent appliquées sous forme de teinture ou de pommade sur les zones cutanées atteintes. La teinture d’A. montana est principalement produite à partir de fleurs d’arnica par extraction éthanolique. La teinture est desséchée par évaporation et l’extrait (3–30 %) est incorporé à diverses préparations à base de plantes ou à divers produits pharmaceutiques.
A. montana contient un grand nombre de substances biologiquement actives, notamment des lactones sesquiterpéniques, des flavonoïdes et des acides phénoliques. Tandis que les lactones sesquiterpéniques sont à l’origine des propriétés anti-inflammatoires d’A. montana, les flavonoïdes et les acides phénoliques exercent d’importantes activités antioxydantes et antimicrobiennes. La teneur en substances bioactives varie selon les différentes parties de la plante, mais aussi selon la situation géographique, le climat, l’altitude et la maturité du capitule (du bouton à la fleur fanée). Les capitules sont particulièrement riches en lactones sesquiterpéniques, telles que l’hélénaline (jusqu’à 1 % du poids sec), tandis que les racines contiennent des teneurs élevées en thymol, connu pour ses propriétés antioxydantes, antimicrobiennes et anti-inflammatoires.
L’activité anti-inflammatoire des fleurs d’arnica, notamment leur capacité à inhiber la signalisation de NF-κB et les voies médiées en aval par la 5-lipoxygénase (5-LO) et la cyclooxygénase-2 (COX-2), est bien documentée. NF-κB est un médiateur important de la réponse immunitaire et de l’inflammation. Il régule la transcription de gènes pro-inflammatoires tels que l’arachidonate 5-lipoxygénase (ALOX5) et la prostaglandine-endoperoxyde synthase 2 (PTGS2). ALOX5 et PTGS2 codent la 5-LO et la COX-2, qui sont des enzymes clés de la biosynthèse des eicosanoïdes, à savoir respectivement les leucotriènes et les prostaglandines, favorisant ainsi l’inflammation, la douleur et la fièvre. Les leucotriènes et les prostaglandines interviennent directement dans les processus conduisant aux premiers signes d’inflammation, notamment la rougeur, le gonflement (œdème) et la douleur. Alors que la plupart des études ont porté sur les activités anti-inflammatoires des fleurs d’arnica, on sait très peu de choses sur les propriétés anti-inflammatoires de la plante entière d’arnica. Nous avons émis l’hypothèse qu’en raison d’une teneur accrue et plus diversifiée en substances bioactives, les extraits de plante entière d’arnica pourraient exercer des activités anti-inflammatoires supérieures à celles des extraits de fleurs d’arnica.
Dans cette étude, nous avons comparé la capacité de la plante entière et des fleurs d’arnica à inhiber la voie de signalisation de NF-κB et ses messagers (5-LO, COX-2), au moyen d’essais enzymatiques in vitro, d’essais cellulaires et d’un modèle murin d’inflammation in vivo. Nous avons montré que, dans ces essais, la plante entière d’arnica présentait une activité anti-inflammatoire supérieure à celle des fleurs d’arnica. Nos données suggèrent que les produits contenant la plante entière d’arnica pourraient être plus efficaces pour atténuer les symptômes de l’inflammation que ceux reposant uniquement sur les fleurs d’arnica.
2. Résultats
2.1. Composition en lactones sesquiterpéniques et en thymol des extraits de plante entière et de fleurs d’arnica
La teneur en substances biologiquement actives varie selon les différentes parties de la plante d’arnica. Les lactones sesquiterpéniques et le thymol comptent parmi les substances les plus abondantes et les plus bioactives d’Arnica montana. Une analyse préliminaire des extraits de plante entière et de fleurs d’arnica par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem quadripôle-temps de vol (UHPLC-UV-hr-qTOF/MS) a confirmé des différences dans la composition des deux extraits (Figure S1a,b), notamment dans l’abondance relative des lactones sesquiterpéniques et des dérivés du thymol (Figure S1c). Nous avons ensuite quantifié la teneur en lactones sesquiterpéniques et en thymol de cinq préparations indépendantes d’extraits de plante entière et de fleurs d’arnica par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Figure 1). Si la teneur en lactones sesquiterpéniques (somme des dérivés de l’hélénaline et de la dihydrohélénaline détectés) n’était pas significativement différente entre les deux types d’extraits (Figure 1a), le thymol était significativement plus abondant dans la plante entière que dans les fleurs d’arnica (Figure 1b). Une teneur accrue en thymol dans la plante entière par rapport aux fleurs d’arnica était attendue, compte tenu de l’abondance connue du thymol dans les racines de la plante d’arnica.
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Nous avons ensuite cherché à déterminer si les différences de teneur en substances bioactives pouvaient être associées à des différences entre les propriétés anti-inflammatoires des deux types d’extraits. A. montana est bien connu pour sa capacité à inhiber l’activité de NF-κB et de ses effecteurs en aval, la 5-LO et la COX-2. Nous avons donc comparé l’effet inhibiteur de la plante entière et des fleurs d’arnica sur ces voies de signalisation médiées par NF-κB, au moyen de divers modèles in vitro, cellulaires et in vivo.
2.2. Inhibition de l’activation de NF-κB par les extraits de plante entière et de fleurs d’arnica
La capacité de la plante entière et des fleurs d’arnica à inhiber l’activation de NF-κB a été évaluée dans des cellules T lymphocytaires humaines Jurkat transfectées de manière stable avec une construction rapporteur de NF-κB. Les cellules ont été préincubées avec les extraits d’A. montana ou le véhicule pendant 20 min et stimulées par l’ionophore calcique A23187 et le 12-myristate 13-acétate de phorbol (PMA) pendant 4 h. L’activité de NF-κB a été rapportée relativement à celle du témoin véhicule. La plante entière et les fleurs d’arnica ont toutes deux inhibé l’activation de NF-κB de manière dépendante de la concentration, avec une concentration inhibitrice médiane (CI_50) de 15,4 μg/mL pour la plante entière contre 52,5 μg/mL pour les fleurs d’arnica (Figure 2). La comparaison de l’inhibition de NF-κB par la plante entière et les fleurs d’arnica a montré que l’inhibition par la plante entière était significativement supérieure à celle produite par les fleurs aux concentrations d’extrait de 30 et 100 μg/mL (p < 0,0001 et p < 0,001, respectivement) (Figure 2).
