Évaluation préliminaire d’un extrait d’Arnica montana L. : activité antimicrobienne contre Acinetobacter baumannii et profil d’expression des gènes liés au biofilm
Référence : Genes 2025. — PMC12732620 · DOI 10.3390/genes16121473 Type : étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Contexte/Objectifs : Arnica montana L. est largement reconnu pour ses diverses activités biologiques, notamment ses effets antimicrobiens. Cette étude visait à évaluer l’activité antimicrobienne et antibiofilm d’extraits d’A. montana L. contre Acinetobacter baumannii, un agent pathogène constituant une préoccupation urgente de santé publique en raison de sa résistance croissante aux antibiotiques et de sa capacité à former des biofilms. Méthodes : l’activité antimicrobienne d’extraits éthanolique (EtE) et aqueux (AqE) de fleurs d’A. montana a été évaluée par la méthode de microdilution en bouillon. La concentration minimale inhibitrice (CMI), la concentration minimale bactéricide (CMB) et le rapport CMB/CMI ont été utilisés. Les effets de l’EtE sur la formation de biofilm d’A. baumannii ont été évalués au moyen d’un essai au cristal violet. De plus, un profil transcriptionnel des gènes associés au biofilm après exposition à des concentrations sous-CMI de l’extrait a été réalisé par RT-qPCR. Résultats : l’activité anti-Acinetobacter de l’EtE a été démontrée (CMI = 234,4 et 468,75 µg/mL pour A. baumannii ATCC BAA-3252 et ATCC 19606, respectivement). L’EtE a présenté une activité bactéricide contre les deux souches, tandis que l’AqE n’a montré aucune activité. En outre, l’EtE a inhibé la formation du biofilm et diminué significativement l’expression de gènes clés associés au biofilm, notamment ceux de l’opéron csu et ompA. Conclusions : l’EtE d’Arnica montana a présenté des activités antimicrobienne et antibiofilm contre A. baumannii et a inhibé le développement du biofilm en supprimant la transcription de gènes impliqués dans l’assemblage des pili et l’adhérence aux surfaces, ce qui souligne leur rôle essentiel dans la formation du biofilm.
1. Introduction
Le problème mondial actuel de la résistance aux médicaments chez les bactéries et les champignons s’aggrave. L’utilisation de produits d’origine végétale et d’extraits naturels est apparue comme une solution prometteuse en remplacement des interventions pharmacologiques dans la lutte contre les agents pathogènes multirésistants (MDR). Dans la pratique contemporaine, leur potentiel est le plus souvent exploité comme « potentialisateurs » d’antibiotiques et/ou inhibiteurs de biofilm, et moins fréquemment comme médicaments autonomes. De nombreux métabolites secondaires produits par les plantes assurent une défense chimique contre un large éventail d’agents infectieux, notamment les microorganismes pathogènes. La grande diversité de ces composés phytochimiques offre de précieuses ressources pour mettre au point de nouveaux agents antimicrobiens destinés à combattre les agents pathogènes MDR-ESKAPE tels qu’Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter spp. Il a été montré qu’un certain nombre d’extraits végétaux et de composés issus de plantes possédaient des propriétés antimicrobiennes. Par exemple, l’acide myristique (une forme assez courante d’acide gras saturé) s’est révélé efficace contre S. aureus ; le 7-O-méthyléther de quercétine et l’isoorientine, isolés de Rhynchosia beddomei Baker, ont présenté des propriétés antibactériennes contre P. aeruginosa et S. aureus ; et Song et al. ont indiqué que des flavonoïdes isopenténylés (α-mangostine et isobavachalcone) étaient efficaces contre E. faecium et S. aureus résistants aux antibiotiques. Dans leur étude fondatrice, Idris et al. ont résumé de manière exhaustive la littérature existante sur le sujet, en recueillant méticuleusement les données de nombreuses publications détaillant l’activité de divers extraits végétaux contre les agents pathogènes ESKAPE. Les données présentées par les auteurs ont révélé une rareté des composés phytochimiques présentant un fort potentiel d’inhibition de la croissance ou de destruction des cellules d’A. baumannii. Une exception est toutefois observée avec l’extrait éthanolique de fleurs de Lavandula stoechas, pour lequel une CMI de 35,9 μg/mL contre les bactéries planctoniques a été rapportée. À ce jour, plusieurs mécanismes d’action antimicrobienne de constituants végétaux ont été décrits. Il a été démontré que des composés végétaux bioactifs agissaient comme inhibiteurs des pompes d’efflux (par exemple, la baïcaline, les catéchines et la pipérine). Les composés naturels peuvent agir en modifiant les protéines cibles de certains agents pathogènes, comme l’illustrent les composés soufrés de l’ail (allicine/ajoène) et les isothiocyanates (par exemple, l’ITC de benzyle).
Comme l’ont avancé de nombreux scientifiques, un autre mécanisme implique la perturbation des membranes et le stress osmotique (dans le cas des huiles essentielles), dont le thymol, le carvacrol, l’eugénol, le cinnamaldéhyde et le terpinène-4-ol constituent des exemples notables. Il a été démontré que ces substances compromettaient l’intégrité des membranes cellulaires bactériennes et fongiques, réduisant ainsi leur capacité à former des biofilms et entravant le processus de détection du quorum. Dans de nombreux modèles, ces composés sont associés in vitro à des antibiotiques (par exemple, l’amikacine), ce qui entraîne une réduction substantielle de la CMI contre les bactéries MDR des genres Klebsiella, Acinetobacter et Staphylococcus. Il a également été montré que des composés d’origine naturelle possédaient des propriétés antibactériennes et/ou antiadhésives, entravant ainsi l’adhérence des microorganismes aux surfaces biotiques comme abiotiques. Il a été montré que des huiles essentielles (par exemple, de cannelle, de clou de girofle et de citronnelle) et des composés polyphénoliques (par exemple, la quercétine, le kaempférol-3-rutinoside et la galangine) réduisaient divers processus cellulaires bactériens. Par exemple, les processus de formation et de maturation du biofilm de Vibrio parahaemolyticus, porteur de gènes associés à la virulence, sont efficacement inhibés à des concentrations sous-CMI par les huiles essentielles de citronnelle et de cumin.
Arnica montana est une plante médicinale largement reconnue pour ses propriétés antimicrobiennes, anti-inflammatoires, antitumorales et analgésiques. Les multiples applications pharmacologiques d’A. montana sont attribuées à ses divers composés bioactifs, notamment les lactones sesquiterpéniques (par exemple, l’hélénaline et la 11α,13-dihydrohélénaline), les sesquiterpènes (par exemple, le caryophyllène et le germacrène D) et les monoterpènes (par exemple, le thymol et l’α-pinène), ainsi que l’eugénol, les glycosides de flavonoïdes, les acides gras et les oligofructosides, qui contribuent tous collectivement à son vaste potentiel thérapeutique. Selon Thakur et d’autres chercheurs, l’arnica soutient diverses fonctions de l’organisme, notamment l’amélioration de la circulation sanguine, la réduction des douleurs musculaires et des gonflements, ainsi que l’accélération de la cicatrisation après une intervention chirurgicale ou une blessure. Les extraits d’arnica ont également présenté une activité antibactérienne prometteuse contre plusieurs microorganismes pathogènes, ce qui en fait des candidats potentiels pour la mise au point de traitements prophylactiques alternatifs et de nouveaux traitements antimicrobiens. La littérature existante ne contient toutefois que peu d’études ayant examiné les effets des extraits d’A. montana sur Acinetobacter spp.
