Profilage phytochimique comparatif et étude in vitro du potentiel antioxydant et antimicrobien des extraits d’Arnica montana L., de Melissa officinalis L. et de Capsella bursa-pastoris Medik. et de leurs combinaisons synergiques
Référence : Molecules 2026. — PMC13209621 · DOI 10.3390/molecules31101735 Type : étude phytochimique in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Cette étude a examiné la composition phytochimique, le potentiel antioxydant et l’activité antimicrobienne d’extraits éthanoliques obtenus à partir d’Arnica montana L., de Melissa officinalis L. et de Capsella bursa-pastoris Medik., ainsi que de leurs mélanges ternaires. L’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse a révélé la présence de plusieurs composés phénoliques, notamment la lutéoline, l’apigénine, l’acacétine et des acides phénoliques, tandis que la rutine et l’hypéroside avaient précédemment été signalés comme constituants dominants de Capsella bursa-pastoris Medik. Les extraits et leurs mélanges ont présenté une activité antioxydante significative dans différents essais de piégeage des radicaux et de pouvoir réducteur, l’activité la plus élevée ayant été observée pour le mélange ACM4. L’activité antimicrobienne a été évaluée contre Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae et a montré des effets inhibiteurs, avec des valeurs de concentration minimale inhibitrice allant de moins de 100 mg/L pour les extraits de Melissa officinalis L. à plus de 250 mg/L pour les extraits de Capsella bursa-pastoris Medik. Ces résultats suggèrent que les composés phénoliques identifiés dans les plantes étudiées contribuent à leurs propriétés antioxydantes et antibactériennes et confortent l’utilisation potentielle de ces extraits et de leurs combinaisons comme sources naturelles de composés bioactifs.
1. Introduction
Les plantes médicinales constituent une source importante de composés bioactifs aux propriétés antioxydantes et antimicrobiennes, suscitant un intérêt considérable en raison de leurs applications potentielles dans les systèmes pharmaceutiques, nutraceutiques et alimentaires. Les composés phénoliques, en particulier les flavonoïdes et les acides phénoliques, sont reconnus comme des contributeurs essentiels à l’activité biologique des extraits végétaux en raison de leur capacité à neutraliser les espèces réactives de l’oxygène et à inhiber la croissance de micro-organismes pathogènes. Parmi les espèces médicinales largement utilisées dans la phytothérapie européenne traditionnelle, Arnica montana L., Melissa officinalis L. et Capsella bursa-pastoris Medik. se distinguent par la diversité de leur composition phytochimique et de leurs effets biologiques. Des études récentes ont montré que les extraits d’Arnica montana L. sont riches en dérivés hydroxycinnamiques, particulièrement en acides caféoylquiniques, qui contribuent à leur activité antioxydante et antimicrobienne. De même, Melissa officinalis L. contient des teneurs élevées en composés phénoliques, notamment en acide rosmarinique et en flavonoïdes, associés à de fortes propriétés antioxydantes et antibactériennes. Il a été rapporté que Capsella bursa-pastoris contient des glucosinolates, des flavonoïdes et des acides phénoliques, qui contribuent à ses activités antioxydante, hépatoprotectrice et antimicrobienne.
Bien que la composition phytochimique et l’activité biologique de ces plantes aient été étudiées séparément, les données disponibles concernant les effets synergiques potentiels résultant de leur utilisation combinée sont limitées. Un nombre croissant de données suggère que les mélanges d’extraits végétaux peuvent accroître l’activité antioxydante et antimicrobienne grâce à des interactions additives ou synergiques entre différents constituants phénoliques. Cependant, peu d’informations sont disponibles sur l’activité biologique combinée des extraits d’Arnica montana L., de Melissa officinalis L. et de Capsella bursa-pastoris Medik., particulièrement en ce qui concerne leur composition phytochimique et leurs effets synergiques potentiels.
L’objectif de cette étude était de caractériser les extraits de C.B.P., M.O. et A.M. quant à leur teneur en composés bioactifs, en polyphénols et en flavonoïdes, à leur capacité antioxydante, à la détermination quantitative de leurs composés et à la détermination de leur effet antimicrobien. Les meilleurs résultats obtenus pour ces extraits seront utilisés afin de préparer des mélanges d’extraits et d’en déterminer la capacité antioxydante et l’effet antimicrobien. Les concentrations optimales résultant de l’analyse des mélanges seront utilisées dans l’étude suivante pour créer une formulation pharmaceutique.