Comme témoin positif, la cyclosporine A a inhibé l’activation de NF-κB avec une CI_50 de 6,79 nM (Figure S2a). Nous avons également vérifié que l’effet inhibiteur des extraits d’A. montana n’était pas dû à une cytotoxicité (Figure S2b,c).
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2.3. Inhibition de l’expression des gènes ALOX5 et PTGS2 par la plante entière et les fleurs d’arnica
Nous avons ensuite évalué l’effet de la plante entière et des fleurs d’arnica sur l’expression des gènes cibles de NF-κB ALOX5 et PTGS2. ALOX5 et PTGS2 codent les enzymes 5-LO et COX-2, qui initient respectivement la conversion de l’acide arachidonique en leucotriènes et en prostaglandines. L’expression d’ALOX5 et de PTGS2 a été étudiée dans des macrophages THP-1 différenciés et stimulés par le LPS, utilisés comme système expérimental. Des cellules monocytaires humaines THP-1 ont été différenciées en macrophages avec du PMA pendant 72 h, prétraitées par la plante entière ou les fleurs d’arnica (ou le véhicule) pendant 4 h, puis stimulées par le LPS pendant 24 h. L’expression d’ALOX5 et de PTGS2 a été mesurée par RT-PCR quantitative (Figure 3). L’expression des deux gènes a été inhibée par les extraits d’A. montana de manière dépendante de la concentration, quoique dans des proportions différentes. Si l’expression d’ALOX5 a été inhibée de manière comparable par la plante entière et les fleurs d’arnica (Figure 3a), l’expression de PTGS2 a été préférentiellement inhibée par la plante entière (Figure 3b). En outre, tandis que les extraits d’A. montana inhibaient à la fois l’expression d’ALOX5 induite par le LPS et son expression basale (Figure 3a), la plante entière d’arnica n’inhibait que l’expression de PTGS2 induite par le LPS (inhibition de 68 % au-dessus de la valeur basale par rapport au témoin véhicule ; Figure 3b) dans les macrophages différenciés. Point important, l’inhibition de l’expression génique par les extraits d’A. montana n’était pas due à des effets cytotoxiques (Figure S3).
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2.4. Inhibition in vitro de l’activité enzymatique de la 5-LO et de la COX-2 par la plante entière et les fleurs d’arnica
Il a été montré que l’activité enzymatique des protéines 5-LO et COX-2, codées par les gènes ALOX5 et PTGS2, était directement inhibée par des composés naturels, notamment par les lactones sesquiterpéniques d’A. montana. Nous avons donc étudié l’activité inhibitrice potentielle de la plante entière et des fleurs d’arnica sur l’activité enzymatique des protéines purifiées 5-LO et COX-2 dans des essais enzymatiques acellulaires. Les protéines recombinantes humaines 5-LO et COX-2 ont été préincubées avec les extraits d’A. montana et leur activité enzymatique a été mesurée après l’ajout d’acide arachidonique comme substrat (Figure 4). La plante entière et les fleurs d’arnica ont toutes deux inhibé l’activité enzymatique de la 5-LO (Figure 4a) et de la COX-2 (Figure 4b) de manière dépendante de la concentration. Dans les deux cas, la CI_50 de la plante entière d’arnica était inférieure à celle des fleurs (respectivement 8,2 μg/mL contre 47,8 μg/mL pour la 5-LO [Figure 4a] et 5,5 μg/mL contre 33,1 μg/mL pour la COX-2 [Figure 4b]). La comparaison de l’inhibition enzymatique par la plante entière et les fleurs d’arnica a montré que l’inhibition par la plante entière était significativement supérieure à celle produite par les fleurs à la plupart des concentrations testées (p < 0,01, p < 0,001 ou p < 0,0001) (Figure 4).
L’inhibition de l’activité enzymatique in vitro par des inhibiteurs bien caractérisés (NDGA pour la 5-LO et rofécoxib pour la COX-2), utilisés comme témoins positifs, a présenté les valeurs de CI_50 attendues (Figure S4).
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2.5. Inhibition de la libération de métabolites de l’acide arachidonique (eicosanoïdes) par des cellules primaires humaines sous l’effet de la plante entière et des fleurs d’arnica
Après avoir détecté un effet inhibiteur des extraits d’A. montana sur l’expression des gènes codant la 5-LO et la COX-2 (Figure 3) ainsi que sur leur activité enzymatique in vitro (Figure 4), nous avons ensuite cherché à savoir si ces effets inhibiteurs se reflétaient dans leur activité enzymatique cellulaire au sein de leucocytes polymorphonucléaires (PMNL) et de monocytes primaires humains. Ces cellules sont des productrices majeures de métabolites pro-inflammatoires de l’acide arachidonique (eicosanoïdes) et constituent, à ce titre, d’importants médiateurs de l’inflammation in vivo. Les PMNL et les monocytes ont été isolés à partir du sang périphérique de personnes en bonne santé. Les cellules fraîchement isolées ont été préincubées pendant 15 min avec des extraits de plante entière ou de fleurs d’arnica (ou le véhicule), puis stimulées soit par l’ionophore calcique A23187 en présence d’acide arachidonique pendant 10 min (PMNL), soit par le LPS pendant 6 h (monocytes). Les métabolites de l’acide arachidonique libérés dans les surnageants des cultures cellulaires ont été analysés et quantifiés par des méthodes de chromatographie liquide. Les produits de la 5-LO, le leucotriène B_4 (LTB_4) et ses isomères trans, ainsi que l’acide 5-hydroxyeicosatétraénoïque (5-HETE), ont été quantifiés dans les surnageants des PMNL (Figure 5a), et le produit de la COX-2, la prostaglandine E_2 (PGE_2), a été mesuré dans les surnageants des monocytes (Figure 5b). Le traitement des PMNL primaires humains par la plante entière d’arnica a entraîné une inhibition de la libération des produits de la 5-LO plus forte que le traitement par les fleurs d’arnica, avec une CI_50 de 59,3 μg/mL pour la plante entière contre > 300 μg/mL pour les fleurs (Figure 5a). L’inhibition par la plante entière était significativement supérieure à celle produite par les fleurs pour des concentrations d’extrait ≥ 18,8 μg/mL (p < 0,05 à p < 0,001) (Figure 5a). En revanche, la plante entière et les fleurs d’arnica ont inhibé de manière comparable la libération de PGE_2 par les monocytes stimulés par le LPS, avec des CI_50 respectives de 87,4 μg/mL et de 70,9 μg/mL (Figure 5b). Les inhibiteurs de référence (zileuton pour la 5-LO et indométacine pour la COX-2), testés en parallèle, ont produit, comme attendu, une forte inhibition de la libération des métabolites de l’acide arachidonique (Figure S5a,b). L’inhibition médiée par les extraits d’A. montana dans cet intervalle de concentrations (jusqu’à 75 μg/mL) n’était pas due à une cytotoxicité (Figure S5c,d). Il convient de noter qu’une toxicité partielle a été observée dans les monocytes à une concentration de 300 μg/mL de plante entière ou de fleurs d’arnica (Figure S5c).
