Arnica des montagnes - nanovecteurs Arnica-Ruscus, cicatrisation (Antioxidants 2026)

Nanovecteurs lipidiques nanostructurés modifiés par l’acide hyaluronique, associant Arnica montana et Ruscus aculeatus, pour accélérer la cicatrisation des plaies

Référence : Antioxidants 2026. — PMC13203602 · DOI 10.3390/antiox15050594 Type : étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Peau Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».

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Résumé

La cicatrisation des plaies cutanées implique un équilibre délicat entre les processus de prolifération et de remodelage, et présente d’importants défis thérapeutiques. Le présent travail visait à étudier la capacité de nanovecteurs lipidiques hybrides transportant un profil phytochimique complexe (extraits HA-NLC-ArnicaM et/ou RuscusA) à contrecarrer l’action destructrice des radicaux libres oxydants et à accélérer la fermeture d’une plaie induite sur des fibroblastes BJ. Les nanovecteurs lipidiques et hybrides ont des diamètres principaux compris entre 145 nm et 180 nm, un potentiel électrocinétique compris entre −45 mV et −62 mV, et une efficacité d’encapsulation des extraits végétaux supérieure à 96 %. Les HA-NLC contenant les extraits végétaux présentent un niveau approprié de biocompatibilité à des concentrations < 50 µg/mL. ArnicaM remporte la compétition antioxydante, tandis que RuscusA s’est révélé excellent pour accélérer le processus de fermeture de la plaie. Les NLC et HA-NLC encapsulant ArnicaM ont manifesté la plus forte capacité à neutraliser les radicaux libres DPPH, atteignant 79,4 % d’inhibition. Les fibroblastes BJ traités par les HA-NLC ont refermé la plaie plus rapidement que ceux traités par les NLC, les cellules atteignant une efficacité maximale de fermeture de la plaie lorsqu’elles étaient traitées avec 12,5 et 100 µg/mL de HA-NLC-RuscusA, suivis des HA-NLC-ArnicaM-RuscusA. Ces résultats facilitent la conception de remarquables nanovecteurs lipidiques hybrides, qui exploitent l’émergence d’une synergie pharmacologique entre composés phytochimiques et pourraient contribuer à stimuler les voies de signalisation et à favoriser une régénération cellulaire appropriée, nécessaire à la cicatrisation.

1. Introduction

La cicatrisation est un événement biologique complexe essentiel à la réparation et à la régénération des tissus. Une plaie est une rupture de la structure cutanée résultant de brûlures, de lésions mécaniques ou chimiques, ou de la présence d’une affection médicale ou physiologique sous-jacente. La cicatrisation implique un équilibre entre inflammation prolongée, prolifération et processus de remodelage, ce qui constitue un défi clinique important. Les méthodes conventionnelles se heurtent généralement à des contraintes telles que le risque d’infection et l’allongement du temps de cicatrisation. L’efficacité des phytoconstituants dans le traitement des plaies est devenue une approche fréquemment mentionnée en raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, antibactériennes et antioxydantes. Malgré l’efficacité des mélanges végétaux bioactifs, les obstacles liés à leur faible biodisponibilité et à leur stabilité insuffisante restent des préoccupations importantes. Les systèmes d’administration nanostructurés sont considérés comme une solution prometteuse pour ces phytoconstituants, d’autant que nombre d’entre eux présentent une excellente biocompatibilité, reproduisent étroitement la structure de la matrice extracellulaire et possèdent la capacité cruciale de maintenir un environnement propice à la cicatrisation.

Il existe une grande diversité de nanostructures organiques, telles que les nanomatériaux polymériques naturels (polysaccharides, protéines et peptides), qui ont démontré leur efficacité dans la cicatrisation de diverses manières, notamment par leurs propriétés antimicrobiennes, l’administration ciblée du principe actif au site de la plaie, la promotion de l’angiogenèse, l’immunomodulation et la régénération tissulaire. Parmi les différents types de nanovecteurs, les nanovecteurs lipidiques nanostructurés (NLC) gagnent en popularité pour les applications pharmacologiques topiques, car ils peuvent recevoir une charge utile plus élevée, éviter la fuite du médicament, améliorer l’hydratation cutanée et faciliter la pénétration des principes bioactifs plus profondément dans la peau. Développés pour la première fois en 1999, les NLC sont composés de lipides solides et, dans une moindre mesure, de lipides liquides ; ils sont biocompatibles, biodégradables et stabilisés par un ou plusieurs émulsifiants. En raison des imperfections de leur structure interne, les NLC ont une structure moins ordonnée que d’autres nanoparticules lipidiques, par exemple les nanoparticules lipidiques solides (SLN), ce qui leur permet de transporter davantage de substances actives hydrophobes et de les maintenir stables pendant le stockage. Les NLC améliorent la biodisponibilité des substances actives qu’ils hébergent, les protègent de la dégradation, permettent une administration ciblée et rendent le système d’administration plus efficace à faibles doses. En outre, ils n’améliorent pas seulement les caractéristiques des substances actives lipophiles, mais peuvent aussi constituer une voie prometteuse pour administrer simultanément des substances actives hydrophiles. Les NLC ont le potentiel de délivrer des substances actives végétales et pourraient également jouer un rôle crucial dans la prise en charge des plaies chroniques. Par exemple, des NLC chargés d’extrait de millepertuis ont montré un puissant effet cicatrisant et réduit le stress oxydatif et les lésions tissulaires, tout en améliorant les taux enzymatiques. L’association des avantages des NLC à l’acide hyaluronique (HA) accroît leur biocompatibilité et les rend plus précis et plus spécifiques de certaines affections. Le HA est un glycosaminoglycane hydrophile naturel composé d’unités de N-acétyl-D-glucosamine et d’acide D-glucuronique. Composant essentiel de la matrice extracellulaire, le HA possède une action de ciblage et améliore les propriétés physicochimiques, notamment la viscoélasticité et la mucoadhésivité, ce qui étend son utilité au ciblage de diverses maladies. Il forme également une couche protectrice d’hydratation qui contribue à la stabilité des NLC et empêche la libération prématurée de la substance active dans le milieu biologique. Outre ces caractéristiques souhaitables, le HA augmente l’hydrophilie des NLC et réduit l’adsorption non spécifique des protéines, ce qui peut prolonger leur circulation systémique. Des recherches récentes montrent que des HA-SLN transportant différentes substances actives de synthèse, par exemple le chlorhydrate de gemcitabine, l’irinotécan ou la dexaméthasone, ou d’origine végétale, par exemple la silybine, constituent des nanoplates-formes adaptées aux cellules tumorales MDA-MB-231 ou au traitement ciblé du cancer du côlon, au traitement de la perte auditive et à l’administration précise d’un médicament contre les lésions hépatiques alcooliques. Ces HA-SLN ont réduit la résistance aux médicaments, diminué la taille des tumeurs, amélioré le temps de rétention, régulé les taux d’antioxydants et assuré la réendothélialisation lors de la cicatrisation vasculaire. Des NLC ciblés optimisés, conjugués au HA et cochargés en atorvastatine et curcumine, ont amélioré l’efficacité contre le glioblastome, avec une efficacité huit fois supérieure à celle des médicaments libres. Peleje et ses collaborateurs ont conçu des NLC recouverts de HA contenant du docétaxel afin d’obtenir une cytotoxicité élevée dans les cellules de cancer du sein MCF-7. Les HA-SLN et HA-NLC ont amélioré la pharmacocinétique in vivo, montré des effets cytotoxiques plus importants, assuré une réduction de l’accumulation hépatique, inhibé l’adhésion cellulaire ou favorisé la prolifération des cellules endothéliales. De plus, les résultats remarquables obtenus avec des composés phytochimiques encapsulés dans des HA-NLC, l’hespéridine et la curcumine, soulignent que ces HA-NLC conviennent pour améliorer la stabilité, l’absorption cellulaire et l’efficacité des composés phytochimiques naturels, ainsi que les résultats thérapeutiques dans diverses maladies.

Compte tenu de la popularité persistante et des performances médicinales des composés phytochimiques, les propriétés bioactives des extraits d’Arnica montana (ArnicaM) et de Ruscus aculeatus (RuscusA) peuvent être efficacement exploitées au moyen de HA-NLC, ce qui appuie leur application à la cicatrisation des plaies cutanées. Les usages médicinaux de l’extrait d’ArnicaM ont été étayés par des rapports pharmacologiques scientifiques, qui ont mis en évidence une activité analgésique, une stimulation de la circulation, une action antiarthritique ainsi qu’une diminution des marqueurs inflammatoires et du stress oxydatif. ArnicaM a été utilisé comme remède homéopathique et est disponible sous forme de pommade topique ou de formulation orale, employée dans le traitement de la douleur et de l’œdème associés aux traumatismes. L’Organisation mondiale de la Santé a reconnu les usages d’ArnicaM comme traitement topique de la douleur et de l’inflammation. Plus de 150 composés thérapeutiquement actifs ont été identifiés dans l’extrait d’ArnicaM, notamment des composés polyphénoliques, des lactones sesquiterpéniques (hélénaline, dihydrohélénaline), des glycosides flavonoïdiques, des glucuronides de flavonoïdes (dérivés du kaempférol, de la quercétine et de la lutéoline), des caroténoïdes, des diterpènes, des coumarines, des acides phénoliques (acide caféique et ses dérivés, acides dicaféoylquiniques, caféate d’éthyle) et des oligosaccharides.