2. Résultats
2.1. Teneur en polyphénols, flavonoïdes et anthocyanines des extraits végétaux étudiés
L’analyse quantitative des composés bioactifs a révélé des variations notables entre les extraits obtenus à partir de Capsella bursa-pastoris Medik., de Melissa officinalis L. et d’Arnica montana L. (Tableau 1).
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L’évaluation phytochimique quantitative a révélé des variations significatives de la concentration en métabolites secondaires entre les trois espèces végétales étudiées. Comme le montre le Tableau 1, Arnica montana L. (A.M.) présentait la teneur totale en polyphénols la plus élevée (426,12 mg GAE/g DW), suivie de Capsella bursa-pastoris Medik. (C.B.P.) (368,17 mg GAE/g DW) et de Melissa officinalis L. (M.O.) (352,73 mg GAE/g DW). Une tendance similaire a été observée pour la teneur totale en flavonoïdes, A.M. présentant la concentration la plus élevée (24,53 mg QE/g DW), tandis que M.O. et C.B.P. présentaient des valeurs modérément plus faibles (respectivement 20,08 et 18,84 mg QE/g DW).
Les teneurs en anthocyanines s’échelonnaient de 1,1250 à 3,4740 mg C3G/100 g DW, A.M. présentant là encore la teneur la plus élevée (3,4740 mg C3G/100 g DW), suivie de C.B.P. (2,7013 mg C3G/100 g DW) et de M.O. (1,1250 mg C3G/100 g DW). Ces résultats indiquent d’importantes différences interspécifiques dans l’accumulation des constituants phénoliques et flavonoïdiques.
2.2. Capacité antioxydante des espèces Capsella bursa-pastoris Medik., Arnica montana L. et Melissa officinalis L.
Nous avons donc évalué l’activité antioxydante de l’extrait végétal au moyen des méthodes DPPH (Brand-Williams et al. (1995)), ABTS, CUPRAC et FRAP. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau 2. Dans le cas de l’extrait de Melissa officinalis L., les valeurs obtenues étaient supérieures à celles de la littérature, où la valeur était de 46,71 %.
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La capacité antioxydante des différents extraits a été évaluée au moyen de quatre essais complémentaires (DPPH, CUPRAC, ABTS et FRAP). Toutes les espèces ont présenté une forte activité antioxydante, bien que son ampleur ait varié selon les méthodes. Dans l’essai DPPH, l’activité de piégeage allait de 84 % (C.B.P.) à 92 % (A.M.). Les valeurs CUPRAC s’échelonnaient de 358 à 538 μmol TE/mL, l’activité la plus élevée ayant été enregistrée pour A.M. (538 μmol TE/mL) et M.O. (516 μmol TE/mL). La capacité de piégeage du radical ABTS suivait une tendance similaire, avec des valeurs comprises entre 280 et 331 μmol TE/mL. Dans l’essai FRAP, A.M. (632 μmol TE/100 g) et C.B.P. (617 μmol TE/100 g) présentaient l’activité de réduction du fer la plus forte, tandis que M.O. affichait une valeur légèrement inférieure (573 μmol TE/100 g).
Dans l’ensemble, tous les extraits ont montré une solide activité antioxydante, avec des différences notables dépendant de l’essai.
2.3. Analyse LC-MS
Les résultats qualitatifs et quantitatifs obtenus sont présentés dans le Tableau 3.
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L’analyse LC-MS a identifié de multiples acides phénoliques et flavonoïdes chez A.M. comme chez M.O., avec d’importantes différences quantitatives entre les espèces (Tableau 3). A.M. présentait des concentrations élevées de lutéoline-7-O-glucoside (121,8 μg/mL), de tilianine (11,707 mg/mL) et de quercétine (22,807 μg/mL), ainsi que des quantités significatives de dérivés des acides caféique et chlorogénique.
M.O. présentait des concentrations plus faibles pour la plupart de ces composants, à l’exception de l’acacétine (3,259 μg/mL), présente à des teneurs supérieures à celles d’A.M. Certains composés, tels que l’apigénine et le lutéoline-7-O-rutinoside, se situaient sous la limite de quantification chez les deux espèces.