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2.6. Inhibition des symptômes de l’inflammation par la plante entière et les fleurs d’arnica dans un modèle murin d’œdème de la patte induit par la carraghénane
La carraghénane est un agent pro-inflammatoire bien établi utilisé pour déclencher une réponse inflammatoire aiguë après injection dans le coussinet plantaire de rongeurs. Ce modèle animal d’œdème de la patte induit par la carraghénane est le système expérimental de choix pour évaluer l’effet anti-inflammatoire de médicaments ou de produits naturels tels que les extraits d’A. montana. Nous avons étudié les propriétés anti-inflammatoires de la plante entière et des fleurs d’arnica après trois applications topiques consécutives (de 1 mg, 3 mg ou 10 mg par souris, chacune) sur la patte postérieure droite de souris ICR, avant l’injection intraplantaire de carraghénane. Le véhicule a servi de témoin négatif pour l’inhibition de l’œdème. L’aspirine administrée par voie orale (150 mg/kg) avant l’injection de carraghénane a servi de témoin positif (inhibiteur de référence). Au total, quarante-huit souris réparties en huit groupes de traitement (six souris par groupe) ont été incluses dans cette analyse. Le gonflement de la patte a été mesuré 4 h après l’injection de carraghénane (Figure 6). L’application topique des extraits de plante entière et de fleurs d’arnica a entraîné une réduction du gonflement de la patte dépendante de la dose par rapport au témoin véhicule. L’inhibition maximale de l’œdème de la patte a été observée avec trois applications de 10 mg d’extrait d’A. montana, avec une réduction du gonflement de la patte, par rapport au véhicule, de 85 % pour la plante entière et de 62 % pour les fleurs. En comparaison, une dose orale unique d’aspirine (150 mg/kg) a réduit le gonflement de la patte de 47 % par rapport au véhicule (Figure 6). La réduction de l’œdème de la patte par la plante entière d’arnica était statistiquement significative (par rapport au véhicule) même à la dose appliquée la plus faible de 3 × 1 mg/souris (p < 0,05), tandis que la différence par rapport au véhicule aux doses plus élevées d’extraits d’A. montana était significative tant pour la plante entière que pour les fleurs d’arnica (p < 0,001) (Figure 6). La comparaison du gonflement de la patte aux doses respectives de plante entière et de fleurs d’arnica a montré un gonflement significativement réduit avec 3 × 3 mg de plante entière par rapport aux fleurs d’arnica par souris (#, p < 0,05) (Figure 6).
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3. Discussion
Si l’activité anti-inflammatoire des fleurs d’arnica est bien décrite dans la littérature, les données sur la plante entière d’arnica sont rares. Cette étude a comparé les propriétés anti-inflammatoires de la plante entière à celles des fleurs d’arnica au moyen de divers essais in vitro et in vivo.
Nous avons montré que, dans la plupart des modèles d’inflammation étudiés, la plante entière et les fleurs d’arnica exerçaient toutes deux des fonctions inhibitrices à l’égard des cibles pro-inflammatoires testées et que la plante entière était un inhibiteur plus puissant que les fleurs (CI_50 inférieure). La plante entière d’arnica a inhibé l’activation de NF-κB dans un essai rapporteur et l’expression, induite par le LPS, des gènes cibles de NF-κB ALOX5 et PTGS2 dans des cellules THP-1 différenciées (Figure 7). L’activité enzymatique des protéines codées par ALOX5 et PTGS2 (respectivement la 5-LO et la COX-2) a également été directement inhibée par la plante entière d’arnica dans un essai acellulaire, ce qui démontre un second niveau d’inhibition en aval de l’activation de NF-κB (Figure 7). L’inhibition de l’activité enzymatique de la 5-LO et de la COX-2 a été confirmée dans des cellules primaires humaines, comme en témoigne la réduction de la libération des métabolites pro-inflammatoires de l’acide arachidonique, les leucotriènes et les prostaglandines, dans des cellules prétraitées par la plante entière d’arnica (Figure 7). Enfin, l’application topique de plante entière d’arnica (et de fleurs d’arnica) a partiellement empêché le gonflement de la patte dans un modèle murin d’œdème de la patte induit par la carraghénane (Figure 7). L’activité anti-œdémateuse de l’arnica concorde avec son effet inhibiteur sur la production de leucotriènes et de prostaglandines, qui interviennent tous deux directement dans la formation de l’œdème. Nos résultats confirment donc les activités anti-inflammatoires attribuées aux fleurs d’arnica, tout en démontrant — à notre connaissance, pour la première fois — que la plante entière d’arnica présente des activités anti-inflammatoires supérieures en raison de son interférence avec la voie inflammatoire NF-κB–eicosanoïdes. Les propriétés anti-inflammatoires supérieures de la plante entière d’arnica sont probablement dues à la teneur accrue et plus diversifiée en substances biologiquement actives de la plante entière, comparativement aux seules fleurs. L’effet inhibiteur plus marqué de la plante entière d’arnica sur la libération des leucotriènes dans les PMNL et son effet anti-œdémateux plus important dans le modèle murin d’inflammation induite par la carraghénane suggèrent que l’inflammation médiée par les leucotriènes pourrait constituer une cible majeure de l’activité anti-inflammatoire de la plante entière d’arnica, comparativement aux fleurs d’arnica.