Acinetobacter baumannii est un agent pathogène opportuniste, aérobie et à Gram négatif, qui constitue une menace importante pour les patients dont le système immunitaire est affaibli (et qui connaissent une hospitalisation prolongée de plus de 90 jours). Il est également une cause majeure de diverses infections, notamment les pneumonies (pneumonies associées à la ventilation mécanique et pneumonies communautaires), les infections urinaires, les infections de la circulation sanguine (par exemple, bactériémie et sepsis), les méningites nosocomiales post-neurochirurgicales, ainsi que les infections des plaies et des tissus mous. Comme l’ont indiqué de nombreux auteurs, cette bactérie vit naturellement dans les milieux aquatiques et les sols, ainsi que dans les aliments ou sur les dispositifs médicaux. La pathogenèse est fortement attribuée à divers facteurs de virulence, notamment les adhésines, les lipooligosaccharides, les protéines de la membrane externe, les systèmes de chélation du fer, les systèmes de sécrétion protéique et des enzymes (phospholipases, protéases), entre autres. L’un des facteurs les plus importants contribuant à la pathogénicité d’A. baumannii est la capacité de la bactérie à adhérer aux surfaces biotiques et abiotiques, à y former des biofilms et à les coloniser, avec une prévalence comprise entre 32 et plus de 90 %, tout en portant simultanément de multiples gènes liés au biofilm.
La principale menace que représente la présence d’A. baumannii dans l’environnement et l’entourage humain réside dans le développement continu de la résistance aux antibiotiques, particulièrement alarmant dans le cas des carbapénèmes fréquemment utilisés (A. baumannii résistant aux carbapénèmes, CRAB), et susceptible d’entraîner des infections difficiles à traiter. En conséquence, A. baumannii est désigné par l’Organisation mondiale de la santé comme le quatrième agent pathogène le plus critique dans la catégorie du groupe critique. La rareté des agents pharmaceutiques prometteurs actuellement en développement constitue une contrainte importante dans les efforts visant à combattre ces agents pathogènes. En outre, les infections causées par les agents pathogènes critiques peuvent également être extrêmement difficiles à prévenir et sont très contagieuses. Plusieurs revues exhaustives ont fourni des informations détaillées sur les mécanismes et les étapes du développement du biofilm chez A. baumannii. L’inhibition de la formation du biofilm représente une approche thérapeutique prometteuse pour combattre les infections à A. baumannii, car les biofilms contribuent de manière importante à la résistance de l’agent pathogène aux antibiotiques et à sa persistance dans les environnements cliniques. Cibler le développement du biofilm peut perturber la colonisation bactérienne et accroître l’efficacité des traitements antimicrobiens.
Cette étude préliminaire a évalué les effets antibactériens et antibiofilm d’extraits de fleurs d’A. montana (aqueux et éthanolique) contre deux souches de référence d’A. baumannii, sous forme de cellules planctoniques ou formant un biofilm, en accordant une attention particulière à l’analyse transcriptionnelle de certains gènes associés au biofilm afin d’élucider les réponses moléculaires induites par le traitement et de mieux comprendre son activité antibiofilm.
2. Matériel et méthodes
2.1. Matériel végétal et procédure d’extraction
Le matériel végétal, constitué de capitules d’Arnica montana L. en pleine floraison, a été récolté dans le champ expérimental de l’Université des sciences de la vie de Lublin, dans l’est de la Pologne (51°31′39,5″ N, 22°45′6,7″ E). Après la récolte, les capitules ont été séchés à l’air à 40 °C, finement broyés à l’aide d’un moulin de laboratoire, puis tamisés (passage à travers un tamis en nylon d’un maillage de 1 mm) afin d’obtenir un matériel végétal pulvérisé homogène destiné aux analyses ultérieures. Des portions de 5 g de matière première ont été pesées et transférées dans des fioles Erlenmeyer de 250 mL. Chaque échantillon a ensuite reçu 50 mL du solvant approprié : soit de l’eau distillée, soit de l’éthanol à 70 % (v/v). Les fioles ont été hermétiquement fermées et placées dans un bain-marie agité à 40 °C pendant 5 h. Une fois l’extraction achevée, les solutions ont été filtrées sur un entonnoir de Büchner en plastique muni d’un papier-filtre en cellulose. Les extraits obtenus ont été soumis à des analyses ultérieures, tandis que le matériel végétal restant après l’extraction a été éliminé.
2.2. Analyses chimiques
La teneur en lactones sesquiterpéniques a été quantifiée par la méthode chromatographique décrite dans la Pharmacopée polonaise IX. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la teneur totale en lactones sesquiterpéniques, calculée en équivalents tiglinate de dihydrohélénaline. La teneur en flavonoïdes, exprimée en équivalents quercétine, a été déterminée par la méthode spectrophotométrique spécifiée dans la Pharmacopée polonaise VIII. Chaque mesure a été effectuée en quatre réplicats. Des données représentatives sont présentées.
2.3. Microorganismes
Deux souches de référence, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 et A. baumannii ATCC BAA-3252, obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), ont été utilisées. Les bactéries ont été conservées congelées à −70 ± 2 °C dans un bouillon cœur-cervelle (BHI, Oxoid, Milan, Italie). Elles ont été cultivées pendant 24 h à 35 ± 2 °C sur gélose trypticase-soja (TSA, Oxoid, Royaume-Uni), puis utilisées pour tester le potentiel antimicrobien des extraits.
2.4. Test d’activité antimicrobienne
L’objectif de cette étude était de déterminer le potentiel antibactérien d’extraits éthanolique et aqueux d’Arnica montana L. contre des bactéries du genre Acinetobacter spp. La méthode de double microdilution en bouillon a été utilisée, comme le préconise le Comité européen des antibiogrammes (EUCAST), à titre de méthode de référence pour déterminer le potentiel antimicrobien de produits naturels et de composés nouvellement synthétisés, ainsi que de composés de nature antibiotique et chimiothérapeutique. L’activité quantitative des produits testés a été mesurée à l’aide des paramètres suivants : la concentration minimale inhibitrice (CMI), définie comme la plus faible concentration du produit testé inhibant la croissance visible in vitro des microorganismes, exprimée en μg/mL ; la concentration minimale bactéricide (CMB), définie comme la plus faible concentration du produit testé entraînant l’absence de croissance visible des microorganismes, exprimée en μg/mL. En outre, les rapports CMB/CMI ont également été calculés afin d’évaluer la nature de l’activité des formulations. Le produit a été classé comme bactéricide lorsque les valeurs CMB/CMI étaient ≤ 4 et comme bactériostatique lorsque les valeurs CMB/CMI étaient comprises entre 4 et 32.
La méthode impliquait la préparation de suspensions microbiennes à une densité normalisée (0,5 sur l’échelle standard de McFarland, McF), correspondant à 1,5 × 10^8 UFC/mL et à une densité optique de DO_550 = 0,125. L’essai a été réalisé dans l’intervalle de concentrations de 7,32 à 30 000 µg/mL sur des microplaques de polystyrène à 96 puits (Medlab, Raszyn, Pologne), en ajoutant dans chaque puits 200 µL de la concentration initiale du produit testé et 100 µL de milieu microbiologique stérile de bouillon Mueller-Hinton (MHB, Biomaxima, Lublin, Pologne), comme décrit précédemment. Parallèlement, les témoins suivants ont été réalisés : (a) un témoin de milieu constitué de 100 µL de milieu MHB stérile dépourvu de microorganismes ; (b) un témoin de viabilité microbienne comprenant 100 µL de milieu stérile avec 2 µL de suspension microbienne, sans les extraits testés ; (c) le témoin des extraits d’A. montana, comprenant des dilutions sériées au demi sans ajout de microorganismes (réalisées dans les mêmes intervalles de concentrations que l’expérience proprement dite ; les valeurs de DO_600 lues dans ces puits ont servi de référence pour déterminer la CMI) ; et (d) de l’amoxicilline (5 mg/mL, Glentham Life Sciences, Corsham, Royaume-Uni), ainsi que de l’alcool éthylique à 70 % comme témoin du solvant (afin de respecter strictement le protocole expérimental, les conditions témoins reproduisaient fidèlement la procédure utilisée pour les souches bactériennes étudiées, à l’exception de l’ajout de solvant pur dans les mêmes volumes que l’extrait. Une série de dilutions au demi de l’éthanol allant de 0,03 à 70,0 % a ainsi été obtenue, correspondant aux dilutions des extraits testés allant de 7,32 à 30 000 µg/mL). Les microplaques ont ensuite été incubées pendant 18 ± 2 h à 35 ± 2 °C. Un essai spectrophotométrique a ensuite été réalisé dans chaque puits de la plaque, avec des mesures enregistrées à 600 nm à l’aide d’un lecteur de plaques ELx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, États-Unis). Les valeurs de CMI ont alors été déterminées dans les puits où les extraits étudiés inhibaient complètement la croissance des souches microbiennes de référence. Les valeurs de CMB ont été déterminées en étalant 5 µL du contenu de chaque puits des microplaques présentant une inhibition de la croissance sur des plaques de gélose Mueller-Hinton (MHA, Biomaxima, Lublin, Pologne). La zone de la plaque dans laquelle une inhibition de 99,9 % de la croissance microbienne (cellules planctoniques) était observée a été considérée comme la concentration létale. L’expérience a été réalisée au moins en triplicat et des données représentatives sont présentées.