Les activités biologiques observées dans les extraits étudiés pourraient être associées à la présence des acides phénoliques et des flavonoïdes identifiés dans le Tableau 3. Les composés tels que l’acide caféique, l’acide chlorogénique et leurs dérivés sont bien connus pour leurs propriétés antioxydantes, principalement dues à leur capacité à donner des atomes d’hydrogène et à piéger les radicaux libres. En outre, il a été largement rapporté que les flavonoïdes tels que la quercétine, le lutéoline-7-O-glucoside, la tilianine et l’acacétine présentent des activités à la fois antioxydantes et antimicrobiennes. Les concentrations relativement plus élevées de lutéoline-7-O-glucoside et de quercétine dans les échantillons analysés pourraient contribuer de manière significative aux effets biologiques observés.
L’analyse LC-MS de l’extrait de Capsella bursa-pastoris Medik. a révélé un profil phytochimique principalement caractérisé par des acides phénoliques et des teneurs modérées en flavonoïdes. Parmi les composés identifiés, l’acide chlorogénique était le constituant phénolique majeur (4,015 ± 0,0075 μg/mL), accompagné de ses isomères, à savoir l’acide néochlorogénique (1,097 ± 0,0198 μg/mL) et l’acide cryptochlorogénique (1,081 ± 0,1260 μg/mL), ainsi que de l’acide caféique (2,324 ± 0,0123 μg/mL). En ce qui concerne les flavonoïdes, la quercétine (12,445 ± 0,0520 μg/mL), la tilianine (6,357 ± 0,0065 μg/mL) et le lutéoline-7-O-glucoside (7,305 ± 0,0550 μg/mL) ont été identifiés comme les principaux constituants, tandis que des concentrations plus faibles ont été enregistrées pour le lutéoline-7-O-rutioside (1,047 ± 0,0071 μg/mL) et l’acacétine (0,310 ± 0,1032 μg/mL). Plusieurs composés, notamment l’apigénine, l’hespérétine et la naringénine, ont été détectés sous la limite de quantification. Globalement, le profil quantitatif indique que C.B.P. contient un ensemble diversifié mais modérément concentré de composés bioactifs, les acides phénoliques contribuant probablement de manière importante à sa capacité antioxydante, tandis que la teneur relativement plus faible en flavonoïdes pourrait expliquer son activité antimicrobienne réduite par rapport aux autres espèces étudiées.
2.4. Activité antimicrobienne des espèces Capsella bursa-pastoris Medik., Arnica montana L. et Melissa officinalis L.
L’activité antimicrobienne des extraits de Melissa officinalis L., d’Arnica montana L. et de Capsella bursa-pastoris Medik. a été évaluée contre Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 par diffusion sur disque et détermination de la CMI ; les résultats sont présentés dans le Tableau 4.
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L’activité antimicrobienne des extraits de Melissa officinalis L., d’Arnica montana L. et de Capsella bursa-pastoris Medik. a été évaluée contre Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 par diffusion sur disque. Les résultats de la diffusion sur disque ont révélé une relation concentration-réponse nette, avec des zones d’inhibition plus grandes observées aux rapports de dilution les plus faibles. Parmi les trois extraits, M.O. présentait globalement l’activité la plus forte. À la dilution 1:4, M.O. produisait les plus grandes zones d’inhibition contre Staphylococcus aureus (20 mm) et Streptococcus pneumoniae (18 mm), se rapprochant de l’activité d’antibiotiques standards tels que la gentamicine (22 mm) et l’oxacilline (22 mm). A.M. montrait une inhibition modérée (12–15 mm à 1:4), tandis que C.B.P. produisait les zones les plus petites (10–12 mm).
2.5. Capacité antioxydante du mélange de Capsella bursa-pastoris Medik., Melissa officinalis L. et Arnica montana L.
Tous les mélanges d’extraits (ACM1–ACM7) ont présenté une activité antioxydante considérable dans l’essai DPPH. Le pourcentage d’inhibition variait entre 67,23 % et 75,34 %, la formulation ACM4 (1:1:2 ; A.M.:C.B.P.:M.O.) présentant l’activité la plus élevée (75,34 %). ACM2 et ACM1 présentaient également des capacités antioxydantes élevées (respectivement 72,68 % et 71,48 %). L’augmentation du volume d’extrait n’a pas amélioré de manière significative l’activité inhibitrice, ce qui suggère une saturation des composés actifs.