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Outre les activités anti-inflammatoires, nous avons également mis en évidence un effet inhibiteur inattendu de la plante entière d’arnica sur l’expression basale d’ALOX5 dans les cellules THP-1 différenciées. Cet effet a également été observé après traitement par les fleurs d’arnica. Les facteurs de transcription responsables de l’expression basale d’ALOX5 dans les cellules THP-1 différenciées que les extraits d’A. montana ciblent pour les inhiber restent à déterminer. Des études antérieures ont indiqué que des motifs consensus de liaison en tandem pour les facteurs de transcription Egr-1/Sp1 au sein du promoteur central d’ALOX5 sont essentiels à son activité basale. Des études supplémentaires seraient nécessaires pour déterminer si les facteurs de transcription Egr-1/Sp1 sont inhibés par les extraits d’A. montana.
Il est intéressant de noter que, si l’expression de PTGS2 induite par le LPS dans les cellules THP-1 différenciées a été inhibée par la plante entière d’arnica de manière dépendante de la concentration, elle n’a pas été affectée par le prétraitement avec les fleurs d’arnica. Cela suggère que certaines substances bioactives présentes dans la plante entière, mais pas dans les fleurs d’arnica, étaient responsables de cette inhibition. De fait, la teneur en substances bioactives varie entre les différentes parties de la plante, comme l’ont confirmé nos expériences préliminaires par HPLC. Il reste à déterminer si le thymol, détecté en quantité plus élevée dans la plante entière que dans les fleurs d’arnica et connu pour ses propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et antimicrobiennes, ou si d’autres substances présentes dans la plante entière d’arnica sont responsables de l’inhibition de PTGS2 induite par le LPS dans les cellules THP-1 différenciées.
Il convient de noter que, bien qu’ALOX5 et PTGS2 aient été décrits comme des cibles de NF-κB, nous n’avons pas démontré que l’expression de ces gènes induite par le LPS dans les cellules THP-1 différenciées était effectivement médiée par NF-κB. En fait, une étude récente a montré que l’expression d’ALOX5 induite par le LPS dans les cellules THP-1 différenciées ne fait pas intervenir NF-κB, mais un facteur encore non caractérisé. Si l’expression de PTGS2 induite par le LPS dans ces cellules est, elle aussi, indépendante de NF-κB, cela expliquerait l’absence d’inhibition par les fleurs d’arnica de l’expression de PTGS2 induite par le LPS. Quel que soit le mécanisme d’induction de ces gènes en réponse au LPS, nos résultats soulignent la différence entre l’effet inhibiteur de la plante entière et celui des fleurs d’arnica.
L’un des points forts de notre étude est l’utilisation de différents systèmes expérimentaux in vitro et in vivo comparant directement des extraits de plante entière et de fleurs préparés à partir de la même source d’A. montana et selon le même procédé d’extraction. Les données obtenues dans le modèle murin d’inflammation aiguë avec un mode d’application comparable à celui généralement employé chez l’être humain (application topique) sont très intéressantes et devraient désormais être reproduites chez l’être humain. Il convient de noter que la dose d’extrait appliquée localement dans le modèle murin se situait dans un intervalle comparable à celui recommandé pour les pommades à l’arnica existantes (par exemple la pommade à 30 % de plante entière d’arnica, disponible en Allemagne). Si l’on considère une application moyenne recommandée de 2 mg/cm^2, trois à cinq fois par jour, une quantité de 1,8 à 3 mg de plante entière d’arnica serait appliquée localement avec une pommade à l’arnica à 30 % (contre 3 à 30 mg de plante entière d’arnica appliqués dans le modèle murin d’inflammation aiguë décrit dans cette étude). Outre la validation de son utilisation pour prévenir l’inflammation locale (c’est-à-dire selon un protocole de prétraitement, tel que décrit dans cette étude), il serait également intéressant d’évaluer le bénéfice potentiel d’une application topique de plante entière d’arnica pour traiter une inflammation locale (c’est-à-dire après l’induction de l’inflammation), comme cela a été montré pour d’autres produits naturels dans le modèle murin d’œdème de la patte.
4. Matériel et méthodes
4.1. Extraits de plante entière et de fleurs d’Arnica montana
La préparation d’extraits secs de plante entière et de fleurs d’Arnica montana L., cultivé selon l’agriculture biologique en Allemagne sur des parcelles consacrées à la culture de plantes médicinales, a été réalisée à partir d’extraits liquides de plante entière fraîche ou de fleurs fraîches d’arnica (Arnicae planta tota recens, extrait éthanolique 1:1,1, éthanol à 30 % [m/m] et Arnicae flos recens, extrait éthanolique 1:1,1, éthanol à 30 % [m/m]). Les extraits secs de plantes ont été dissous dans un mélange de 50 % d’éthanol et de 50 % d’eau purifiée (m/m), donnant une solution mère à 30 mg/mL. La suspension a été agitée au vortex pendant 10 min et soumise aux ultrasons pendant 30 min, avec des agitations occasionnelles au vortex. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 min à 3 000 × g. Le surnageant a été recueilli avec précaution et utilisé pour les expériences. Sauf indication contraire, un mélange de 50 % d’éthanol et de 50 % d’eau purifiée (m/m), dilué jusqu’à une concentration finale de 0,5 % d’éthanol, a servi de témoin véhicule dans les essais correspondants.
4.2. Caractérisation des extraits d’A. montana par HPLC
4.2.1. Composition et analyse semi-quantitative des extraits d’A. montana
La composition des extraits de plante entière et de fleurs d’arnica a été évaluée par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem quadripôle-temps de vol (UHPLC-UV-hr-qTOF/MS). Chaque échantillon a été mesuré en triplicats techniques. Au total, 100 mg de chaque extrait sec ont été dissous dans 10 mL d’un mélange acétonitrile:eau 1:1, v:v, contenant 1 % d’acide formique, agités au vortex pendant 2 min et soumis aux ultrasons pendant 15 min. Enfin, une dilution au 1:50 v:v de chaque extrait a été réalisée dans un mélange acétonitrile:eau 1:1, v:v, contenant 1 % d’acide formique, puis soumise à l’analyse instrumentale.