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L’extrait de RuscusA est aujourd’hui reconnu comme un remède traditionnel à base de plantes pour le traitement des troubles mineurs de la circulation veineuse et des hémorroïdes. Le rhizome et la racine de RuscusA ont été employés en médecine populaire et en phytothérapie moderne pour diverses affections dermatologiques et urinaires, les hémorroïdes et, en particulier, la prise en charge des troubles associés à l’insuffisance veineuse. Ces effets thérapeutiques sont principalement attribués à la présence de saponines stéroïdiennes telles que la ruscogénine et la néoruscogénine, ainsi que de flavonoïdes bioactifs. RuscusA présente un profil chimique complexe dominé par les saponines stéroïdiennes ; ses constituants caractéristiques sont la ruscogénine, le ruscoside et la ruscine. Les saponines stéroïdiennes possèdent un squelette carboné en C27 et contiennent un ou plusieurs résidus glucidiques ; leurs chaînes glucidiques sont composées d’unités α-L-rhamnose, β-D-galactose et β-D-glucose. Au-delà des saponines, RuscusA contient un ensemble diversifié de composés phénoliques et de flavonoïdes : dérivés de l’apigénine, de la quercétine et du kaempférol, notamment l’apigénine-C-hexoside-C-pentoside, la quercétine-O-désoxyhexoside-hexoside, l’hexoside d’acide caféique et le kaempférol-O-désoxyhexoside-hexoside. Des essais cliniques ont montré que RuscusA diminue le taux de filtration capillaire et réduit la perméabilité vasculaire chez des volontaires sains et des patients atteints de maladie veineuse chronique. Ces résultats remarquables ont conduit à la commercialisation de l’extrait de RuscusA dans diverses préparations pharmaceutiques et cosmétiques, en particulier celles destinées à améliorer le tonus veineux, à réduire l’œdème et à soulager les symptômes des troubles veineux chroniques.

À partir des effets thérapeutiques de RuscusA et d’ArnicaM, il apparaît indispensable de compléter les données scientifiques existantes sur ces extraits par les connaissances actuelles dans le domaine des NLC décorés de polymères. Bien que plusieurs études antérieures aient exploré les HA-NLC, elles se sont principalement concentrées sur l’administration individuelle de substances actives synthétiques ou naturelles, dans le but d’obtenir des propriétés antitumorales, de prendre en charge l’obésité, d’atténuer l’inflammation intestinale ou de maintenir l’homéostasie digestive. À notre connaissance, aucune étude antérieure n’a rapporté la mise au point de NLC recouverts de HA et chargés de RuscusA et d’ArnicaM, qui représentent une approche fonctionnelle unique. Cette distinction est importante compte tenu des caractéristiques supérieures et modulables des HA-NLC, associées à la bioefficacité de RuscusA et d’ArnicaM dans le traitement des maladies cutanées. L’innovation principale de ce travail consiste à étudier pour la première fois la capacité comparative de nanovecteurs lipidiques hybrides à contrecarrer l’action destructrice des radicaux libres oxydants et à accélérer la fermeture d’une plaie induite sur des fibroblastes BJ issus de peau humaine. L’efficacité et le succès potentiel des HA-NLC encapsulant ArnicaM et/ou RuscusA reposent sur la propriété du HA à orchestrer les composés phytochimiques actifs afin qu’ils déclenchent des cascades de signalisation intracellulaire agissant simultanément comme moteurs de la régénération cellulaire. L’impact de l’étude réside dans la synergie entre le profil structural des phytocomposés actifs des extraits d’ArnicaM et de RuscusA et les capacités structurales uniques du nanovecteur hybride glucidique-lipidique à stabiliser, administrer et libérer progressivement les substances phytochimiques actives.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériels

Le sel sodique d’acide hyaluronique (provenant de Streptococcus equi), le réactif de Folin-Ciocâlteu, l’acide gallique, le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle, l’éthanol Chromasolv®, le tampon phosphate (PBS) et le poly(éthylène glycol)-bloc-poly(propylène glycol)-bloc-poly(éthylène glycol)/Poloxamer 188 ont été fournis par Sigma Aldrich Chemie GmbH (Schnelldorf, Allemagne). La lécithine de soja a été achetée auprès d’Alfa Aesar et le Tween 20 (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitan) auprès de Merck (Allemagne). Parmi les lipides, le monostéarate de glycérol (GMS) a été acheté auprès de Cognis GmbH (Monheim am Rhein, Allemagne) et le beurre de mangue auprès de Sobio Cosmetics SRL (Bucarest, Roumanie). L’huile de chardon-Marie a été achetée auprès d’Elemental (Oradea, Roumanie) et présentait la composition en acides gras suivante : 54,5 % d’acide linoléique (ω-6), 39,67 % d’acide oléique (ω-9), 8,67 % d’acide palmitique et 6,27 % de stéarate de méthyle. L’huile d’argan a été achetée auprès de SC Herbavit SRL (Oradea, Roumanie) et présentait la composition en acides gras suivante : 30,8 % d’acide linoléique (ω-6), 49,2 % d’acide oléique (ω-9), 13,93 % d’acide palmitique et 5,59 % de stéarate de méthyle. Les extraits végétaux d’Arnica montana et de Ruscus aculeatus L. ont été obtenus auprès de S.C. Hofigal Export Import SA (Bucarest, Roumanie). Les deux extraits, dont le profil phytochimique était riche en polyphénols, flavonoïdes, glycosides et glucuronides, acides phénoliques, ainsi qu’en lactones terpéniques et saponines stéroïdiennes, ont été isolés des fleurs et des racines d’ArnicaM et de RuscusA par extraction assistée par ultrasons (1 h, 40 °C, 80 kHz). L’extrait d’ArnicaM présente une teneur en polyphénols de 57 mg EAG/g de lyophilisat et une teneur totale en flavones de 220,76 mg/g d’extrait lyophilisé (exprimée en équivalents quercétine). Les quantités de polyphénols déterminées dans l’extrait de RuscusA étaient de 29,03 mg EAG/g de lyophilisat, avec une teneur totale en flavonoïdes de 18 mg/g d’extrait lyophilisé.

2.2. Préparation des nanovecteurs lipidiques nanostructurés et des NLC modifiés par le HA

Les NLC sans extrait et les NLC chargés d’extraits phytochimiques ont été préparés par la méthode d’émulsification à chaud couplée à une homogénéisation à haute pression, comme décrit précédemment par les auteurs. En bref, la phase lipidique, composée de monostéarate de glycérol, de beurre de mangue, d’huile de chardon-Marie et d’huile d’argan, et la phase aqueuse, comprenant le mélange de tensioactifs (Tween 20, Poloxamer 188 et lécithine de soja) et les extraits phytochimiques, ont été combinées à 70 °C, puis la préémulsion obtenue a été maintenue sous agitation constante à la même température pendant 15 min. Chaque préémulsion a ensuite été traitée par homogénéisation à fort cisaillement (High Shear Homogenizer PRO250, Oxford, Connecticut, États-Unis) à 12 000 tr/min pendant 1 min, puis par homogénéisation à haute pression (APV 2000 Lab Homogenizer, Holzwickede, Allemagne) durant six cycles à 500 bars, pendant 196 secondes.

Pour préparer les NLC dont la surface était décorée de HA, 30 mL d’une solution aqueuse de HA (2 mg/mL) ont été ajoutés goutte à goutte, sous agitation vigoureuse, à 60 mL de dispersion de NLC à 37 °C. Les nanodispersions obtenues ont été refroidies à température ambiante, conservées pendant une nuit à −25 °C, puis lyophilisées (−55 °C, 0,05 mbar, 54 h) au moyen d’un lyophilisateur Martin Christ Alpha 1–2 LD (Osterode am Harz, Allemagne).

2.3. Analyse de la taille et de la stabilité physique

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a été utilisée pour mesurer le diamètre particulaire moyen (Z_moy) et l’indice de polydispersité (PdI) des systèmes NLC synthétisés, au moyen d’un Zetasizer ZS 90 (Malvern Instruments Inc., Worcestershire, Royaume-Uni), équipé d’un laser à l’état solide (670 nm), avec un angle de diffusion de 90°. Les échantillons destinés à la DLS ont été obtenus après dilution de la dispersion aqueuse de NLC afin d’atteindre une intensité de diffusion appropriée.

La stabilité physique des dispersions de NLC a été évaluée en mesurant les charges de surface au moyen du Zetasizer ZS 90 (Malvern Instruments Inc., Worcestershire, Royaume-Uni) dans une cellule capillaire. Après l’analyse, la mobilité électrophorétique obtenue a été convertie en potentiel zêta à l’aide de l’équation de Helmholtz-Smoluchowski (équation (1)) :

ξ = EM × 4πη/ε (1)

où ξ représente le potentiel zêta, EM la mobilité électrophorétique, η la viscosité du milieu de dispersion et ε la constante diélectrique.