2.5. Essai antibiofilm
La capacité des souches d’Acinetobacter spp. testées à former un biofilm et le potentiel antibiofilm de l’extrait éthanolique d’Arnica montana L. ont été mesurés quantitativement au moyen d’une méthode modifiée au cristal violet à 0,1 % (CV, Oxoid, Royaume-Uni) reposant sur la DO_570. L’essai de biofilm a été réalisé sur des microplaques Nunc™ MicroWell™ à 96 puits, à fond plat et traitées Nunclon Delta (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les suspensions bactériennes ont été préparées sur gélose trypticase-soja (TSA, Oxoid, Basinstoke, Royaume-Uni) à une densité de 0,5 McFarland. Une quantité de 200 μL de chaque extrait d’arnica a été ajoutée aux premiers puits d’une rangée, puis diluée comme décrit précédemment afin d’obtenir les mêmes dilutions au demi. À la dernière étape, 2 µL de suspension bactérienne (0,5 McF) ont été ajoutés à chaque puits, qui a ensuite été incubé pendant 24 h à 37 °C. Le milieu surnageant de la culture a ensuite été décanté. Les microplaques ont été soigneusement lavées plusieurs fois à l’eau distillée afin d’éliminer les cellules non adhérentes ou faiblement adhérentes. Elles ont ensuite été séchées en position retournée et colorées avec 200 μL de CV à 0,1 %. Les plaques ont été laissées au repos pendant 15 min, après quoi le colorant a été éliminé et chaque puits a été rincé plusieurs fois avec de l’eau distillée stérile afin d’assurer l’élimination des formes non adhérentes. Enfin, les microplaques ont été séchées, remplies de 200 μL d’éthanol à 96 % (POCH, Lublin, Pologne), et la densité optique (DO_570) a été mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques ELx 800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, États-Unis) après 15 min. Sur la base des valeurs d’absorbance, les deux souches d’Acinetobacter spp. ont été classées comme productrices de biofilm selon une méthode décrite précédemment. Des types de témoins analogues ont été utilisés : milieu MHB témoin sans l’extrait testé ; milieu témoin additionné d’extrait mais sans inoculum bactérien, avec une série de dilutions (témoin négatif). Les valeurs de DO_570 lues dans ces puits ont servi de points de référence pour déterminer les valeurs de concentration minimale inhibitrice du biofilm (CMIB). La viabilité des souches testées, représentant une croissance de 100 % sans ajout de l’extrait testé, a été vérifiée indépendamment. L’expérience a été réalisée en triplicat et des données représentatives sont présentées.
À partir des données obtenues, la CMIB de l’extrait testé inhibant la formation du biofilm d’A. baumannii a été déterminée. Cette valeur a été déterminée dans les puits contenant la plus faible concentration d’extrait (la dilution la plus élevée) dans lesquels une réduction significative ou une inhibition de la formation du biofilm était observée par rapport au témoin non traité. Le pourcentage d’inhibition du biofilm peut être calculé à l’aide de la formule [(DO_témoin − DO_échantillon)/DO_témoin] × 100, où DO_témoin était l’absorbance des puits témoins positifs (bactéries non traitées) et DO_échantillon l’absorbance des puits traités par l’extrait. L’inhibition du biofilm a été évaluée sur une échelle de 0 à 100 % ; les valeurs < 0 % indiquaient une stimulation de la croissance du biofilm, tandis que les valeurs comprises entre 0 et 50 % indiquaient une faible activité antibiofilm ; les valeurs > 50 % représentaient une bonne inhibition du biofilm. Toutes les analyses d’images ont été réalisées à l’aide du logiciel ImageJ 1.54g (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis) afin de calculer l’aire mesurée occupée par le biofilm (MAOB).
2.6. Extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc
Afin d’évaluer les modifications transcriptionnelles des gènes associés à la formation du biofilm chez A. baumannii, les traitements comprenaient des concentrations de CMI subinhibitrices (sublétales) : ½ CMI et ¼ CMI de l’extrait d’A. montana, de l’éthanol à des concentrations équivalentes (½ CMI et ¼ CMI), ainsi qu’un témoin non traité. L’extraction de l’ARN a été réalisée conformément aux instructions du fabricant à l’aide du réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis). Immédiatement après l’isolement, l’inhibiteur de RNase RiboLock à 40 U/μL (Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis) a été ajouté aux échantillons. L’ARN extrait a ensuite été évalué par spectrophotométrie avec un NanoDrop2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5 % coloré au bromure d’éthidium. Une éventuelle contamination par l’ADN génomique a été éliminée à l’aide de DNase I exempte de RNase (EURx, Gdańsk, Pologne), conformément aux recommandations du fabricant. Les réactions de transcription inverse ont été réalisées à l’aide du kit NG dART RT (EURx, Gdańsk, Pologne) sur 1,5 µg d’ARN. L’ADNc obtenu a été dilué et utilisé comme matrice pour les réactions de RT-qPCR ultérieures.
2.7. RT-qPCR
À la suite d’un examen exhaustif de la littérature existante, six gènes d’intérêt (bap, csuA, csuB, csuC, csuD et ompA) ont été sélectionnés pour l’analyse de leur expression par RT-qPCR. La présence des gènes a été recherchée dans les deux souches bactériennes par PCR classique, avec visualisation par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 %, photographie à l’aide d’un système Quantum ST4 (Vilber Lourmat, France), documentation et archivage au moyen du logiciel informatique Quantum ST5 Xpress v 16.08g (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France).
Les séquences d’amorces des gènes d’intérêt ont été conçues à l’aide de l’outil PrimerBLAST. Les amorces utilisées pour les gènes de référence (rpoB et rpoD) et le gène bap ont été obtenues dans la littérature. Les caractéristiques des amorces sont présentées dans le tableau 1. La spécificité de l’amplification a ensuite été évaluée par l’analyse des courbes de fusion. Toutes les paires d’amorces utilisées dans cette étude ont présenté une amplification spécifique, confirmée par la présence de pics uniques sur les courbes de dissociation obtenues (figure A1). L’efficacité de l’amplification a été déterminée par l’analyse de courbes étalons préparées à partir de dilutions sériées d’un mélange d’ADNc. Les réactions de RT-qPCR ont été réalisées à l’aide du SG/ROX onTaq qPCR Master Mix (2×) (EURx, Gdańsk, Pologne) sur 50 ng d’ADNc, avec des concentrations optimisées d’amorces (tableau 1). Les conditions de thermocyclage correspondaient aux recommandations du fournisseur (15 min à 95 °C pour la dénaturation initiale, suivies de 40 cycles de 15 s à 94 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, puis d’une étape de courbe de dissociation avec acquisition continue des données de 60 °C à 95 °C). Toutes les réactions ont été réalisées en trois réplicats techniques, avec des témoins sans matrice (NTC), sur un système de PCR en temps réel QuantStudio™ 6 Pro (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les niveaux d’expression relative des gènes cibles (méthode 2^−∆∆Ct) ont été calculés à l’aide du module de quantification relative de Thermo Fisher Cloud (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis).