La séparation chromatographique a été effectuée sur un appareil Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis), à l’aide d’une colonne RRHD Zorbax C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). La phase mobile était constituée d’acétonitrile (B) et d’acide formique à 0,1 % dans l’eau (A). Le débit était de 0,4 mL/min et le volume d’injection de 5 μL. Le four de la colonne était réglé à 45 °C. Le gradient suivant a été utilisé : 0,0 min, 3 % B ; 15,0 min, 50 % B ; 18,0 min, 80 % B ; 19 min, 100 % B ; 21,0 min, 100 % B ; 21,5 min, 3 % B ; et 23 min, 3 % B.
L’éluat de la chromatographie liquide a été introduit directement dans le spectromètre de masse TOF-MS à ultra-haute résolution maXis Impact (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne), avec un balayage de masse de 50 à 800 m/z et une fréquence d’acquisition des spectres de 4 Hz, en utilisant une ionisation par électronébulisation (ESI) en mode positif. L’exactitude de masse avant chaque analyse a été vérifiée par comparaison avec les adduits de formiate de sodium. Les exactitudes de masse ont été arrondies à 1 mDa et les temps de rétention correspondants à 0,05 min. Les spectres UV ont été enregistrés à 280 nm. L’interprétation des signaux de masse a été réalisée à l’aide du logiciel Compass Data Analysis 4.2 (Bruker, Billerica, MA, États-Unis). L’identification des lactones sesquiterpéniques et des dérivés du thymol détectés a été effectuée à partir de la littérature publiée, et leur transition caractéristique ainsi que leur abondance relative ont été déterminées d’après l’aire du pic correspondant.
4.2.2. Quantification de la teneur en lactones sesquiterpéniques et en thymol des extraits d’A. montana
La teneur en lactones sesquiterpéniques et en thymol des extraits de plante entière et de fleurs d’arnica a été quantifiée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), à partir de cinq lots indépendants de préparation d’extrait pour chacun d’eux. Chaque mesure HPLC a été réalisée en double.
Pour la quantification des lactones sesquiterpéniques, une méthode HPLC modifiée, adaptée de la monographie « Teinture d’arnica » de la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) 10.0/1809, a été utilisée comme suit. Les extraits secs d’arnica (0,1 g) ont été dissous dans 5 mL d’éthanol R2 à 30 % (m/m) et mélangés à 1 mL de solution d’étalon interne (1 mg/mL de santonine [substance chimique de référence, Direction européenne de la qualité du médicament et soins de santé (EDQM), Conseil de l’Europe, Strasbourg, France], 2 mg/mL de 4-hydroxybenzoate de butyle R dans du méthanol R2) et à 3 g d’oxyde d’aluminium anhydre R. Le mélange a été agité pendant 120 s, filtré sur papier filtre et évaporé à sec sous pression réduite dans un bain-marie. Le résidu desséché a été dissous dans 2 mL d’un mélange de 50 % de méthanol R2 et de 50 % d’eau R de qualité chromatographique, puis filtré à travers une membrane en PVDF de 0,45 μm. L’analyse HPLC a été effectuée sur un système HPLC Ultimate 3000 RSLC 02 équipé d’un détecteur UV (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis), à l’aide d’une colonne Symmetry C18 (longueur de 150 mm × diamètre intérieur de 3,9 mm, taille des particules de 5 μm ; Waters). Le volume d’injection était de 20 μL, le débit de 1,0 mL/min, la température de la colonne était maintenue à 22 °C et la longueur d’onde de détection pour la quantification était réglée à 225 nm. La phase mobile de la chromatographie était constituée d’eau distillée R (A) et de méthanol R2 (B). Après équilibrage de la colonne dans 40 % de méthanol pendant 5 min, la séparation a été obtenue par élution en gradient, en faisant passer linéairement le méthanol de 40 % à 45 % sur 17 min, puis en maintenant cette concentration pendant 10 min, avant un second gradient faisant passer le méthanol de 45 % à 55 % sur 25 min. La colonne a ensuite été lavée en portant le méthanol à 90 % en 1 min, concentration maintenue pendant 1 min supplémentaire, avant un rééquilibrage aux conditions initiales de la phase mobile (40 % de méthanol dans de l’eau R de qualité chromatographique). Le temps de rétention était d’environ 10 min pour la santonine et d’environ 49 min pour le 4-hydroxybenzoate de butyle. Les données ont été interprétées à partir de la détermination de l’aire des pics (somme des pics des dérivés de l’hélénaline et de la dihydrohélénaline situés entre les substances de référence santonine et 4-hydroxybenzoate de butyle) et de l’étalon interne de santonine, au moyen du logiciel Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). La teneur en lactones sesquiterpéniques a été calculée d’après l’aire des pics de la santonine et du tiglate de dihydrohélénaline, au moyen du facteur de conversion 1,187 recommandé par la Ph. Eur. 10.0/1809. Les données (moyenne ± ET de la quantification de cinq lots d’analyte, chacune exprimée comme moyenne de mesures en double) ont été exprimées en mg de lactones sesquiterpéniques/100 g d’extrait d’arnica.
Pour la quantification du thymol, les extraits secs d’arnica (0,05 g) ont été dissous dans du méthanol R2 à 50 %, mélangés à 0,8 mL de solution d’étalon interne (1 mg/mL de carvacrol [étalon primaire de référence, Sigma-Aldrich/Merck, 04270590, Darmstadt, Allemagne] dans du méthanol R2), puis dilués à 100 mL avec du méthanol R2 à 50 %. Le mélange a été filtré à travers une membrane en PVDF de 0,45 μm. Une solution contenant 0,2 μg/mL de thymol (étalon primaire de référence, PhytoLab, 89287, Vestenbergsgreuth, Allemagne) dans du méthanol R2 à 50 % a également été mesurée comme étalon de référence. L’analyse HPLC a été effectuée sur un système HPLC Ultimate 3000 RSLC 02 équipé d’un détecteur à fluorescence RF-20A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis), à l’aide d’une colonne SunFire C18 (longueur de 150 mm × diamètre intérieur de 3,0 mm, taille des particules de 3,5 μm ; Waters). Le volume d’injection était de 10 μL, le débit de 1,0 mL/min, la température de la colonne était maintenue à 30 °C et la détection a été réalisée à 280 nm/310 nm. La phase mobile de la chromatographie était constituée d’acide trifluoroacétique R à 0,1 % (A) et d’acétonitrile R2 de qualité chromatographique (B). Après équilibrage dans 40 % d’acétonitrile (B)/60 % d’acide trifluoroacétique à 0,1 % (A) pendant 2 min, la séparation a été obtenue par élution en gradient, en faisant passer linéairement l’acétonitrile de 40 % à 65 % sur 8 min. La colonne a ensuite été lavée en portant l’acétonitrile à 95 % en 2 min, concentration maintenue pendant 3 min supplémentaires, avant un rééquilibrage aux conditions initiales de la phase mobile. Le temps de rétention était d’environ 9,0 min pour le carvacrol et d’environ 9,6 min pour le thymol. Les données ont été interprétées d’après la hauteur des pics en appliquant une correction par étalon interne, au moyen du logiciel Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). La teneur en thymol des extraits d’arnica a été calculée d’après l’étalon externe de référence du thymol. Les données (moyenne ± ET de la quantification des cinq lots d’analyte) ont été exprimées en mg de thymol/100 g d’extrait d’arnica.