2.4. Efficacité d’encapsulation des extraits phytochimiques

L’efficacité d’encapsulation des extraits d’Arnica montana et de Ruscus aculeatus a été évaluée en déterminant la teneur totale en polyphénols extraits dans l’eau à partir d’une quantité connue de NLC et de HA-NLC lyophilisés. La teneur totale en polyphénols a été quantifiée par le dosage de Folin-Ciocâlteu et exprimée en équivalents d’acide gallique (EAG). En bref, 0,15 g de NLC lyophilisé ont été mis en suspension dans 1 mL d’eau, agités doucement, puis centrifugés pendant 5 min à 15 000 tr/min. Un volume de 0,5 mL de surnageant a été prélevé, mélangé à 2 mL de réactif de Folin-Ciocâlteu à 10 % (v/v) et à 2,5 mL de Na₂CO₃ à 7,5 %, puis incubé pendant 1 h dans l’obscurité à température ambiante. L’absorbance a été mesurée à λ = 765 nm en trois exemplaires (spectrophotomètre UV-Vis V670 Jasco, Tokyo, Japon), et la concentration en polyphénols a été calculée à partir d’une courbe d’étalonnage de l’acide gallique (R² = 0,9919, plage de 0 à 100 mg/mL). L’efficacité d’encapsulation des extraits phytochimiques (EE) a été calculée au moyen de l’équation (2) :

EE (%) = C_NLC/C_extrait × 100 (2)

où C_NLC représente la teneur en polyphénols encapsulés dans les NLC et C_extrait la teneur en polyphénols d’Arnica montana ou de Ruscus aculeatus.

2.5. Activité antioxydante in vitro

L’activité antioxydante in vitro des systèmes NLC sans extrait et chargés a été déterminée au moyen du test au 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH). En pratique, 3 mL d’une solution éthanolique de DPPH (0,04 mg/mL) ont été mélangés à 2 mL de solution de NLC (2 mg/mL), puis incubés pendant 30 min dans l’obscurité. L’échantillon a ensuite été analysé par spectroscopie UV-Vis (spectrophotomètre UV-Vis V670 Jasco, Tokyo, Japon) à λ = 517 nm, et l’effet piégeur a été calculé à l’aide de l’équation (3) :

% d’inhibition du DPPH = (A_c − A_s)/A_c × 100 (3)

où A_c représente l’absorbance du témoin (échantillon préparé de la même manière, mais en remplaçant la solution de NLC par de l’éthanol) et A_s l’absorbance de l’échantillon de NLC. Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires.

Les valeurs de CI₅₀ (mg/mL), correspondant à la concentration nécessaire pour inhiber 50 % des radicaux DPPH, ont été calculées à partir de la régression du pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de l’échantillon (0,5 à 2 mg/mL).

2.6. Calorimétrie différentielle à balayage

La calorimétrie différentielle à balayage (Netzsch DSC 204 F1 Phoenix, Selb, Allemagne) a été utilisée pour étudier les propriétés thermiques des NLC lyophilisés. Les échantillons (environ 20 mg ; NLC sans extrait et/ou chargés) ont été placés dans des creusets en aluminium scellés et soumis à un programme de température allant de 25 à 100 °C, à une vitesse de chauffage de 10 °C/min, sous atmosphère d’azote (40 mL/min). Un creuset vide en aluminium a servi de référence.

2.7. Libération in vitro d’ArnicaM et de RuscusA

Les études de libération in vitro des polyphénols à partir des formulations de type NLC et HA-NLC ont été réalisées au moyen d’une cellule de diffusion de Franz (Hanson Research Corporation, Chatsworth, Californie, États-Unis). L’expérience type a été menée comme suit : la chambre réceptrice a été remplie avec le milieu (éthanol:eau = 1:1 v/v), tandis que 200 µL de dispersion de NLC ont été placés dans la chambre donneuse sur une membrane Strat-M™, modèle d’essai de diffusion transdermique (Millipore, Allemagne). Le milieu récepteur a été maintenu à 37 °C sous agitation constante à 400 tr/min ; à des intervalles précis de 1 h, 0,5 mL d’échantillon ont été prélevés dans la chambre réceptrice pour analyse quantitative (voir section 2.4) et simultanément remplacés par un volume égal de milieu récepteur frais. L’expérience a duré 7 h.

La cinétique de libération des polyphénols a été déterminée en appliquant les équations de cinq modèles mathématiques : ordre zéro, premier ordre, Higuchi, Hixson-Crowell et Peppas-Korsmeyer. Le modèle optimal de cinétique de libération a été sélectionné d’après la valeur de R² la plus élevée.

2.8. Fibroblastes cutanés BJ

Des fibroblastes cutanés humains (BJ, ATCC®, CRL-2522™, Manassas, Virginie, États-Unis) ont été cultivés dans du DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco) supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal (Gibco), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine (Gibco), dans une atmosphère humidifiée composée de 95 % d’air et de 5 % de CO₂, à 37 °C. Selon les expériences, différentes densités cellulaires ont été utilisées, comme indiqué ci-dessous. Tous les milieux et réactifs de culture cellulaire ont été achetés auprès de Gibco (New York, New York, États-Unis).

2.9. Test de viabilité cellulaire

Le test de viabilité cellulaire a été réalisé dans une plaque à 96 puits, avec 7 000 cellules ensemencées dans chaque puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées pendant 24 h ou 48 h supplémentaires avec différentes concentrations des composés (0, 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 µg/mL). Après la durée de traitement souhaitée, le milieu a été remplacé par une solution de MTT à 1 mg/mL (Serva, Heidelberg, Allemagne), puis incubé pendant 3 à 4 h à 37 °C. Le milieu a ensuite été retiré et les cristaux violets de formazan formés par les cellules métaboliquement actives ont été dissous dans 100 µL de DMSO. Enfin, l’absorbance de la solution a été mesurée à 570 nm au moyen d’un lecteur de plaques Mithras LB 940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne), et la viabilité cellulaire a été calculée par rapport aux témoins non traités. Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires et répétées au moins trois fois.

2.10. Libération du marqueur de lésions cellulaires, la lactate déshydrogénase (LDH)

La libération de LDH a été mesurée à l’aide du test de cytotoxicité Invitrogen™ CyQUANT™ LDH (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis), avec le même ensemencement que précédemment. Après la durée de traitement souhaitée, 50 µL du milieu de chaque puits ont été transférés dans une plaque à fond plat de 96 puits et mélangés à un volume égal de milieu réactionnel. La plaque a été incubée pendant 30 min, à l’abri de la lumière et à température ambiante. Puis 50 µL de solution d’arrêt ont été ajoutés dans chaque puits et mélangés par de légers tapotements. Enfin, l’absorbance a été mesurée à λ = 490 nm et les taux de LDH ont été calculés par comparaison avec la condition témoin. Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires et répétées au moins trois fois.

2.11. Évaluation morphologique par microscopie en fluorescence

Les modifications morphologiques ont été étudiées en colorant les filaments d’actine à la phalloïdine-FITC (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, États-Unis), puis en les observant au moyen d’un microscope à épifluorescence Olympus BX-51 (Olympus, Düsseldorf, Allemagne) équipé d’un objectif 40×. À cette fin, les cellules ont été cultivées sur une lamelle en présence de deux concentrations d’échantillons (12,5 et 100 µg/mL) pendant 24 h. Elles ont ensuite été lavées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS), fixées avec du formaldéhyde à 4 %, de nouveau lavées trois fois au PBS, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS, puis encore lavées trois fois au PBS. Enfin, le colorant fluorescent a été ajouté aux cellules et laissé pendant 1,5 h dans l’obscurité, à température ambiante. Lors de la dernière étape, les cellules ont été lavées trois fois au PBS et fixées avec FluorSave™ (Merck, Darmstadt, Allemagne). Les images ont ensuite été pseudocolorées à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.53a, Madison, Wisconsin, États-Unis). Elles ont par ailleurs été analysées au moyen d’une routine MATLAB R2020a précédemment décrite afin d’évaluer les modifications du cytosquelette.

2.12. Test de cicatrisation

La capacité de migration des cellules BJ traitées pendant 24 h à deux concentrations (12,5 et 100 µg/mL) a été évaluée par le test de rayure. Les cellules ont d’abord été cultivées en monocouche confluente au moyen d’un insert de culture Ibidi à deux puits, créant une plaie d’une largeur de 500 µm ± 100 µm. Après retrait des inserts, les cellules ont été traitées avec les systèmes NLC et HA-NLC aux concentrations souhaitées et imagées au départ, puis à plusieurs reprises après l’exposition (4, 24 et 30 h), à l’aide d’un microscope inversé (microscope binoculaire Olympus CX23, Düsseldorf, Allemagne) équipé d’un objectif 10×. Chaque condition a été testée en trois exemplaires et l’expérience a été répétée au moins deux fois sur des passages cellulaires différents. La largeur de la plaie et le pourcentage de fermeture ont été déterminés comme décrit précédemment.