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2.8. Analyse statistique
Des analyses statistiques ont été réalisées afin d’évaluer la significativité des différences entre les groupes expérimentaux. L’homogénéité des variances a été vérifiée à l’aide du test de Levene avant les analyses paramétriques. Pour les données paramétriques à variances égales, une analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du test post hoc de Tukey, a été utilisée pour les comparaisons multiples. Pour les données non paramétriques, le test U de Mann-Whitney a été appliqué afin de comparer les différences entre les groupes. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs au seuil de p < 0,05. Les données expérimentales sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types (ET). Les tests statistiques ont été réalisés à l’aide du logiciel Statistica 13.1 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, États-Unis), et les graphiques ont été créés avec GraphPad Prism 8, version 8.4.2 (GraphPad Software, LLC, San Diego, CA, États-Unis).
3. Résultats
3.1. Analyse chimique des extraits
L’extrait éthanolique de fleurs d’A. montana contenait des concentrations de lactones sesquiterpéniques (LST) environ 2,5 fois plus élevées que l’extrait aqueux (1,645 % contre 0,670 %, respectivement). En outre, la teneur en flavonoïdes était également supérieure dans l’extrait éthanolique, où elle atteignait 0,725 %, tandis qu’elle s’élevait à 0,680 % dans l’extrait aqueux. La figure A1 de l’annexe A présente un exemple de chromatogramme HPLC des LST dans les extraits aqueux (A) et éthanolique (B).
3.2. Essai d’activité antibactérienne contre les cellules planctoniques d’A. baumannii
Les résultats présentés dans le tableau 2 sont issus d’essais expérimentaux utilisant la méthode de double dilution en bouillon. Les valeurs de CMI pour les cellules planctoniques des souches de référence d’A. baumannii en présence de l’extrait éthanolique étaient comprises entre 234,4 et 468,75 µg/mL, tandis que les valeurs de CMB étaient identiques pour les deux souches, à 937,5 µg/mL (tableau 2). L’extrait alcoolique de fleurs d’arnica a présenté des propriétés bactéricides contre les deux souches de référence d’Acinetobacter spp., avec des rapports CMB/CMI de 2 et 4 pour A. baumannii ATCC 19606 et ATCC BAA-3252, respectivement. À l’inverse, l’extrait aqueux n’a présenté aucune activité potentielle contre les souches étudiées. Les valeurs de CMI dépassaient l’intervalle de concentrations utilisé.
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Les valeurs de CMI ont montré que l’extrait éthanolique d’arnica était actif contre les cellules planctoniques des souches de référence de l’espèce A. baumannii. La multiplication des deux souches d’A. baumannii augmentait de la même manière en présence de l’extrait (figure 1). Elle était progressivement inhibée, et l’ampleur de cette inhibition dépendait de la concentration de l’extrait éthanolique. Aux faibles concentrations, comprises entre 14,6 et 58,6 µg/mL, la croissance bactérienne était comparable à celle du témoin de croissance (souche non exposée à l’extrait, croissance de 100 %). Les valeurs de DO_600 d’A. baumannii ATCC 19606 étaient comprises entre 1,032 ± 0,040 et 0,962 ± 0,063, et celles d’A. baumannii ATCC BAA-3252 entre 1,019 ± 0,016 et 0,943 ± 0,038 (tableau A1). Une diminution importante de la prolifération bactérienne est survenue juste avant une concentration très élevée de l’extrait (entre 234,4 et 468,8 µg/mL). Une inhibition de la croissance des cellules planctoniques des deux souches a été atteinte à ces concentrations d’extrait, à des niveaux compris entre 34,2 et 89,9 ± 0,007 % pour A. baumannii ATCC 19606, et entre 69,6 et 93,1 ± 0,020 % pour ATCC 3252 (la différence entre les souches était statistiquement significative, avec p < 0,05 ; figure 1). Une forte réduction de la croissance bactérienne a été observée aux valeurs de CMI dépassant une concentration de 468,8 µg/mL d’extrait éthanolique. La croissance des cellules planctoniques a été inhibée chez les deux souches d’Acinetobacter spp., avec un niveau moyen estimé de 88,8 à 92,4 ± 0,0140 pour la souche ATCC 19606 et de 89,7 à 92,4 ± 0,0109 % pour la souche ATCC BAA-3252 (p = 0,999). Des différences statistiquement significatives ont été observées aux concentrations sublétales (p < 0,0001). Une inhibition modérée de la croissance des cellules planctoniques de ces bactéries a été provoquée par la présence de > 468,8 μg/mL d’extrait, l’inhibition de la croissance allant de 87,4 ± 0,0046 % à 96,6 ± 0,0136 % pour A. baumannii ATCC 19606 et de 95,4 ± 0,0005 % à 96,9 ± 0,0042 % pour A. baumannii ATCC BAA-3252 (une différence statistiquement significative a été observée à toutes les concentrations d’extrait, sauf à 30 000 µg/mL ; p < 0,0001).
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Il est important de noter que les valeurs de CMI de l’éthanol pur étaient deux fois supérieures aux valeurs de CMI (937,5 et 1 875,0 µg/mL pour A. baumannii ATCC 19606 et ATCC 3252, respectivement). En outre, la présence d’éthanol a également entraîné une inhibition de la croissance des cellules bactériennes planctoniques (à des concentrations correspondant à une CMI de l’extrait > 468,8 μg/mL). L’inhibition de la croissance allait de 89,7 ± 0,013 % à 96,9 ± 0,004 % pour A. baumannii ATCC 19606, et de 81,9 ± 0,045 % à 95,3 ± 0,003 % pour A. baumannii ATCC 3252. Une différence statistiquement significative a été observée entre les cellules traitées à l’éthanol et les cellules non traitées des deux souches (p < 0,0001).
3.3. Effets de l’extrait éthanolique d’arnica sur les cellules du biofilm d’A. baumannii
L’extrait d’arnica (concentration initiale de 30 000 µg/mL) a été testé sur des cellules de biofilm à douze concentrations différentes (correspondant aux dilutions de l’essai antimicrobien), notamment aux concentrations subinhibitrices de ½ et ¼ CMI, ainsi qu’à deux et quatre fois la CMI planctonique respective (2× et 4× CMI), qui ont significativement inhibé la formation du biofilm chez les deux souches de référence A. baumannii ATCC 19606 et ATCC BAA-3252 (figure 2). La présence d’extrait éthanolique d’arnica dans le milieu de culture a eu un effet similaire sur la formation du biofilm des souches d’A. baumannii ATCC 19606 et ATCC BAA-3252.
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L’extrait éthanolique d’arnica a présenté différents degrés d’activité inhibitrice du biofilm contre les deux souches d’Acinetobacter spp. Les extraits ont entraîné une inhibition du biofilm supérieure à 50 % aux concentrations de 468 à 3 750,0 µg/mL et de 234,4 à 1 875 µg/mL pour ATCC 19606 et ATCC BAA-3252, respectivement. En revanche, aucune inhibition de la formation du biofilm > 50 % par l’extrait végétal n’a été observée aux concentrations inférieures à 58,6 µg/mL et supérieures à 7 500 µg/mL (tableau 3). Certaines différences entre les souches étaient statistiquement significatives (figure 3).
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L’effet de l’éthanol sur la formation du biofilm par les bactéries a également été évalué pour les deux souches, l’éthanol étant dilué selon un rapport v/v analogue à celui de l’extrait. Les valeurs de CMIB obtenues étaient deux à quatre fois supérieures (3 750 à 7 500 μg/mL) à celles obtenues pour les souches non traitées. Le rapport CMIB/CMI indique que l’extrait alcoolique et l’éthanol ont tous deux inhibé la formation du biofilm, particulièrement en ce qui concerne les cellules d’A. baumannii ATCC BAA-3252. Des différences statistiquement significatives ont été observées entre les cellules traitées par l’extrait ou par l’éthanol à la plupart des concentrations (tableau 3) pour la souche ATCC 19606, particulièrement à la concentration subinhibitrice de ¼ CMI (117,2 μg/mL ; p = 0,0001). Des observations similaires ont été faites pour la souche ATCC BAA-3252 à une concentration de ½ CMI (117,2 μg/mL ; p = 0,0017).