4.3. Essai rapporteur de NF-κB
L’effet inhibiteur de la plante entière et des fleurs d’arnica sur l’activité de NF-κB a été mesuré au moyen d’un essai rapporteur de NF-κB (Eurofins Panlabs no 361000-1, New Taipei City, Taïwan). En bref, des cellules T lymphocytaires humaines Jurkat (2 × 10^6 cellules/mL), transfectées de manière stable avec une construction comprenant un élément de réponse à NF-κB contrôlant la transcription du gène rapporteur de la bêta-galactosidase (Eurofins Panlabs Taiwan no C13900, New Taipei City, Taïwan), ont été préincubées pendant 20 min avec des concentrations croissantes (3–300 μg/mL dans une concentration finale d’éthanol de 0,5 %) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %), dans un tampon RPMI-1640 à pH 7,4 et à 37 °C (deux puits par condition). Des concentrations croissantes (3–300 nM) de cyclosporine A (Sigma-Aldrich/Merck C3662, Darmstadt, Allemagne), servant de témoin positif pour l’inhibition de NF-κB, ont été testées en parallèle. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 4 h avec 0,5 μM d’ionophore calcique A23187 et 50 ng/mL de 12-myristate 13-acétate de phorbol (PMA), puis recueillies afin de quantifier l’activité du gène rapporteur. L’activité du gène rapporteur de la bêta-galactosidase a été déterminée par la conversion du di-β-D-galactopyranoside de fluorescéine (FDG ; ThermoFisher Scientific, F1179, Waltham, MA, États-Unis) en fluorescéine, et l’intensité de fluorescence a été mesurée sur un lecteur de plaques SpectroFluor Plus. Une diminution ≥ 50 % de l’intensité de fluorescence par rapport à 10 μM de cyclosporine A indique une activité inhibitrice significative. Les données (moyenne ± ET du traitement cellulaire en double) ont été exprimées en pourcentage d’inhibition du rapporteur par rapport au véhicule, et la concentration inhibitrice médiane (CI_50) de la plante entière et des fleurs d’arnica a été calculée.
Des essais de cytotoxicité ont été réalisés en triplicat dans les mêmes conditions expérimentales, afin de contrôler la spécificité de l’inhibition de NF-κB. La staurosporine (Sigma-Aldrich/Merck S4400, Darmstadt, Allemagne ; 0,001–100 μg/mL) a été testée en parallèle (en double) comme témoin positif de cytotoxicité. Après la stimulation cellulaire, le réactif CellTiter-Glo (CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, Madison, WI, États-Unis) a été ajouté dans chaque puits, et la luminescence a été mesurée sur un lecteur de microplaques Safire2 (Tecan, Männedorf, Suisse). Le réactif CellTiter-Glo mesure la quantité d’ATP présente dans le puits de culture cellulaire. L’ATP est un indicateur des cellules métaboliquement actives et sa quantité est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé par rapport au témoin véhicule.
4.4. Analyse de l’expression des gènes ALOX5 et PTGS2 par RT-PCR quantitative
4.4.1. Différenciation et stimulation des cellules THP-1
Des cellules leucémiques monocytaires humaines THP-1 (American Type Culture Collection [ATCC] no TIB-202, Manassas, VA, États-Unis) ont été ensemencées dans une plaque à 48 puits et incubées dans du milieu de culture (RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine) pendant 4 h. Les cellules ont été différenciées en macrophages par l’ajout de 200 nM de PMA dans le milieu de culture pendant 72 h. Le milieu contenant le PMA a été remplacé par du milieu frais, et les cellules différenciées ont été prétraitées pendant 4 h avec les concentrations indiquées de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %) comme témoin. Les cellules (trois puits par condition) ont ensuite été stimulées pendant 24 h avec 100 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS).
4.4.2. Essai de contrôle de la cytotoxicité
Des essais de cytotoxicité ont été réalisés en triplicat dans les mêmes conditions expérimentales. Après la stimulation, les cellules ont été incubées avec du WST-8 (CCK-8 no 311KTA1020, Tebubio, Le Perray, France) et la densité optique a été mesurée à 450 nm avec un spectrophotomètre VERSAmax (Molecular Devices, San José, CA, États-Unis). Le WST-8 est un sel de tétrazolium qui est réduit en un colorant formazan jaune par la succinate déshydrogénase mitochondriale (un indicateur des cellules métaboliquement actives). La formation du produit formazan est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes et à leur activité métabolique. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé par rapport à la condition stimulée par le LPS.