3. Résultats

3.1. Détermination des paramètres de taille et de la stabilité physique des NLC et des NLC modifiés par un glucide, cochargés d’ArnicaM et/ou de RuscusA

Les mesures par DLS et du potentiel zêta révèlent la formation de dispersions de NLC présentant des caractéristiques physiques adaptées aux applications cutanées. Toutes les formulations avaient des dimensions inférieures à 200 nm — et même à 150 nm dans le cas des HA-NLC-ArnicaM —, avec des valeurs de PdI proches de 0,2, démontrant ainsi l’affinité et la conception robuste de la matrice lipidique pour l’encapsulation d’extraits végétaux complexes. Le potentiel électrocinétique présente des valeurs suffisamment négatives pour assurer la stabilité physique par répulsions électrostatiques. Outre ces observations générales, certaines informations instructives peuvent être obtenues ; par exemple, le recouvrement de la formulation de NLC sans extrait par le HA a entraîné une modification considérable du potentiel zêta (−51,9 ± 2,49 mV pour les NLC contre −61,8 ± 2,51 mV pour les HA-NLC). Comme le rapportent d’autres études, ce résultat est dû aux groupes carboxylates du HA et confirme donc la fixation réussie du polysaccharide à la surface des NLC. Le chargement de la formulation de NLC avec l’extrait d’ArnicaM entraîne une légère augmentation de la taille des particules, probablement en raison de l’intégration de la plupart des composés polyphénoliques dans la couche de tensioactifs, hypothèse confirmée par les caractéristiques des HA-NLC-ArnicaM (diamètre moyen plus faible et valeurs moins négatives du potentiel zêta). La localisation de ces composés dans la couche de tensioactifs facilite l’interaction avec le HA par des interactions non covalentes, favorisant un empilement plus compact des « couches » et masquant partiellement les charges négatives. En revanche, les modifications des caractéristiques des NLC-RuscusA et HA-NLC-RuscusA ne sont pas particulièrement importantes, peut-être en raison de la nature amphiphile de la ruscogénine, composant saponinique stéroïdien majeur de l’extrait de RuscusA. L’incorporation des deux extraits en quantités égales entraîne une légère augmentation de la taille moyenne des particules, qui reste néanmoins inférieure à 200 nm, démontrant la capacité de cette matrice à intégrer de grandes quantités de principes actifs.

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3.2. Modifications structurales des nanovecteurs et des nanovecteurs hybrides glucidiques-lipidiques, étudiées par calorimétrie à balayage et analyse FT-IR

Les résultats de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) fournissent des informations détaillées sur les modifications thermiques et l’état amorphe des NLC sans extrait et chargés en composés phytochimiques, ainsi que des NLC recouverts du polymère HA. Les mélanges phytochimiques d’ArnicaM et de RuscusA ont été efficacement stabilisés dans les systèmes de nanovecteurs grâce à la capacité d’hébergement suffisante et appropriée de l’organisation des NLC et des NLC recouverts de HA. Les courbes DSC des formulations NLC et HA-NLC contenant les mélanges phytochimiques individuels ou associés d’ArnicaM et de RuscusA ont révélé l’existence de pics endothermiques prononcés, dont les maxima se situaient entre 55,1 et 57,6 °C, accompagnés de modifications évidentes des enthalpies de fusion. Bien que la forme des pics soit assez similaire entre les catégories de NLC, les modifications du point de fusion et de l’enthalpie sont perceptibles, indiquant d’importantes interactions entre les NLC développés et les NLC décorés de HA. Le comportement en DSC confirme la nature solide et amorphe des NLC et montre des perturbations du cœur lipidique complexe ; les NLC et HA-NLC ont fondu sur une large plage de températures en raison des différences structurales entre les graisses solides et végétales, dans un rapport de 1:0,66:0,55 = MSG:huile d’argan:beurre de mangue. Ce comportement est caractéristique des lipides dont la structure interne n’est pas très bien organisée.

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L’identification de caractéristiques thermiques distinctes pour les NLC et HA-NLC contenant ArnicaM et/ou RuscusA, par comparaison avec les NLC et HA-NLC sans extrait, confirme l’intégration efficace des composés phytochimiques à l’intérieur de ces nanovecteurs lipidiques. La modification du profil thermique, c’est-à-dire la variation des points de fusion et de l’enthalpie enregistrée pour les HA-NLC sans extrait par rapport aux HA-NLC chargés d’ArnicaM et/ou de RuscusA (différence d’environ 2 °C entre les HA-NLC et les HA-NLC contenant les extraits végétaux), démontre qu’une distribution préférentielle des composés phytochimiques s’est effectivement produite. Par exemple, l’effet endothermique des HA-NLC sans extrait, enregistré à 57,6 °C, a diminué jusqu’à 55,1, 55,4 et 55,5 °C dans les HA-NLC chargés d’extraits d’ArnicaM et/ou de RuscusA. L’ajout de composants, comme les composés phytochimiques et le HA, à la matrice lipidique stabilisée par les tensioactifs entraîne une diminution du point de fusion, phénomène thermodynamique appelé « abaissement cryoscopique ». Même si ces composés phytochimiques ne sont pas entièrement encapsulés dans le cœur lipidique, leur présence à l’interface modifie la tension superficielle et l’énergie libre de l’ensemble du système de nanovecteurs. Les données de DSC obtenues concordent avec les résultats d’autres études apparentées et suggèrent des transitions de fusion bien définies, compatibles avec la nature du mélange lipidique complexe, dont la fusion nécessite une quantité importante d’énergie. La diminution de l’enthalpie de fusion après recouvrement des NLC par le HA est un phénomène bien documenté. Cette modification est principalement due aux interactions moléculaires entre le polymère HA et la surface des NLC. L’acide hyaluronique est un polymère hydrophile qui pénètre partiellement entre les extrémités polaires des lipides amphiphiles, des tensioactifs et des composés phytochimiques, perturbant ainsi l’organisation et la recristallisation de la matrice lipidique. Cette interaction impose un réarrangement des molécules, conduisant à une structure moins ordonnée du cœur lipidique et, par conséquent, à une amplification des imperfections du réseau lipidique. Une matrice plus amorphe, à la structure moins organisée, nécessite moins d’énergie thermique pour passer de l’état solide à l’état liquide. En outre, cet « enrobage » du NLC par le polymère HA peut exercer une certaine pression ou des forces qui déstabilisent légèrement l’empilement des chaînes d’acides gras du MSG, du beurre de mangue et de l’huile d’argan à l’intérieur des nanovecteurs.

Les valeurs de ΔH plus élevées des NLC contenant les extraits végétaux, comparativement à celles des NLC décorés de HA contenant ces extraits, suggèrent une structure plus cohésive dans les NLC conventionnels que dans les HA-NLC, nécessitant davantage d’énergie pour fondre. En revanche, l’enthalpie plus faible détectée pour les HA-NLC contenant les extraits d’ArnicaM et/ou de RuscusA par rapport aux NLC contenant ces extraits (par exemple 110,4 J/g et 106,6 J/g pour les NLC-ArnicaM et HA-NLC-ArnicaM ; 83,48 J/g et 80,94 J/g pour les NLC-ArnicaM-RuscusA et HA-NLC-ArnicaM-RuscusA) suggère que les extraits végétaux modifient implicitement l’organisation cœur lipidique-enveloppe de tensioactifs, réduisant l’énergie nécessaire à la transition de phase. Le HA, ArnicaM et RuscusA forment tous des liaisons hydrogène et des interactions électrostatiques avec les composants du système de nanovecteurs. Une enthalpie plus faible indique des interactions spécifiques entre le HA, les composés phytochimiques et les tensioactifs, qui réduisent l’énergie de fusion. Ces interactions « consomment » une partie de l’énergie du système et empêchent les molécules lipidiques de s’organiser en une structure cristalline parfaite. L’ajout de HA aux NLC présente donc des caractéristiques favorables à l’administration d’extraits végétaux, et l’enthalpie de fusion plus faible peut améliorer la robustesse des NLC pendant le stockage et dans les conditions biologiques. En outre, une enthalpie plus faible — et, implicitement, une matrice lipidique moins organisée et de cristallinité réduite — constitue souvent un avantage dans les formulations de nanovecteurs, car une matrice moins « compacte » permet une capacité de chargement plus élevée en principes actifs et empêche leur expulsion pendant le stockage, caractéristique souhaitable pour les systèmes à libération contrôlée.

Les spectres ATR-FTIR des NLC et HA-NLC contenant les extraits végétaux ont montré les bandes d’absorption de divers types de liaisons chimiques présentes dans les tensioactifs, les lipides, les extraits d’ArnicaM et de RuscusA, ainsi que dans l’acide hyaluronique. Les acides phénoliques — tels que les acides caféique, férulique et chlorogénique provenant d’ArnicaM et de RuscusA — et les flavonoïdes — notamment la quercétine, le kaempférol, la lutéoline et l’apigénine — produisent dans le spectre FT-IR des bandes spécifiques caractéristiques des polyphénols. Par exemple, les groupes -OH libres ou liés par des liaisons hydrogène sont identifiés dans la plage de 3 400 à 3 200 cm⁻¹ sous la forme d’une bande large et intense. Les liaisons C-H aliphatiques, provenant des tensioactifs, des résidus glycosidiques, etc., ont été observées dans la région de 2 930 à 2 850 cm⁻¹. Une bande importante observée entre 1 750 et 1 650 cm⁻¹ est liée au groupe carbonyle présent dans les acides phénoliques ou à l’hétérocycle γ-pyrone des flavonoïdes. Plusieurs vibrations comprises entre 1 610 et 1 450 cm⁻¹ pourraient être attribuées à la structure aromatique des phénols et des flavonoïdes. Les vibrations de déformation des liaisons C-H du cycle aromatique, qui varient selon le degré de substitution du cycle, se produisent entre 1 000 et 650 cm⁻¹. En général, les vibrations spécifiques des liaisons C-O et C-C des alcools, phénols, éthers et glycosides flavonoïdiques se chevauchent dans la plage de 1 320 à 1 000 cm⁻¹. L’élongation des liaisons C-O phénoliques est observée à environ 1 260 cm⁻¹.