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3.4. Gènes liés au biofilm
La présence des gènes liés au biofilm a été déterminée par PCR avec des paires d’amorces spécifiques, suivie d’une électrophorèse sur gel d’agarose. Les deux souches de référence d’A. baumannii présentaient le même ensemble de gènes, à l’exception de csuA, qui n’était présent que dans la souche A. baumannii ATCC 19606.
3.5. Effets des concentrations sous-CMI sur l’expression des gènes de formation du biofilm
A. baumannii ATCC 19606 a présenté des modifications transcriptionnelles significatives de tous les gènes liés au biofilm étudiés, à l’exception de bap, dont l’expression est restée inchangée quel que soit le traitement (figure 4). L’expression des gènes csuA-C a été fortement diminuée après un traitement par l’extrait d’arnica ou l’éthanol (figure A2). Par exemple, par rapport au témoin, l’exposition à une concentration sublétale de ½ CMI d’extrait de fleurs d’A. montana a diminué les niveaux de transcrits de csuA-C d’environ 6 à 8 fois. De même, ¼ CMI de l’extrait a entraîné une diminution de leur transcription de 3 à 6 fois. Les modifications induites par le traitement à l’éthanol étaient analogues et ne présentaient aucune différence statistiquement significative par rapport à celles provoquées par l’extrait. La diminution observée de l’expression de csuD était moins prononcée et n’atteignait le seuil de significativité statistique par rapport au témoin qu’à ½ CMI, tant pour le traitement par l’extrait que pour celui par l’éthanol. Dans le cas d’ompA, son expression diminuait significativement en réponse à ½ CMI de l’extrait et de l’éthanol (respectivement 8 et 9 fois), tandis que la réduction à ¼ CMI de l’extrait n’atteignait pas le seuil de significativité statistique.
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Alors que les niveaux d’ARNm de bap, csuD et ompA présentaient une faible réduction chez A. baumannii ATCC BAA-3252 après les traitements, les modifications n’étaient pas statistiquement significatives (figure 5). L’exposition à ½ CMI et à ¼ CMI d’extrait de fleurs d’A. montana a entraîné une forte inhibition transcriptionnelle de csuB (environ 13 fois), le traitement par l’éthanol à ½ CMI produisant un effet similaire. En revanche, l’éthanol à ¼ CMI n’a pas eu d’effet significatif sur l’expression de csuB. Une tendance similaire a été observée pour csuC, les niveaux d’ARNm diminuant d’environ 5 à 7 fois en réponse à ½ CMI et à ¼ CMI de l’extrait, ainsi qu’à ½ CMI de l’éthanol. En revanche, l’éthanol à ¼ CMI n’a provoqué qu’une diminution mineure, non significative.
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4. Discussion
Les extraits d’Arnica montana L. font l’objet de recherches approfondies depuis de nombreuses années. Il a été démontré que leurs propriétés antibactériennes étaient particulièrement efficaces contre des bactéries à Gram positif, telles que Staphylococcus aureus, notamment des souches de SARM ATCC 25923 résistantes à la méthicilline, ainsi que contre des bactéries à Gram négatif, telles qu’Escherichia coli ATCC 25922, et des levures, telles que Candida albicans ATCC 60193. Les auteurs ont montré que tous les extraits testés inhibaient efficacement les microorganismes, S. aureus présentant la plus grande sensibilité (CMI comprise entre 0,10 et 0,31 mg/mL), E. coli une sensibilité intermédiaire (CMI comprise entre 1,23 et 2,58 mg/mL) et C. albicans la plus grande résistance (CMI comprise entre 1,41 et 5,16 mg/mL). Ces résultats variaient en fonction des conditions d’extraction, telles que la température (36 à 64 °C) et la pression (5,9 à 34,1 MPa). Kryvtsova et Koščová ont étudié des extraits éthylique et méthylique produits à partir des inflorescences d’A. montana L. contre des staphylocoques, notamment la souche formatrice de biofilm S. aureus CCM 4223. Les auteurs ont conclu que l’extrait d’arnica présentait des effets antimicrobiens, y compris une activité contre des souches cliniques de SARM et de S. aureus productrices de biofilm. Parallèlement, les activités des extraits éthylique et méthylique étaient comparables. Il a également été démontré que l’introduction d’une solution d’extrait à 0,1 % réduisait de 92 % la formation du biofilm. À mesure que la concentration de l’extrait diminuait, l’activité antibiofilm diminuait progressivement. Yalgi et Bhat ont rapporté une bonne activité antibactérienne de la teinture d’A. montana contre S. mutans et E. faecalis, avec des valeurs de CMI de 62,5 mg/mL et 8 mg/mL, respectivement. Dans le même temps, Amato et al. ont testé l’activité antimicrobienne d’un extrait éthanolique d’A. montana contre diverses bactéries et levures de Candida spp. Ils ont mis en évidence une croissance de toutes les souches bactériennes à différentes concentrations d’extrait, à l’exception de B. subtilis et de P. aeruginosa. Dans ces conditions expérimentales, A. montana n’a présenté aucune activité susceptible de justifier son utilisation comme agent antimicrobien. En outre, il a été démontré que les extraits d’arnica possédaient la capacité d’entraver le développement des biofilms bactériens. Cette propriété est très prometteuse pour des applications dans le domaine de l’antibiothérapie et du traitement antifongique topiques, ainsi que dans la prise en charge de diverses formes d’inflammation orale et oropharyngée. La littérature disponible n’apporte toutefois pas de preuves solides de l’efficacité de l’arnica contre les bactéries d’Acinetobacter spp. Le traitement des infections à Acinetobacter repose actuellement sur de nouvelles antibiothérapies ou d’autres méthodes plutôt que sur des remèdes traditionnels tels que l’arnica. Dans cette étude, l’extrait éthanolique de fleurs d’A. montana a présenté de fortes propriétés bactéricides contre les souches de référence d’Acinetobacter spp., avec des valeurs de CMI comprises entre 234,4 et 468,75 µg/mL et des valeurs de CMB au même niveau de 937,5 µg/mL. Les valeurs de CMI ont montré que l’extrait éthanolique d’arnica était actif contre les cellules planctoniques des souches de référence de l’espèce A. baumannii. Nous avons observé une diminution de la croissance bactérienne lorsque la concentration de l’extrait éthanolique dépassait 468,8 µg/mL. Pour Acinetobacter ATCC 19606, la croissance des cellules planctoniques était inhibée de 81,3 à 94,3 %, tandis que, pour ATCC 3252, l’inhibition était comprise entre 88,4 et 95,0 %. La présence d’éthanol inhibait la croissance des cellules planctoniques de ces bactéries (à des concentrations correspondant à une CMI de l’extrait > 468,8 μg/mL), avec une inhibition de la croissance comprise entre 91,5 et 96,3 % pour A. baumannii ATCC 19606 et entre 95,6 et 96,3 % pour A. baumannii ATCC 3252. À une concentration inférieure, l’extrait était deux fois plus efficace que l’éthanol pur pour inhiber la croissance bactérienne. Cela suggère que l’extrait d’arnica pourrait agir en associant ou en renforçant les effets du solvant et des substances qu’il contient. À des concentrations élevées, le solvant lui-même était plus toxique pour les bactéries que l’extrait contenant des composés végétaux bioactifs (par exemple, des LST ou des flavonoïdes). En outre, des concentrations subinhibitrices de l’extrait ont inhibé la formation du biofilm d’A. baumannii, probablement en affectant des processus tels que la colonisation des surfaces, l’adhérence et le développement du biofilm. Comme le montre la littérature existante, les concentrations subinhibitrices d’extraits végétaux ont la capacité d’inhiber la formation du biofilm chez de nombreuses souches bactériennes, notamment les bacilles à Gram négatif. Plusieurs études ont rapporté que certains extraits végétaux, tels que Piper betle, avaient la capacité de réduire considérablement la croissance des biofilms, voire d’éradiquer les biofilms matures, à des concentrations de ¼ CMI ou de ½ CMI. Cette activité est attribuée à la capacité de l’extrait à modifier les protéines de surface bactériennes, à perturber la formation de la matrice polysaccharidique du biofilm et, éventuellement, à interférer avec les mécanismes de détection du quorum. Plusieurs autres mécanismes d’action ont par ailleurs été postulés. Il a été démontré que la présence d’extraits végétaux entraînait la formation d’une couche défavorable sur les surfaces biotiques et abiotiques, empêchant ainsi les bactéries d’adhérer à de nouvelles surfaces et de les coloniser. Les extraits de plantes médicinales riches en huiles essentielles (par exemple, Thymus zygis, Rosmarinus officinalis, Origanum majorana et Lippia graveolens) ont la capacité de pénétrer et de déstabiliser la matrice polysaccharidique complexe qui constitue la base structurale des biofilms bactériens, provoquant ainsi leur détachement. En outre, ces extraits perturbent les signaux de communication par détection du quorum que les bactéries utilisent pour orchestrer la formation de biofilms bactériens robustes et résistants, entravant ainsi la progression des biofilms matures.