4.4.3. Isolement de l’ARN et RT-PCR quantitative
Après la stimulation par le LPS, les cellules ont été recueillies et conservées à −80 °C jusqu’à l’isolement de l’ARN. L’ARN total a été isolé à l’aide du réactif d’isolement TriPure^® (Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne) conformément aux instructions du fournisseur. La qualité de l’ARN a été vérifiée par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis) et sa concentration a été mesurée par spectrophotométrie (Synergy H1, BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). L’ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé par transcription inverse de l’ARN total en présence d’oligo(dT) au moyen de la transcriptase inverse Transcriptor (Roche, Bâle, Suisse). La PCR quantitative a été réalisée avec le prémélange ONEGreen^® FAST qPCR (Ozyme, Saint-Cyr-l’École, France), conformément aux instructions du fabricant, et les réactions en triplicat ont été effectuées sur un système LightCycler^® 480 (Roche Molecular System Inc., Pleasanton, CA, États-Unis), selon un protocole en deux étapes (95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 34 s ; 45 cycles). Les amorces sens et antisens utilisées pour l’amplification d’ALOX5 (NM_000698), de PTGS2 (NM_000963) et du gène normalisateur GAPDH (NM_002046) ont été conçues à l’aide de Primer3 et de NCBI Blast, puis commandées auprès de Sigma-Aldrich/Merck (Darmstadt, Allemagne). Les séquences respectives (5′–3′) des amorces sens et antisens étaient les suivantes : ALOX5, TCATCGTGGACTTTGAGCTG et CAGAAGGTGGGTGATGGTCT ; PTGS2, TGAGCATCTACGGTTTGCTG et TGCTTGTCTGGAACAACTGC ; GAPDH, GGCTCTCCAGAACATCATCCCTGC et GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGAGG. Les valeurs du cycle seuil (Ct) ont été exprimées en unités arbitraires (UA) selon la formule : UA = (1/2^Ct) × 10^6. Les UA des gènes d’intérêt ALOX5 et PTGS2 (UA_GI) ont été normalisées par rapport à celles du gène domestique GAPDH (UA_GAPDH), selon la formule UA_GI/UA_GAPDH, et les données d’expression d’ALOX5 et de PTGS2 ont été exprimées en pourcentage de l’expression génique par rapport à celle du témoin stimulé par le LPS.
4.5. Essais enzymatiques in vitro de la 5-LO et de la COX-2
L’effet inhibiteur de la plante entière et des fleurs d’arnica sur l’activité enzymatique de la 5-lipoxygénase humaine (5-LO) et de la cyclooxygénase-2 humaine (COX-2) a été évalué au moyen d’essais enzymatiques acellulaires (respectivement Eurofins Cerep no 772, Celle-Lévescault, France, et Eurofins Panlabs no 118030, New Taipei City, Taïwan).
Pour l’essai enzymatique de la 5-LO, 2,4 U/mL de protéine 5-LO humaine recombinante purifiée ont été préincubés en double avec des concentrations croissantes (1,2–300 μg/mL) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %), pendant 15 min à 25 °C dans un tampon Tris à pH 7,4. L’acide nordihydroguaiarétique (NDGA ; Cayman Chemical 70,300-1, Ann Arbor, MI, États-Unis ; 0,01–30 µM) a servi d’inhibiteur témoin. La réaction enzymatique de la 5-LO a été réalisée pendant 5 min à 25 °C en présence de 25 µM d’acide arachidonique (Biomol Cay90010-100, Hambourg, Allemagne) comme substrat, et de dihydrorhodamine 123 non fluorescente. L’activité enzymatique de la 5-LO a été mesurée par spectroscopie de fluorescence à 500 nm/590 nm de la rhodamine 123 produite par la conversion de la dihydrorhodamine 123 médiée par la 5-LO.
Pour l’essai enzymatique de la COX-2, 34 U/mL de protéine COX-2 humaine recombinante purifiée ont été préincubés en double avec des concentrations croissantes (1,2–300 μg/mL) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %), pendant 15 min à 25 °C dans un tampon Tris-HCl modifié à pH 8,0. Le rofécoxib (Glentham Life Sciences GP0159, Corsham, Royaume-Uni ; 0,03–3 µM) a servi d’inhibiteur témoin. La réaction enzymatique de la COX-2 a été déclenchée par l’ajout de 3 µM d’acide arachidonique comme substrat et de 100 µM d’Amplifu Red (10-acétyl-3,7-dihydroxyphénoxazine), puis incubée pendant 3 min supplémentaires à 25 °C. L’activité enzymatique de la COX-2 a été analysée par spectroscopie de fluorescence à 535 nm/590 nm de la résorufine produite par l’oxydation d’Amplifu Red catalysée par la COX-2.
Les mesures ont été réalisées en double et les données ont été exprimées en pourcentage d’inhibition enzymatique par rapport au véhicule. Les valeurs de CI_50 ont été calculées pour la plante entière et les fleurs d’arnica, ainsi que pour les inhibiteurs de référence, l’acide nordihydroguaiarétique (essai de la 5-LO) et le rofécoxib (essai de la COX-2).
4.6. Libération des produits de la 5-LO et de la COX-2 par des cellules humaines du sang périphérique
L’effet inhibiteur de la plante entière et des fleurs d’arnica sur la formation des produits de la 5-LO et de la COX-2 a été étudié dans des essais cellulaires.
4.6.1. Formation des produits de la 5-LO
Pour l’analyse de la formation des produits de la 5-LO, des leucocytes polymorphonucléaires (PMNL) ont été fraîchement isolés à partir du sang périphérique de deux donneurs sains consentants (Institut de médecine transfusionnelle, Hôpital universitaire d’Iéna, Allemagne), qui avaient déclaré ne pas avoir pris de médicaments anti-inflammatoires au cours des 10 jours précédant le prélèvement sanguin, comme décrit précédemment. Le protocole expérimental a été approuvé par le comité d’éthique de l’Hôpital universitaire d’Iéna et toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Les PMNL (5 × 10^6/mL) ont été préincubés avec des concentrations croissantes (1,2–300 μg/mL) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %), pendant 15 min à 37 °C, puis stimulés avec 2,5 µM d’ionophore de Ca^2+ A23187 (Biomol Cay11016-10, Hambourg, Allemagne) en présence de 20 µM d’acide arachidonique (Biomol Cay90010-100, Hambourg, Allemagne), comme substrat de la 5-LO, pendant 10 min à 37 °C. Le zileuton, inhibiteur spécifique de la 5-LO (Biosynth Ltd. FZ28760, Staad, Suisse ; 15 µM), a été utilisé comme composé de référence. Les produits de la 5-LO, le LTB_4, ses isomères trans et le 5-HETE, libérés dans le surnageant ont été analysés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC), comme indiqué précédemment, leur somme définissant les produits de la 5-LO. Les données (moyenne ± ET de deux donneurs) ont été exprimées en pourcentage des produits de la 5-LO libérés par rapport au témoin véhicule.