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L’étude comparative des spectres des NLC sans extrait et des NLC décorés de HA a mis en évidence la présence d’une nouvelle bande à 1 650 cm⁻¹, attribuée à la vibration d’élongation amide I des groupes N-acétyle du squelette du HA. Un renforcement et un élargissement simultanés des modes vibrationnels O-H et N-H ont en outre été observés entre 3 050 et 3 700 cm⁻¹, ce qui concorde avec les interactions par liaisons hydrogène entre la molécule de HA et les NLC. Cela démontre bien la réussite du recouvrement des nanovecteurs lipidiques par le HA. Les spectres FTIR des HA-NLC incorporant ArnicaM et/ou RuscusA révèlent de légères différences dans la bande caractéristique correspondant à la vibration d’élongation C=C aromatique de la structure polyphénolique, par exemple 1 607 et 1 614 cm⁻¹ pour les NLC-ArnicaM, et 1 607 et 1 622 cm⁻¹ pour les NLC-Ruscus. La légère variation du nombre d’onde suggère des interactions physiques entre les composés phytochimiques et les groupes fonctionnels des lipides et des tensioactifs.

3.3. Efficacité d’encapsulation d’ArnicaM et de RuscusA dans des nanovecteurs lipidiques et des nanovecteurs hybrides polysaccharidiques-lipidiques

L’efficacité d’encapsulation (EE %) est un paramètre essentiel pour évaluer la capacité des nanovecteurs à transporter et à libérer efficacement les médicaments souhaités. Les valeurs d’encapsulation déterminées pour ArnicaM et RuscusA étaient supérieures à 96 %, quel que soit le type de nanovecteur lipidique, NLC classique ou NLC recouvert de HA. Ces valeurs remarquables s’expliquent par une synergie structurale entre la matrice lipidique, les extraits végétaux et la couche périphérique de tensioactifs des NLC, favorisant l’empilement moléculaire des extraits végétaux dans les deux régions, hydrophile et lipophile. La phosphatidylcholine sert de point d’ancrage aux composés phytochimiques polyhydroxylés d’ArnicaM et de RuscusA. Tensioactif amphiphile présentant une forte affinité pour les phases lipophile et hydrophile, elle peut établir des liaisons hydrogène ou des interactions électrostatiques, par l’intermédiaire des groupes phosphate et choline, avec les groupes hydroxyle des lactones sesquiterpéniques et des saponines stéroïdiennes, mais aussi avec les flavonoïdes et les acides phénoliques d’ArnicaM et de RuscusA, respectivement. En outre, les saponines stéroïdiennes de RuscusA, qui contiennent un ou plusieurs résidus glucidiques composés d’unités α-L-rhamnose, β-D-galactose et β-D-glucose, ont assuré d’importantes propriétés émulsifiantes. Les alkylsorbitans sont également utilisés pour stabiliser le cœur lipidique ; ils créent un effet de rigidification en s’insérant entre les molécules de phosphatidylcholine, favorisant ainsi une enveloppe plus dense, plus dure et difficile à traverser. En outre, la présence d’huile d’argan dans le cœur des NLC crée de multiples « compartiments » de solubilisation, permettant un chargement massif en substances actives végétales sans saturer le système. La création d’un cœur lipidique imparfait, efficacement « scellé » par les alkylsorbitans, assure une encapsulation adéquate en empêchant la diffusion vers l’extérieur des phytoconstituants actifs. L’augmentation de l’efficacité d’encapsulation est facilitée par la nature chimique des phytoconstituants d’ArnicaM et de RuscusA. L’hélénaline et les ruscogénines présentent toutes deux un coefficient de partage favorable à la phase lipidique, tandis que les acides polyphénoliques, les glycosides flavonoïdiques et les glucuronides préfèrent l’enveloppe hydrophile des émulsifiants. Nous n’avons pas trouvé dans la littérature apparentée de travaux sur l’encapsulation de ces extraits dans des systèmes de nano-administration NLC, mais d’autres études ont rapporté des valeurs d’EE % comprises entre 96 et 98,5 % pour des NLC conçus afin de transporter des substances actives naturelles/hydrophiles. Cela souligne que les valeurs d’EE déterminées dans la présente étude se situent dans la moyenne, voire au-dessus, et suggère que les NLC et HA-NLC développés présentent une capacité d’encapsulation remarquable, même pour des mélanges complexes de composés phytochimiques.

3.4. Détermination de la capacité antioxydante in vitro des NLC et des HA-NLC

L’activité de piégeage des radicaux libres des NLC et des NLC décorés de HA encapsulant les extraits d’ArnicaM et/ou de RuscusA a été analysée comparativement au moyen du test DPPH. Cette évaluation visait à illustrer la capacité des systèmes de nanovecteurs développés à capter les radicaux libres DPPH et à empêcher la peroxydation lipidique, réduisant ainsi les lésions induites par le stress oxydatif. Tous les NLC développés et chargés d’extraits d’ArnicaM/RuscusA ont présenté une capacité efficace de piégeage des radicaux DPPH, atteignant dans certains cas près de 80 % d’inhibition. Une capacité accrue de piégeage des radicaux DPPH a été enregistrée pour les formulations NLC et HA-NLC contenant ArnicaM (par exemple 79,38 ± 0,25 % et 74,69 ± 0,50 %). Les formulations nanostructurées contenant RuscusA ont montré une activité antioxydante modérée (60,28 ± 2,82 %), résultat cohérent avec leur faible teneur en polyphénols (29,03 mg EAG/g de lyophilisat) et leur concentration en flavones (18 mg d’équivalents quercétine/g de lyophilisat). Le comportement supérieur des NLC-ArnicaM par rapport aux NLC-RuscusA tient principalement aux profils structuraux phytochimiques distincts des deux extraits.

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Certains aspects fondamentaux justifiant ces différences sont les suivants : i. Profil structural des composés phytochimiques. ArnicaM est riche en acides phénoliques (acides chlorogénique et caféique), en flavonoïdes (lutéoline, quercétine) et en lactones terpéniques (hélénaline, dihydrohélénaline et leurs esters). Ces composés polyphénoliques dotés de substituants riches en électrons sont d’excellents donneurs d’atomes d’hydrogène et peuvent réagir avec les radicaux DPPH par un transfert d’électrons très rapide, entraînant un piégeage efficace des radicaux DPPH. Bien qu’efficaces sur les fonctions circulatoires veineuses, les principales saponines stéroïdiennes de RuscusA — ruscoside et ruscogénine — ne possèdent pas la même densité de groupes hydroxyle phénoliques actifs que les flavonoïdes d’ArnicaM. Luis et ses collaborateurs ont également indiqué le potentiel antioxydant limité de l’extrait de RuscusA, corrélé à une faible teneur en polyphénols (32,9 mg AG/g de matière sèche). ii. Effet synergique des lactones terpéniques en association avec les flavonoïdes. Un autre facteur majeur différenciant ArnicaM est la présence de lactones terpéniques, en particulier l’hélénaline et ses esters. Les lactones terpéniques peuvent interagir en synergie avec les flavonoïdes. Cette interaction stabilise la phase lipidique des NLC et améliore le transfert d’électrons, ce qui produit une vitesse de réaction de neutralisation du radical DPPH supérieure à celle obtenue avec l’extrait de RuscusA. iii. Hydrophobicité contre hydrophilie contre accessibilité. Les phytocomposés antioxydants d’ArnicaM, en particulier les flavonoïdes méthoxylés, tendent à présenter une affinité plus équilibrée pour la matrice lipidique. Cette localisation stratégique rend les groupes actifs plus accessibles au radical DPPH dans le milieu réactionnel. Dans le cas de RuscusA, les saponines tendent à être plus volumineuses et peuvent réduire les collisions directes avec l’oxydant DPPH.

Concernant les nanovecteurs doubles, les NLC et HA-NLC-ArnicaM-RuscusA ont montré une inhibition modérément accrue des radicaux DPPH, respectivement de 69,56 ± 2,68 % et 60,6 ± 2,68 %. Ce comportement peut s’expliquer par la présence de multiples phytomolécules susceptibles d’interférer les unes avec les autres et de limiter l’accès aux radicaux DPPH. Les polyphénols auront moins accès au site du radical DPPH, de sorte que le transfert d’électrons est ralenti. Il en résulte une inhibition de la réaction de transfert d’hydrogène nécessaire à la formation du complexe stabilisé par conjugaison, entre les doubles liaisons et la paire d’électrons non participante de l’atome d’azote ou d’oxygène.