La formation de biofilm joue un rôle essentiel dans l’émergence et la persistance des infections multirésistantes à Acinetobacter, car elle protège les bactéries des facteurs de stress environnementaux et des agents antimicrobiens, facilitant ainsi leur présence prolongée dans les milieux cliniques. Les principaux gènes d’A. baumannii impliqués dans la formation du biofilm comprennent bap, qui code une protéine associée au biofilm ; l’opéron csu, responsable de la construction des pili d’adhérence ; et des gènes tels qu’ompA, pgaA/pgaB, epsA, bfmR-bfmS et ptk, qui contribuent à la structure et à la maturation du biofilm ainsi qu’à son interaction avec les surfaces. Ces gènes sont souvent associés à la résistance aux antibiotiques et à la persistance d’A. baumannii dans les milieux hospitaliers, ce qui en fait des cibles importantes pour comprendre et combattre l’infection.
Bap (protéine associée au biofilm) est une grande protéine exprimée à la surface de la cellule bactérienne. Elle est supposée jouer un rôle crucial dans le processus d’adhérence intercellulaire, l’accumulation et l’agrégation des cellules bactériennes, le développement du biofilm et la formation de structures tridimensionnelles complexes. De nombreux isolats d’A. baumannii porteurs du gène bap forment des biofilms sur des surfaces biotiques comme abiotiques dans des conditions stationnaires. Le rôle essentiel du gène bap dans la formation du biofilm a été confirmé chez Staphylococcus xylosus, où toutes les souches productrices de biofilm contenaient bap, tandis que la seule souche ne formant pas de biofilm, TMW 2.1602, portait une séquence bap tronquée.
L’opéron csu, qui comprend six gènes (csuA/B, csuA, csuB, csuC, csuD et csuE), est conservé chez la plupart des espèces d’Acinetobacter spp. cliniquement importantes et code un système d’assemblage des pili chaperon-usher important pour l’adhérence aux surfaces et la formation du biofilm. Une première étude de Tomaras et al. a démontré qu’une mutation de csuC ou de csuE chez A. baumannii ATCC 19606 entraînait la perte des pili observés chez la souche parentale et une incapacité à former un biofilm. Une autre étude a indiqué que les mutants d’A. baumannii ATCC 17978 dépourvus de csuD ne produisaient pas non plus de pili Csu et étaient totalement incapables de former des structures de biofilm visibles. Les résultats d’une autre étude ont révélé que les principaux clones épidémiques ST191 d’A. baumannii présentaient des masses de biofilm significativement supérieures à celles des clones épidémiques mineurs et des clones sporadiques. Cette formation accrue de biofilm était corrélée à une augmentation des niveaux d’expression des gènes csuC, csuD et csuE dans les principaux clones épidémiques. Bien que l’expression de bap ait été élevée dans les clones épidémiques majeurs et mineurs par rapport aux clones sporadiques, elle ne différait pas significativement entre les deux groupes épidémiques. Ces résultats suggèrent que l’expression différentielle de certains gènes de l’opéron csu joue un rôle clé dans la variabilité de la formation du biofilm entre les clones épidémiques. Le mutant 37662RM2 d’A. baumannii résistant aux carbapénèmes, dépourvu de synthèse de capsule mais présentant une formation de biofilm nettement accrue, a montré une surexpression significative de l’opéron csu et de ses gènes régulateurs bfmR-bfmS par rapport à la souche sauvage 37662. En revanche, l’expression de bap n’était que légèrement modifiée. Ces données impliquent que l’augmentation du phénotype de biofilm de 37662RM2 est principalement due à la régulation positive de l’opéron csu et de ses régulateurs, ce qui souligne leur rôle essentiel dans le développement du biofilm indépendamment de la production de capsule. Ahmad et al. ont souligné le rôle multiple des pili Csu dans la pathogénicité d’A. baumannii. Il a été montré que les pili Csu facilitaient l’adhérence bactérienne aux cellules épithéliales pulmonaires et contribuaient à la formation de biofilms structurellement complexes. Kishii et al. ont étudié la relation entre la formation du biofilm et la présence et l’activité transcriptionnelle des gènes associés au biofilm chez des souches cliniques d’A. baumannii recueillies dans des hôpitaux japonais. Ils ont constaté que 73,7 % des isolats portaient l’opéron csu complet, tandis que les autres étaient dépourvus de ces gènes. En revanche, ompA et abaI (auto-inducteur de la détection du quorum) étaient présents dans tous les isolats. Les souches dépourvues de l’opéron csu présentaient une faible formation de biofilm, tandis que les souches positives pour csu exprimant les gènes de l’opéron produisaient fortement du biofilm. Fait intéressant, certaines souches positives pour csu n’exprimaient pas l’opéron, mais formaient néanmoins des biofilms intermédiaires. Cela suggère que les pili pourraient ne pas être strictement nécessaires au développement du biofilm et que d’autres facteurs d’adhérence pourraient compenser l’absence d’un système Csu fonctionnel. OmpA (protéine A de la membrane externe) est largement reconnue pour son rôle dans l’adhérence bactérienne et la formation du biofilm, contribuant à la stabilité globale de la structure du biofilm. De plus, le rôle d’ompA dans le phénotype de multirésistance d’A. baumannii a été démontré, puisque l’inactivation du gène ompA a entraîné une diminution des CMI du chloramphénicol, de l’aztréonam et de l’acide nalidixique. Dans une autre étude, un mutant ΔompA d’A. nosocomialis ATCC 17903 présentait une formation de biofilm significativement réduite et une adhérence moindre aux cellules épithéliales humaines. La délétion du gène ompA a significativement réduit la dissémination bactérienne entre les organes et altéré le développement d’une pneumonie secondaire dans un modèle murin d’infection. Une autre étude a démontré un lien entre l’expression élevée d’ompA et la réponse adaptative des cellules persistantes d’A. baumannii à l’exposition au méropénème, indiquant que cette régulation positive pouvait améliorer la survie bactérienne pendant le traitement antibiotique et contribuer aux mécanismes de persistance. En outre, les souches présentant une expression protéique élevée étaient plus invasives. Na et al. ont recherché de petites molécules ciblant l’activité du promoteur d’ompA chez A. baumannii. L’étude a identifié trois composés chimiques qui inhibaient l’expression chez A. baumannii. Encinales et al. ont proposé que le blocage d’OmpA puisse constituer une nouvelle stratégie thérapeutique contre les infections à bacilles à Gram négatif, en particulier celles causées par A. baumannii. Ces résultats ont montré que la surexpression de la protéine OmpA était significativement corrélée à des risques plus élevés de pneumonie, de bactériémie et de mortalité, soulignant le rôle central de la protéine OmpA dans la gravité de la maladie et les résultats cliniques.