4.6.2. Formation du produit de la COX-2 (PGE_2)
Pour l’analyse de la formation du produit de la COX-2, des monocytes ont été fraîchement isolés à partir du sang périphérique de trois donneurs sains consentants (Institut de médecine transfusionnelle, Hôpital universitaire d’Iéna, Allemagne), qui avaient déclaré ne pas avoir pris de médicaments anti-inflammatoires au cours des 10 jours précédant le prélèvement sanguin, comme décrit précédemment. Le protocole expérimental a été approuvé par le comité d’éthique de l’Hôpital universitaire d’Iéna et toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Les cellules (1 × 10^6/mL) ont été préincubées avec des concentrations croissantes (1,2–300 μg/mL) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, ou avec le véhicule (éthanol à 0,5 %), pendant 15 min à 37 °C, puis stimulées avec 100 ng/mL de LPS pendant 6 h. L’indométacine (Sigma-Aldrich/Merck I7378, Darmstadt, Allemagne ; 10 µM) a été utilisée comme inhibiteur de référence. Les surnageants des cultures cellulaires des trois donneurs ont été recueillis et le produit de la COX-2 libéré, la PGE_2, a été analysé par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS), comme indiqué précédemment. Les données (moyenne ± ET de trois donneurs) ont été exprimées en pourcentage de PGE_2 libérée par rapport au témoin véhicule.
Afin de vérifier que l’effet des extraits d’arnica n’était pas dû à une cytotoxicité au cours des 6 h d’incubation, l’activité de la déshydrogénase mitochondriale a été mesurée dans des conditions expérimentales comparables au moyen d’un essai reposant sur le MTT. En bref, les monocytes ont été préincubés avec des concentrations croissantes (1,2–300 μg/mL) d’extrait de plante entière ou de fleurs d’arnica, avec de l’éthanol à 0,5 % (véhicule) ou avec 10 µM d’indométacine (témoin d’inhibition) pendant 15 min à 37 °C, puis stimulés avec 100 ng/mL de LPS pendant 6 h, comme ci-dessus. Après la stimulation, du bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT ; Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne) a été ajouté dans chaque puits pendant 2 h. Un puits supplémentaire stimulé par le LPS a été traité avec 0,1 % de Triton X-100 comme témoin de cytotoxicité (100 % de cellules mortes), avant l’ajout de 2 mmol/L de MTT. Les cellules ont été lysées, les cristaux violets de formazan ont été solubilisés avec 10 % de SDS dans 20 mmol/L de HCl et l’absorbance a été mesurée à 570 nm au moyen d’un lecteur de microplaques Multiskan Spectrum (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les données (moyenne ± ET de trois donneurs) ont été exprimées en pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au témoin véhicule stimulé.
4.7. Modèle murin d’inflammation induite par la carraghénane
Des souris ICR mâles (26 ± 2 g, 6 souris par groupe), achetées auprès de BioLasco Taiwan (Taipei, Taïwan ; sous licence de Charles River Laboratories), ont été mises à jeun pendant la nuit précédant le début du traitement et pendant toute la durée de l’expérience. La plante entière d’arnica, les fleurs d’arnica, administrées à 1, 3 et 10 mg/patte, ou le véhicule (éthanol à 50 %), chacun dans un volume de 20 µL, ont été appliqués par voie topique sur la patte postérieure droite autour du site d’injection de la carraghénane trois fois consécutives à 20 min d’intervalle, à partir de 1 h avant l’injection de carraghénane. Le témoin positif, l’aspirine, a été administré par voie orale à une dose de 150 mg/kg 1 h avant l’injection de carraghénane. Les souris ont reçu une injection intraplantaire de carraghénane (50 µL d’une suspension à 1 %) dans la patte postérieure droite. L’œdème de la patte a été mesuré 4 h après l’administration de carraghénane à l’aide d’un pléthysmomètre. La patte postérieure gauche non injectée a servi de témoin négatif interne. Le léchage des pattes par les animaux a été empêché par le port de collerettes après l’application du médicament et pendant toute la durée de l’expérience. L’étude a été réalisée par Pharmacology Discovery Services (New Taipei City, Taïwan) conformément au protocole d’utilisation et de soins aux animaux no IN018-10222020, approuvé le 10 octobre 2020 par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC), dans une animalerie de laboratoire accréditée par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC), et globalement conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition (National Academies Press, Washington, D.C., 2011).
4.8. Analyse statistique
L’analyse statistique, l’ajustement des courbes et le calcul des valeurs de CI_50 ont été réalisés avec GraphPad Prism, version 9.2.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, États-Unis). Toutes les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). Les données sont représentatives d’au moins deux expériences indépendantes analysées au moyen de mesures en double ou en triplicat (réplicats biologiques). Les valeurs de CI_50 ont été calculées par régression non linéaire au moyen de l’équation Y = 100/(1 + 10^((LogCI_50−X)×pente de Hill)), où X = logarithme de la concentration et Y = réponse normalisée (0–100 %). L’analyse statistique des expériences dose-réponse a été réalisée au moyen d’une ANOVA à deux facteurs avec correction de Bonferroni pour comparaisons multiples, afin de comparer l’inhibition par la plante entière et les fleurs d’arnica aux concentrations respectives. Les comparaisons entre deux groupes ont été réalisées au moyen d’un test t non apparié. Les données issues de l’analyse de l’expression génique et de l’expérimentation animale ont été analysées statistiquement au moyen d’une ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett, afin d’évaluer l’effet des extraits d’arnica par rapport au témoin véhicule ou de comparer les effets de la plante entière et des fleurs d’arnica, comme indiqué. Une valeur de p ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
5. Conclusions
La plante entière d’arnica a présenté une activité anti-inflammatoire supérieure le long de la voie inflammatoire NF-κB–eicosanoïdes, comparativement aux fleurs d’arnica, dans divers essais in vitro et in vivo. Les propriétés anti-inflammatoires accrues de la plante entière d’arnica pourraient être dues à la teneur accrue et plus diversifiée de l’extrait en substances bioactives par rapport aux fleurs d’arnica. Nos données suggèrent que les produits contenant la plante entière d’arnica pourraient être plus actifs pour atténuer les symptômes de l’inflammation que ceux reposant uniquement sur les fleurs d’arnica.