Des différences notables ont également été observées entre les NLC et les NLC recouverts de HA. Ainsi, la capacité de piégeage du DPPH a diminué d’environ 5,8 % pour les NLC-ArnicaM décorés de HA et de 12,9 % pour les HA-NLC-ArnicaM-RuscusA par rapport aux NLC-ArnicaM-RuscusA. Bien que l’acide hyaluronique soit un ingrédient précieux pour la stabilité, l’amélioration de l’adhésion aux tissus biologiques, l’hydratation et la biocompatibilité, sa présence à la surface des NLC peut agir comme une barrière physicochimique qui « masque » le potentiel antioxydant des extraits d’ArnicaM et de RuscusA. Plusieurs mécanismes pouvant expliquer la diminution de l’activité antioxydante des HA-NLC peuvent être associés aux éléments suivants : a. Création d’une barrière stérique. La couche polymérique ramifiée et dense de HA fixée à la surface des NLC constitue une barrière physique qui limite la diffusion du radical libre DPPH vers les antioxydants. Le HA ralentit la cinétique de réaction, ce qui entraîne une diminution de l’inhibition du DPPH. b. Séquestration des antioxydants phytochimiques. Il est très probable que les polyphénols d’ArnicaM et les saponines de RuscusA forment des liaisons hydrogène intermoléculaires avec les groupes hydrophiles, carboxyle et hydroxyle du HA. Par cet « ancrage », les groupes actifs des antioxydants sont partiellement bloqués dans le réseau polymérique, réduisant ainsi le nombre de centres actifs disponibles pour neutraliser les radicaux DPPH. c. Modification du potentiel de surface et de la viscosité. Le recouvrement par le HA modifie les propriétés électrocinétiques des nanovecteurs. La couche de HA augmente la viscosité, ce qui réduit la mobilité moléculaire. Comme la réaction avec le DPPH dépend de la vitesse, la réduction de la mobilité moléculaire des espèces réactives entraîne une diminution de l’efficacité de capture des radicaux DPPH. L’activité antioxydante des NLC sans extrait végétal (29,09 ± 3,83 %) peut être attribuée aux acides gras — acide linoléique ω-6 et acide oléique ω-9 — présents dans l’huile d’argan, l’huile de chardon-Marie et le beurre de mangue employés pour synthétiser la matrice lipidique des NLC.

Les valeurs de CI₅₀ obtenues pour les deux catégories de systèmes de nanovecteurs reflètent la supériorité antioxydante des NLC-ArnicaM et HA-NLC-ArnicaM par rapport aux systèmes NLC contenant RuscusA ou les deux extraits. ArnicaM remporte la compétition antioxydante grâce à ses structures polyphénoliques appropriées, tandis que RuscusA, riche en saponines, est excellent pour le tonus veineux, mais beaucoup moins efficace pour neutraliser directement les radicaux libres selon la méthode DPPH.

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3.5. Détermination de la libération in vitro des composés phytochimiques à partir des NLC et des HA-NLC

L’évaluation de la libération des composés phytochimiques à partir des nanovecteurs est essentielle pour comprendre les performances in vivo des NLC et NLC décorés de HA développés. Des études de libération in vitro ont été réalisées au moyen de cellules de Franz sur des nanovecteurs sélectionnés, et la quantité de polyphénols libérés à partir des NLC et des HA-NLC hybrides chargés d’extraits a été déterminée quantitativement par le dosage de Folin-Ciocâlteu. L’analyse comparative des profils de libération des NLC-ArnicaM et NLC-ArnicaM-RuscusA révèle une différence importante, principalement influencée par le type et la quantité de mélange phytochimique encapsulé dans le nanovecteur. Durant la première heure, les NLC-ArnicaM libèrent 4,99 ± 0,34 % des polyphénols, contre 15,46 ± 1,32 % pour les NLC-ArnicaM-RuscusA. Cette multiplication approximative par trois du pourcentage de libération peut être attribuée à la quantité d’extrait encapsulé, qui a entraîné la sursaturation des espaces disponibles dans les NLC pour accueillir les deux types de mélanges phytochimiques. Les polyphénols qui n’étaient pas retenus dans le réseau interne de tensioactifs ou qui formaient des interactions très faibles ont été facilement captés par le milieu accepteur. Après 7 h, la libération atteignait 90,02 ± 2,7 % pour les NLC-ArnicaM et 96,02 ± 2,1 % pour les NLC-ArnicaM-RuscusA.

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La décoration des NLC par l’acide hyaluronique a entraîné une augmentation notable de la vitesse de libération des polyphénols. Ainsi, pour ArnicaM, le NLC décoré a atteint un pourcentage de libération de 96,68 % après seulement 6 h, contre 90,02 % pour le NLC conventionnel mesuré après 7 h. Une tendance similaire a été observée pour les NLC-ArnicaM-RuscusA : la variante recouverte de HA a présenté une efficacité de libération de 98,36 % en 6 h, tandis que le NLC non recouvert atteignait 96,02 % après 7 h. Ces résultats montrent que la décoration par l’acide hyaluronique accélère non seulement la libération des polyphénols, mais maintient également l’efficacité globale du système, ce qui suggère un potentiel accru pour l’administration contrôlée de composés bioactifs.

Le modèle de Korsmeyer-Peppas a fourni le meilleur coefficient de régression pour toutes les formulations de NLC, décorées ou non d’acide hyaluronique. L’exposant « n » indiquait le mécanisme de libération des polyphénols, avec des valeurs comprises entre 0,34 et 0,67. Dans le cas des NLC-ArnicaM, n = 0,33 indique un mécanisme de diffusion fickienne, tandis que pour les autres formulations (0,43 < n < 0,89), la libération suit un comportement non fickien, indiquant que les polyphénols ont été libérés par un transport anormal reposant sur une combinaison de diffusion et de dégradation de la matrice lipidique, laquelle contrôle leur libération à partir des NLC. La présence d’acide hyaluronique à la surface des NLC conduit à la création d’une couche supplémentaire autour de ceux-ci, qui contribue à la libération contrôlée des polyphénols.

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3.6. Détermination in vitro de la viabilité cellulaire et du potentiel cytotoxique par MTS et LDH

La biocompatibilité des NLC et HA-NLC intégrant les substances végétales actives a été étudiée sur des fibroblastes BJ 24 et 48 h après traitement avec des concentrations de 0 à 100 µg/mL. Lorsque la concentration augmentait, une diminution modérée de la viabilité cellulaire était détectée, sans révéler de risque cytotoxique potentiel, à l’exception des HA-NLC-ArnicaM à 48 h, pour lesquels la diminution de la viabilité cellulaire était plus prononcée. Malgré la cytotoxicité intrinsèque de l’extrait d’ArnicaM, les valeurs de viabilité cellulaire confirment que les NLC et HA-NLC peuvent être considérés comme sûrs à toutes les concentrations testées, à quelques exceptions mineures près. Le traitement avec 25 et 50 µg/mL de NLC et HA-NLC a entraîné une viabilité appropriée > 80 %, en particulier pour les NLC contenant les deux extraits végétaux.

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Dans le cas des NLC-ArnicaM, la présence de concentrations plus élevées de lactones terpéniques pourrait très probablement être responsable du déclenchement de l’apoptose. Cependant, l’association d’ArnicaM et de RuscusA dans les NLC exploite une synergie pharmacologique permettant d’obtenir un effet biologique supérieur. La capacité probable de RuscusA à potentialiser les effets veinotonique et anti-inflammatoire permet à ArnicaM de rester sous le seuil de cytotoxicité. RuscusA peut également agir comme agent de « protection » métabolique en réduisant le stress oxydatif qu’ArnicaM pourrait induire au niveau mitochondrial. L’atténuation de la lyse cellulaire et la protection de la membrane des fibroblastes BJ peuvent aussi être considérées comme un point critique. L’association des deux extraits dans les NLC évite l’interaction de certains phytocomposés agressifs, par exemple les lactones sesquiterpéniques, avec les phospholipides de la membrane des cellules BJ. Un aspect notable est le comportement des NLC décorés de HA, pour lesquels une diminution plus profonde de la viabilité cellulaire a été détectée aux concentrations de 50 et 100 µg/mL. Le recouvrement par l’acide hyaluronique pourrait avoir favorisé l’endocytose, dirigeant les phytocomposés directement vers les compartiments endosomaux. Ce comportement peut entraîner l’accumulation locale de concentrations potentiellement agressives de composés phytochimiques à la surface de la membrane des cellules BJ, augmentant le risque de rupture membranaire — lyse cellulaire.

Afin de déterminer si la cytotoxicité induite par les NLC-ArnicaM était due à la lyse cellulaire, la libération de LDH a été suivie après un traitement de 48 h. L’activité de l’enzyme LDH est un indicateur fiable de l’intégrité de la membrane cellulaire. Les NLC-ArnicaM et HA-NLC-ArnicaM ont entraîné une augmentation marquée des taux de LDH. Lorsqu’une cellule est endommagée par destruction de sa membrane, la LDH « fuit » du cytoplasme vers l’extérieur, augmentant le pourcentage de LDH. Les résultats obtenus pour le marqueur de lésion cellulaire LDH confirment que l’un des principaux mécanismes est lié à la lyse membranaire. Nos résultats sur les NLC concordent avec des études antérieures portant sur l’extrait d’ArnicaM, qui induisait une augmentation des taux de LDH à des concentrations supérieures à 100 µg/mL. Pour les autres NLC, les taux de LDH n’ont pas subi de modifications significatives, ce qui indique que la lyse membranaire n’est pas le principal mécanisme affectant la viabilité cellulaire.