Pris dans leur ensemble, les gènes énumérés ci-dessus contribuent à la capacité d’A. baumannii à former des biofilms qui protègent les bactéries des réponses immunitaires de l’hôte et des antibiotiques, entraînant des infections chroniques et difficiles à traiter. Dans une étude de Kasperski et al., 72 % des 100 isolats d’A. baumannii testés, obtenus auprès de patients hospitalisés, étaient de forts producteurs de biofilm et portaient systématiquement les gènes bap, csuE et ompA. Une autre étude portant sur 107 isolats d’A. baumannii issus de sources cliniques et environnementales a rapporté que 31,2 % des souches cliniques et 58,7 % des souches environnementales étaient de fortes productrices de biofilm, ompA étant détecté dans tous les isolats et bap présent dans 89 souches. Saadati et al. ont rapporté une forte prévalence des gènes associés au biofilm dans 100 isolats cliniques d’A. baumannii, toutes les souches étant positives pour ompA et 89 portant le gène bap. De plus, tous les isolats étaient MDR et 79 % étaient ultrarésistants (XDR). Yang et al. ont constaté que 144 des 154 souches d’A. baumannii produisaient des biofilms, 79,2 % étant positives pour bap, 68,8 % pour csuE et 91,6 % pour ompA. L’étude a démontré que les souches portant les gènes bap, ompA et csuE formaient des biofilms plus robustes que celles qui en étaient dépourvues. Fait intéressant, les dix souches d’A. baumannii ne formant pas de biofilm contenaient toutes le gène ompA, tandis que bap et csuE étaient détectés dans six et sept de ces souches, respectivement. Amin et al. ont analysé 64 isolats d’A. baumannii provenant de cas d’infection de brûlures, fournissant des informations importantes sur la présence et l’expression des gènes associés au biofilm. Alors que des gènes tels qu’ompA et abaI ont été détectés dans les isolats producteurs et non producteurs de biofilm, le gène bap a été trouvé exclusivement parmi les producteurs de biofilm. En outre, les niveaux d’expression de tous les gènes liés au biofilm étaient significativement plus élevés chez les forts producteurs de biofilm que chez les producteurs modérés ou faibles. Ces résultats indiquent que la présence comme les niveaux d’expression des gènes associés au biofilm ont une incidence cruciale sur la capacité des bactéries à former des biofilms.
Dans cette étude, outre l’évaluation des activités antibactérienne et antibiofilm de l’extrait éthanolique d’A. montana, son influence sur l’expression des gènes liés au biofilm chez A. baumannii a été étudiée. La régulation transcriptionnelle des gènes associés au biofilm (bap, csuABCD, ompA) a été évaluée après une exposition à des concentrations subinhibitrices de ½ CMI et de ¼ CMI d’extrait d’A. montana, ainsi que dans des témoins de solvant aux concentrations correspondantes, et comparée à celle des bactéries non traitées. Dans la plupart des cas, le traitement a entraîné une forte diminution de l’expression des gènes cibles, à l’exception de bap, dont l’expression est restée inchangée.
Contrairement à nos résultats, l’extrait méthanolique de Nothoscordum bivalve, qui inhibait la formation du biofilm chez A. baumannii, augmentait légèrement l’expression de bap à 50 % de la CMB = 3,74 mg/mL et à 75 % de la CMB = 5,61 mg/mL. Pourtant, les bactéries traitées uniquement avec le solvant (méthanol à 50 et 75 % de la CMB) ne présentaient aucune modification de l’expression de bap, ce qui concorde avec nos résultats. Une étude apparentée sur A. baumannii a examiné l’effet de nanoparticules sur la formation du biofilm et l’expression des gènes bap et csu. Par rapport au témoin, un traitement par des nanoparticules d’argent à la CMI (6,25 μg/mL) a entraîné une diminution de l’expression de bap, csuC et csuE. En revanche, des nanoparticules d’or conjuguées à la vancomycine à la CMI (0,625 μg/mL) ont augmenté l’expression de csuC et de csuE, mais diminué celle de bap par rapport aux témoins. Malgré ces réponses transcriptionnelles différentes, les deux types de nanoparticules ont présenté des effets inhibiteurs sur la formation du biofilm, ce qui suggère des mécanismes d’action sous-jacents distincts.
Les différents extraits et composés végétaux varient dans leur inhibition de la formation des biofilms bactériens, ce qui souligne la complexité et la spécificité de leurs actions antibiofilm. Choudhary et al. ont démontré que l’eugénol et le géraniol présentaient des propriétés antibiofilm chez A. baumannii, tout en entraînant une diminution de l’expression de csuE et une inhibition de la formation du biofilm par interférence avec les mécanismes d’assemblage des pili. Une étude récente de l’extrait éthanolique d’Origanum vulgare a démontré son effet sur les gènes associés à la virulence des bactéries de la plaque dentaire. Chez Streptococcus mitis SA5, l’expression de bapA1 était significativement diminuée à la concentration d’extrait la plus élevée (0,781 mg/mL), sans effet significatif aux doses plus faibles. Chez S. epidermidis, la propolis interférait avec le développement du biofilm en réduisant la transcription de gènes associés au biofilm. De même, il a été constaté que l’extrait de Cleome droserifolia réprimait la transcription de gènes liés au biofilm dans 43 % des isolats de S. aureus testés, fournissant une base moléculaire à son activité antibiofilm. Chez les isolats de Proteus mirabilis formant un biofilm, il a été montré qu’un extrait de la plante médicinale traditionnelle Alhagi maurorum réduisait la production de biofilm tout en présentant des activités antiadhésive et anti-détection du quorum dépendantes de la concentration. Ces résultats étaient étayés par des données transcriptomiques indiquant une diminution de l’expression des gènes associés à la régulation du biofilm. L’exposition de S. aureus à 0,5 × CMI d’extrait à l’acétate d’éthyle de Thesium chinense a entraîné une reprogrammation transcriptionnelle, avec 531 gènes dont l’expression augmentait et 340 dont l’expression diminuait. Les gènes réprimés comprenaient notamment ceux impliqués dans la formation du biofilm. Ranfaing et al. ont étudié par analyse sur puce à ADN les effets transcriptomiques des proanthocyanidines de canneberge (190 µg/mL), de la propolis (102,4 µg/mL) et de leur association sur une souche clinique uropathogène d’Escherichia coli. La propolis a potentialisé les effets des proanthocyanidines de canneberge, entraînant une diminution de l’expression d’un plus grand nombre de gènes liés à l’adhérence et au biofilm. Dans une autre étude, Liu et al. ont démontré que l’extrait de la phase méthanolique de Rumex madaio exerçait des modifications transcriptionnelles propres à l’espèce et à la souche. Plus précisément, Vibrio alginolyticus ATCC 17749 augmentait l’expression des gènes liés à la détection du quorum, tandis que Vibrio parahaemolyticus B4-10 diminuait principalement leur transcription. En revanche, la détection du quorum ne figurait pas parmi les voies métaboliques significativement affectées chez V. parahaemolyticus ATCC 17802, ce qui souligne une variabilité transcriptionnelle dépendante de la souche. Ces résultats soulignent la complexité des interactions entre les extraits végétaux et les bactéries, dans lesquelles des caractères de virulence conservés tels que la détection du quorum peuvent être ciblés de diverses manières selon les espèces et les souches, influençant en définitive la capacité de ces agents pathogènes à amorcer et à maintenir la formation d’un biofilm.