3.7. Potentiel cicatrisant des NLC et des NLC-ArnicaM-RuscusA décorés de HA

La capacité des NLC et HA-NLC contenant les extraits végétaux à favoriser la cicatrisation a été évaluée au moyen du test de rayure. Au moment initial de la rayure, une grande plaie délimitée par des bords nets a été obtenue. Des images représentatives en champ clair ont été recueillies à plusieurs temps jusqu’à 30 h, lorsque la plaie était presque entièrement refermée pour les deux catégories de systèmes de nanovecteurs chargés d’extraits végétaux. Après 4 h de traitement par les NLC et HA-NLC contenant les extraits végétaux, toutes les conditions semblaient ainsi approximativement similaires, avec une migration presque inexistante dans la zone de la plaie. En revanche, 24 h de traitement ont entraîné une modification de la morphologie cellulaire — aspect fusiforme — accompagnée d’une migration massive dans la zone de la plaie. La prolongation jusqu’à 30 h montre que la plaie était presque refermée pour tous les NLC étudiés. Parallèlement, dans les conditions témoins, les cellules migrent, mais des espaces visibles subsistent entre elles. Les cellules traitées par les nanovecteurs hybrides, à savoir les NLC décorés de HA, referment mieux la plaie provoquée, les cellules atteignant la confluence lorsqu’elles sont traitées par les HA-NLC-RuscusA, suivis des HA-NLC-ArnicaM-RuscusA. La capacité de ces nanovecteurs lipidiques hybrides à accélérer la fermeture des plaies sur les fibroblastes BJ s’explique par la synergie entre la structure et les capacités du nanovecteur, en corrélation avec les phytocomposés actifs administrés et libérés de manière contrôlée : (i). L’acide hyaluronique utilisé pour décorer les NLC est un élément spécifiquement reconnu par les récepteurs CD44 exprimés à la surface des fibroblastes BJ. Le HA agit comme une clé en se liant aux récepteurs CD44 et facilite ainsi l’internalisation rapide d’ArnicaM et de RuscusA, très probablement par endocytose. De plus, l’interaction entre le HA et le récepteur CD44 peut déclencher des cascades de signalisation intracellulaire qui stimulent la motilité cellulaire, conduisant les fibroblastes à migrer plus rapidement vers la zone libre et favorisant la fermeture de la plaie. (ii). Synergie des extraits d’ArnicaM et de RuscusA. Par exemple, ArnicaM contient des lactones sesquiterpéniques qui, à doses contrôlées, modulent la réponse inflammatoire et stimulent le métabolisme cellulaire. Cela fournit le carburant métabolique nécessaire à la division et à la migration des fibroblastes. RuscusA, riche en saponines stéroïdiennes, améliore la résistance cellulaire et contribue à la stabilité de la membrane des cellules BJ. (iii). La dynamique de libération joue également un rôle déterminant dans le test de rayure, puisque la cicatrisation résulte de deux processus : la migration et la prolifération cellulaires. La libération progressive des composés phytochimiques réduit le stress oxydatif provoqué par la « plaie » mécanique sur les fibroblastes BJ. Grâce à cette libération lente, les fibroblastes BJ reçoivent un stimulus constant favorisant leur migration, de sorte que la rayure se referme significativement plus vite que chez les cellules non traitées. L’ensemble de ces considérations confirme l’hypothèse d’une efficacité remarquable des HA-NLC, et en particulier des HA-NLC-RuscusA, pour favoriser la cicatrisation.

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Une analyse quantitative a été réalisée pour toutes les conditions testées, et le pourcentage de fermeture de la plaie a été présenté pour les concentrations de 12,5 µg/mL et 100 µg/mL. L’analyse comparative des cellules traitées avec 12,5 µg/mL de NLC et HA-NLC montre que la première différence biologique apparaît à 24 h, où trois groupes distincts peuvent être observés : (i) NLC ayant un faible effet par rapport au témoin (NLC-ArnicaM), (ii) effet modéré sur la fermeture de la plaie (NLC-RuscusA et NLC-ArnicaM-RuscusA) et (iii) forte action sur la fermeture de la plaie (tous les HA-NLC). À 30 h, le processus de fermeture de la plaie est presque achevé ; à ce stade, il n’existe presque plus de différence entre les NLC et les HA-NLC contenant les extraits végétaux, à l’exception des NLC-ArnicaM, qui n’ont pas montré d’effet cicatrisant lors de leur application. D’après les résultats obtenus, les HA-NLC favorisent une réponse cicatrisante plus rapide après application, mais celle-ci ralentit après 24 h, tandis que les NLC conservent leur efficacité et atteignent un résultat similaire à 30 h. Ces résultats confirment l’adaptabilité des HA-NLC en tant que candidats efficaces pour une application pharmacologique, avec la possibilité de renouveler l’application après 24 h afin de maintenir une migration cellulaire plus rapide.

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RuscusA possède une action anti-inflammatoire et antioxydante, ainsi que des effets sur la microcirculation, mais aucune étude de cicatrisation n’a été rapportée pour cet extrait ou pour ses nanoformulations. Il s’agit de la première étude montrant une augmentation de la migration cellulaire, bénéfique à la cicatrisation. En revanche, ArnicaM est utilisé comme agent anti-inflammatoire et antimicrobien et dans le traitement de diverses lésions cutanées. Il a déjà été montré qu’ArnicaM pouvait accroître la migration in vitro des fibroblastes.

Lorsque les cellules ont été exposées à 100 µg/mL, un résultat différent de celui obtenu avec la concentration inférieure a été observé. Le traitement le plus efficace était le HA-NLC-RuscusA, tandis que, pour les autres traitements, les résultats étaient globalement similaires à ceux des conditions témoins. Ce phénomène peut être interprété selon plusieurs perspectives mécanistiques. Un premier aspect serait l’atteinte d’une « fenêtre thérapeutique » à 12 µg/mL, tandis qu’une dose plus élevée pourrait inhiber ou ralentir la fermeture de la plaie par les fibroblastes BJ. Bien que les NLC soient biocompatibles à 100 µg/mL, la densité de particules dans le milieu de culture est extrêmement élevée et pourrait perturber l’intégrité de la membrane plasmique des fibroblastes. Ainsi, au lieu de stimuler la migration, la dose de 100 µg/mL pourrait induire un stress métabolique, voire des microlésions cellulaires, contraignant les cellules à engager des processus internes de réparation plutôt qu’à se diviser et à migrer pour refermer la « rayure ». La concentration de 100 µg/mL modifie également les propriétés rhéologiques et la viscosité du milieu de culture, entraînant implicitement une restriction de la diffusion. La migration cellulaire est un processus actif nécessitant un réarrangement du cytosquelette. Dans un environnement beaucoup plus visqueux et dense, la résistance hydrodynamique qui s’oppose au mouvement cellulaire est plus grande, ce qui se traduit par un taux de fermeture de la plaie beaucoup plus faible. L’efficacité du test de cicatrisation par rayure dépend aussi de la capacité des cellules à détecter l’espace libre et à migrer vers celui-ci. À 100 µg/mL, la surface cellulaire et l’espace extracellulaire — volume hydrodynamique — sont pratiquement « saturés » de NLC. Cette agglomération physique peut créer une barrière stérique — par exemple, les récepteurs CD44 de surface des fibroblastes BJ peuvent être bloqués — susceptible d’inhiber la signalisation nécessaire à la locomotion. Enfin, les extraits d’ArnicaM et de RuscusA sont riches en composés bioactifs — lactones sesquiterpéniques, flavonoïdes, saponines — qui peuvent exercer un effet pro-oxydant à fortes doses. À 12 µg/mL, les NLC et HA-NLC contenant ArnicaM et/ou RuscusA peuvent stimuler différentes voies de signalisation favorisant la prolifération, tandis qu’à 100 µg/mL, l’accumulation intracellulaire de NLC peut générer des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Ce stress oxydatif élevé entraîne un arrêt du cycle cellulaire et interrompt ainsi la prolifération nécessaire à la cicatrisation.

3.8. Morphologie cellulaire et organisation du cytosquelette

Les modifications morphologiques cellulaires induites par les NLC et HA-NLC contenant les extraits végétaux ont été observées aux concentrations de 12,5 et 100 µg/mL en analysant les filaments d’actine. Comme attendu, les fibroblastes BJ possèdent un corps cellulaire allongé et fusiforme, caractéristique de la morphologie des fibroblastes. Du fait de leurs filaments d’actine longs et bien organisés, fortement polarisés le long de l’axe principal, les cellules tendent également à croître en s’alignant davantage les unes avec les autres. Par rapport aux cellules témoins, les cellules traitées avec 12,5 mg/mL de NLC et HA-NLC contenant les extraits végétaux ont conservé leur aspect allongé et leur morphologie fusiforme, avec des fibres d’actine alignées le long de l’axe. Lorsque la concentration augmentait, les cellules devenaient plus petites et présentaient une réduction des filaments d’actine.