Cela concorde avec nos résultats, qui indiquent également des réponses dépendantes de la souche aux antimicrobiens d’origine végétale. Notre étude a utilisé deux souches d’A. baumannii : ATCC 19606, une souche de référence bien établie couramment employée dans les recherches sur le biofilm et la virulence en raison de sa relative sensibilité aux antibiotiques, et ATCC BAA-3252, un isolat multirésistant d’origine clinique qui reflète les difficultés thérapeutiques posées par les infections cliniques contemporaines. Alors que des concentrations sous-CMI d’extrait d’A. montana ont significativement diminué l’expression de csuD et d’ompA chez A. baumannii ATCC 19606, aucune modification transcriptionnelle comparable n’a été détectée chez ATCC BAA-3252. Cette variabilité souligne l’hétérogénéité de la régulation de la virulence entre les différents isolats et met en évidence l’importance d’évaluer les agents antibiofilm d’origine végétale sur plusieurs souches.
Ces résultats concordent avec les observations de Khosravy et al., qui ont analysé des souches d’A. baumannii ultrarésistantes (XDR) isolées chez des patients en soins intensifs. Ils ont constaté que les isolats cliniques présentaient une augmentation de l’expression des gènes du biofilm par rapport à la souche de référence ATCC 19606, notamment une expression de bap environ 12 fois supérieure. Kakavan et al. ont également rapporté une association significative entre la surexpression de bap et la résistance aux antibiotiques dans une étude portant sur 100 isolats cliniques d’A. baumannii obtenus auprès de patients hospitalisés. Leurs résultats ont démontré une corrélation directe entre la capacité de production du biofilm et l’expression de bap, les isolats produisant fortement un biofilm présentant les niveaux d’expression de bap les plus élevés. Ces observations suggèrent que le gène bap pourrait représenter une cible prometteuse pour la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques contre A. baumannii. Bien que le gène bap joue un rôle essentiel dans la formation du biofilm, nos résultats indiquent que l’activité antibiofilm de l’extrait d’A. montana pourrait ne pas être directement médiée par la régulation transcriptionnelle de ce gène, puisque son expression est restée inchangée pendant le traitement. Cela implique que l’extrait inhibe le développement du biofilm en ciblant d’autres facteurs de virulence liés à sa formation. Selon les résultats obtenus, A. baumannii ATCC 19606 a présenté une diminution de l’expression de l’opéron csuABCD ainsi que du gène ompA, ce qui indique une répression plus large des gènes liés à la formation du biofilm et à la structure de la membrane externe. En revanche, la souche ATCC BAA-3252 a présenté une diminution de l’expression limitée à csuB et csuC, ce qui suggère un effet plus sélectif sur les gènes associés au biofilm. Cette expression génique différentielle implique qu’ATCC 19606 pourrait connaître une modification plus globale de l’assemblage du biofilm et des propriétés de la surface cellulaire qu’ATCC BAA-3252. En outre, A. baumannii ATCC 19606 et ATCC BAA-3252 ont présenté des similitudes et des différences dans leurs profils de sensibilité aux antimicrobiens. Les deux souches avaient la même CMB de 937,5 µg/mL, ce qui indique une concentration comparable d’extrait éthanolique nécessaire pour tuer les cellules planctoniques des bactéries. Les valeurs de CMI différaient toutefois : la CMI d’ATCC 19606 (468,75 µg/mL) était deux fois supérieure à celle d’ATCC BAA-3252 (234,4 µg/mL). Cela suggère que, si les deux souches nécessitent le même niveau bactéricide d’extrait éthanolique d’arnica, ATCC BAA-3252 est inhibée à une concentration plus faible, ce qui indique une sensibilité légèrement supérieure. Cette différence de valeurs de CMI met en évidence une variation de l’efficacité antimicrobienne propre à la souche, malgré des seuils bactéricides similaires. Une compréhension approfondie de ces différences est essentielle à la mise au point et à l’optimisation de stratégies thérapeutiques ciblées contre A. baumannii et nécessite des études plus détaillées.
Dans la littérature disponible, les études comparant explicitement les effets d’extraits végétaux et des témoins de solvant correspondants sur l’expression génique bactérienne sont rares. Notre étude comble de manière originale cette lacune en incluant des témoins de solvant éthanolique adaptés aux concentrations des extraits. L’essai d’activité antibactérienne a démontré que, pour les deux souches d’A. baumannii testées, la CMI du témoin de solvant était deux fois supérieure à celle de l’extrait d’arnica. Ces résultats montrent clairement que les effets inhibiteurs observés sont principalement médiés par les composés bioactifs présents dans l’extrait plutôt que par l’éthanol seul. Nos résultats confirment toutefois également que l’éthanol, particulièrement à des concentrations élevées, peut contribuer de manière significative à l’inhibition de la croissance.
Chez la souche ATCC 19606, le témoin de solvant a provoqué des modifications de l’expression génique similaires à celles induites par l’extrait, ce qui suggère une influence transcriptionnelle due au solvant. À l’inverse, chez la souche ATCC BAA-3252, l’éthanol à ¼ CMI n’a pas supprimé l’expression de csuB et de csuC, tandis que l’extrait éthanolique d’arnica à concentration équivalente l’a fait. Cette divergence souligne que, chez la souche ATCC BAA-3252, la modulation de l’expression génique est principalement attribuable aux composés phytochimiques de l’extrait plutôt qu’aux effets du solvant.
Ces observations mettent en évidence une limite de l’utilisation de l’éthanol comme solvant, car son effet peut varier en fonction de la sensibilité de la souche et peut masquer ou imiter les effets de régulation génique. Parmi les explications possibles des différentes réponses figurent une tolérance ou une adaptation à l’éthanol propre à la souche, ainsi que la présence dans l’extrait de composés phytochimiques synergiques ou antagonistes influençant la régulation transcriptionnelle. Les limites de cette étude comprennent de possibles effets confondants du solvant sur la régulation génique et la nécessité d’isoler les composés actifs afin de préciser leurs rôles exacts. Des recherches supplémentaires utilisant des formulations sans solvant ou des composés purifiés sont nécessaires pour élucider les mécanismes qui sous-tendent ces observations. Néanmoins, nos résultats soulignent que l’effet inhibiteur sur l’expression de l’opéron csu chez ATCC BAA-3252 provient des composés phytochimiques actifs de l’extrait d’arnica, puisque l’éthanol seul n’a pas entraîné de suppression génique comparable. Cela met en évidence la contribution des constituants de l’extrait, au-delà du solvant, à la modulation de l’expression génique bactérienne.
Comme indiqué ci-dessus, la plupart des recherches publiées portent sur les effets des extraits eux-mêmes, en négligeant souvent l’influence des solvants ou en ne la contrôlant pas correctement. Notre étude apporte une contribution originale en incluant un témoin de solvant éthanolique à des concentrations équivalentes à celles des traitements par l’extrait. Cette approche permet de distinguer plus clairement les modifications de l’expression génique provoquées par les composés bioactifs de celles potentiellement induites par le solvant. Les résultats soulignent l’importance d’intégrer de tels témoins afin d’évaluer avec précision les effets transcriptionnels propres aux extraits et d’éviter les erreurs d’interprétation dues aux artéfacts liés au solvant. L’intégration de témoins de solvant constitue donc une considération méthodologique essentielle pour les futures recherches visant à élucider la modulation de l’expression génique médiée par les extraits.
5. Conclusions
L’extrait éthanolique de fleurs d’A. montana L. contient des composés bioactifs qui exercent des effets bactéricides contre A. baumannii et inhibent la formation de son biofilm. Cette activité bactéricide, associée à la diminution de l’expression de gènes clés liés au biofilm, en particulier l’opéron csu et ompA, souligne le double mode d’action de l’extrait, qui cible à la fois la viabilité bactérienne et le développement du biofilm. En perturbant l’assemblage des pili et les mécanismes d’adhérence bactérienne, l’extrait entrave la formation du biofilm et accroît la sensibilité bactérienne aux agents antimicrobiens. Ces résultats mettent en évidence le potentiel des extraits éthanoliques d’A. montana L. comme stratégie thérapeutique complémentaire contre les infections causées par des souches d’A. baumannii résistantes aux antibiotiques. Des études supplémentaires sont toutefois nécessaires pour élucider de manière exhaustive les mécanismes antimicrobiens impliqués.
Annexe A
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