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Les images ont ensuite été analysées à l’aide d’un code MATLAB modifié comme décrit précédemment, et le nombre de fibres du cytosquelette, leur longueur totale et leur polarité ont été calculés. Après traitement par les NLC-ArnicaM, les paramètres ne présentent qu’une faible modification, indiquant que le cytosquelette a conservé son intégrité indépendamment des concentrations appliquées. Toutefois, lorsque du HA a été ajouté, tous les paramètres ont légèrement augmenté, ce qui peut s’expliquer par la stimulation de la migration cellulaire. Pour les NLC-RuscusA, les valeurs étaient similaires à celles du témoin ; une légère augmentation des paramètres a toutefois été observée pour les HA-NLC-RuscusA, indiquant une promotion de la migration cellulaire.

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Les NLC-ArnicaM-RuscusA induisent une forte fragmentation de l’actine lorsque les cellules sont traitées avec 100 µg/mL, bien que la polarisation ne soit pas affectée. Pour les NLC-ArnicaM-RuscusA décorés de HA, une augmentation du nombre de fibres et de leur longueur a été observée, sans modification de leur polarité, indépendamment de la concentration utilisée. Cela peut être corrélé à une augmentation de la mobilité des fibroblastes.

4. Conclusions

La conception structurale, ainsi que les effets antioxydant et cicatrisant des NLC conventionnels et des NLC modifiés par le HA transportant le profil phytochimique complexe des extraits d’ArnicaM et de RuscusA, ont été étudiés. Ces nanovecteurs présentaient des diamètres principaux compris entre 145 nm et 180 nm, un potentiel électrocinétique compris entre −45 mV et −62 mV, ainsi qu’une capacité idéale à héberger les deux extraits végétaux, avec une efficacité d’encapsulation supérieure à 96 %. Les profils de libération des composés phytochimiques à partir des NLC et des NLC modifiés par le HA étaient distincts, influencés par le HA et par la catégorie de l’extrait phytochimique encapsulé. La décoration des NLC par le HA a entraîné une augmentation notable de la vitesse de libération des polyphénols ; par exemple, les HA-NLC ont atteint un pourcentage de libération d’ArnicaM de 96,7 % après 6 h, contre 90,02 % pour les NLC après 7 h. Une tendance similaire a été observée pour les NLC doubles contenant un mélange d’ArnicaM et de RuscusA.

La supériorité antioxydante des NLC-ArnicaM et HA-NLC-ArnicaM sur les NLC contenant RuscusA ou les deux extraits a été démontrée. ArnicaM remporte la compétition antioxydante, tandis que RuscusA s’est révélé excellent pour accélérer le processus de fermeture de la plaie dans les fibroblastes BJ. Les NLC et HA-NLC encapsulant ArnicaM ont présenté la capacité la plus élevée de neutralisation des radicaux libres DPPH, par exemple 79,38 ± 0,25 % et 74,69 ± 0,5 %. L’activité des NLC-ArnicaM-RuscusA était plus modérée pour l’inhibition directe des radicaux libres. Les phytomolécules complexes présentes dans les NLC-ArnicaM-RuscusA peuvent limiter le transfert d’électrons aux radicaux DPPH, ce qui se traduit par une vitesse de réaction plus faible lors de la neutralisation des radicaux. La décoration des NLC par le HA a légèrement diminué les valeurs antioxydantes par rapport aux NLC contenant les extraits végétaux sans HA. L’ancrage par le HA a produit une séquestration des antioxydants phytochimiques, et les groupes actifs des antioxydants se sont retrouvés immobilisés dans le réseau polymérique, réduisant ainsi le nombre de centres actifs disponibles pour neutraliser les radicaux DPPH.

La biocompatibilité des HA-NLC intégrant les substances végétales actives montre qu’ArnicaM associé à RuscusA exploite l’émergence d’une synergie pharmacologique. Les HA-NLC-ArnicaM-RuscusA ont fonctionné comme un tampon entre les phytocomposés potentiellement toxiques d’ArnicaM et les fibroblastes, tandis que RuscusA a permis d’atteindre une efficacité biologique sans compromettre l’intégrité de la membrane cellulaire. Bien que les nanovecteurs lipidiques encapsulant uniquement ArnicaM aient entraîné une augmentation marquée du marqueur cellulaire LDH, les concentrations de 25 et 50 µg/mL ont permis le maintien d’une viabilité > 80 %, en particulier pour les NLC contenant les deux extraits végétaux. La coprésence de RuscusA et d’ArnicaM peut agir comme un agent de « protection » métabolique, réduisant le stress oxydatif et/ou atténuant le risque de lyse cellulaire que certains composés phytochimiques agressifs d’ArnicaM pourraient induire.

Les NLC hybrides ont démontré une efficacité remarquable pour accélérer la fermeture de plaies par rayure induites sur des fibroblastes BJ issus de peau humaine. L’analyse quantitative de la fermeture de la plaie à 12,5 µg/mL et 100 µg/mL a mis en évidence, à 24 h, des différences biologiques nettes relevant de trois groupes distincts : (1) NLC ayant un faible effet par rapport au témoin, pour les NLC-ArnicaM ; (2) effet cicatrisant modéré, pour les NLC-RuscusA et NLC-ArnicaM-RuscusA ; et (3) puissant effet cicatrisant, pour tous les HA-NLC contenant les composés phytochimiques. Plusieurs aspects étayant l’hypothèse d’une efficacité remarquable des HA-NLC-ArnicaM-RuscusA pour favoriser la cicatrisation peuvent être étroitement corrélés aux éléments suivants : i. l’interaction entre le HA et les récepteurs CD44, qui facilite l’internalisation d’ArnicaM et de RuscusA et peut également déclencher des cascades de signalisation intracellulaire stimulant la motilité cellulaire et une migration plus rapide des fibroblastes ; ii. les phytocomposés actifs d’ArnicaM et de RuscusA peuvent stimuler le métabolisme cellulaire, agissant comme les carburants métaboliques nécessaires à la division et à la migration des fibroblastes ; iii. grâce à la dynamique de libération progressive, le stress oxydatif provoqué par la plaie mécanique sur les fibroblastes est réduit et les cellules BJ reçoivent un stimulus constant favorisant leur migration et leur prolifération. Les modifications morphologiques des cellules BJ ont été mises en évidence par microscopie en fluorescence. Les NLC-ArnicaM ont induit une faible modification des paramètres, indiquant que le cytosquelette conservait son intégrité indépendamment des concentrations appliquées. En revanche, pour les NLC modifiés par le HA, tous les paramètres présentaient des valeurs légèrement accrues, ce qui peut être associé à la stimulation de la migration cellulaire. Pour les NLC-ArnicaM-RuscusA décorés de HA, une prolifération des fibres a été observée sans modification de leur polarité, comportement pouvant être corrélé à une mobilité cellulaire accrue.

Les résultats de ce travail facilitent la conception de nanovecteurs lipidiques hybrides destinés à des mélanges d’extraits végétaux, présentant une stabilité et un effet cicatrisant améliorés, et contribuent ainsi au développement futur de formulations topiques nanostructurées fonctionnelles capables de stimuler les voies de signalisation et de favoriser une régénération cellulaire appropriée, nécessaire à la cicatrisation, tout en assurant une accumulation intracellulaire des nanovecteurs qui maintient un faible niveau d’espèces réactives oxydantes.

Remerciements

La publication de cet article a été soutenue par l’Université nationale de science et technologie Politehnica de Bucarest, dans le cadre du programme institutionnel de libre accès (PubArt).

Avertissement/Note de l’éditeur

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Contributions des auteurs

Conceptualisation, I.L. et N.B. ; méthodologie, I.L., N.B., M.N. et M.B. ; logiciel, D.L.S., J.A.T. et R.T. ; validation, I.L., N.B., M.B. et M.N. ; analyse formelle, R.T., D.L.S. et J.A.T. ; investigation, I.L., O.C.O., D.L.S., R.T., M.B. et N.B. ; ressources, N.B. ; rédaction — préparation de la version initiale, I.L., N.B., M.B. et R.T. ; rédaction — révision et édition, I.L., O.C.O., M.B. et N.B. ; visualisation, O.C.O., M.N. et M.B. ; supervision, I.L. et N.B. ; administration du projet, N.B. ; acquisition du financement, N.B. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version publiée du manuscrit.

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Déclaration de disponibilité des données

Les données brutes étayant les conclusions de cet article seront mises à disposition par les auteurs sur demande.

Conflits d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. L’entreprise n’a joué aucun rôle dans la conception de cette étude, l’analyse et l’interprétation des données, la rédaction de ce manuscrit ou la décision d’en publier les résultats.

Abréviations

HA : acide hyaluronique
NLC : nanovecteurs lipidiques nanostructurés
SLN : nanoparticules lipidiques solides
ArnicaM : Arnica montana
RuscusA : Ruscus aculeatus
DLS : diffusion dynamique de la lumière
Z_moy : diamètre particulaire moyen
PdI : indice de polydispersité
EAG : équivalents d’acide gallique
DSC : calorimétrie différentielle à balayage
DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle
BJ : fibroblastes cutanés humains
LDH : lactate déshydrogénase