Les résultats sont présentés dans le Tableau 5.
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2.6. Activité antimicrobienne du mélange d’espèces
L’évaluation antimicrobienne des mélanges a révélé une inhibition modérée des bactéries à Gram positif. Les effets les plus forts ont été enregistrés pour les formulations contenant des proportions plus élevées de M.O. ou des rapports équilibrés entre les trois espèces. Plus précisément, ACM4 et ACM5 ont produit des zones d’inhibition de 20 mm contre Streptococcus pneumoniae ; ACM4, ACM5 et ACM6 ont présenté l’effet inhibiteur le plus élevé contre Staphylococcus aureus (10 mm). Aucun des mélanges n’a montré d’activité inhibitrice contre Pseudomonas aeruginosa. Le Tableau 6 présente les résultats et la Figure 1 présente les zones d’inhibition de la croissance.
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3. Discussion
3.1. Teneur en polyphénols, flavonoïdes et anthocyanines des extraits végétaux étudiés
L’extrait obtenu à partir des fleurs d’Arnica montana L. présentait la teneur totale en polyphénols la plus élevée ; ce fait suggère qu’A.M. pourrait posséder un potentiel antioxydant plus puissant, puisque les polyphénols figurent parmi les principaux composés responsables du piégeage des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de la protection des composants cellulaires contre le stress oxydatif. En ce qui concerne les flavonoïdes totaux, A.M. présentait de nouveau la concentration la plus élevée (24,53 mg QE/g DW), tandis que M. officinalis et C.B.P. présentaient des valeurs légèrement inférieures (respectivement 20,08 et 18,84 mg QE/g DW). Les flavonoïdes jouent un rôle essentiel dans la modulation des activités anti-inflammatoires et antimicrobiennes, et les teneurs élevées relevées chez A.M. indiquent encore davantage leur pertinence pharmacologique.
Les anthocyanines sont connues pour leurs propriétés antioxydantes et cytoprotectrices, contribuant à l’activité biologique globale des extraits végétaux.
Dans l’ensemble, les résultats mettent en évidence Arnica montana L. comme la source la plus riche en composés phénoliques parmi les espèces étudiées, ce qui conforte son utilisation comme antioxydant naturel prometteur. Capsella bursa-pastoris Medik. et Melissa officinalis L. ont également présenté des teneurs considérables en polyphénols et en flavonoïdes, ce qui concorde avec les rapports antérieurs décrivant des variations interspécifiques de la teneur en métabolites secondaires.
3.2. Capacité antioxydante des espèces Capsella bursa-pastoris Medik., Arnica montana L. et Melissa officinalis L.
Dans cette étude, la capacité antioxydante de Capsella bursa-pastoris Medik. (C.B.P.), de Melissa officinalis L. (M.O.) et d’Arnica montana L. (A.M.) a été évaluée au moyen de quatre essais in vitro complémentaires (DPPH, CUPRAC, ABTS et FRAP). Ces essais reflètent différents mécanismes réactionnels — piégeage des radicaux et transfert d’électrons — et fournissent ensemble un profil complet du potentiel antioxydant.
Parmi les extraits étudiés, A.M. a constamment présenté les meilleures performances antioxydantes, suivie de M.O. et de C.B.P. L’activité de piégeage du radical DPPH nettement plus élevée observée pour A.M. et M.O., comparativement à C.B.P., reflète leur capacité supérieure à donner de l’hydrogène. Cette tendance a également été étayée par les essais CUPRAC et ABTS, dans lesquels A.M. et M.O. ont présenté des capacités antioxydantes en équivalents Trolox sensiblement supérieures à celles de C.B.P. Fait intéressant, dans l’essai FRAP, C.B.P. approchait la capacité d’A.M. à réduire le fer, ce qui suggère la présence, chez C.B.P., de constituants spécifiques particulièrement efficaces dans les réactions d’oxydoréduction fondées sur le transfert d’électrons. Ces résultats indiquent que, tandis qu’A.M. et M.O. présentent une activité de piégeage des radicaux à large spectre par de multiples mécanismes, C.B.P. pourrait contenir des composés phénoliques spécialisés dont les performances sont disproportionnellement bonnes dans les essais impliquant la réduction des ions ferriques.
Les tendances observées concordent avec les données de la littérature récente. Les extraits de M.O. sont systématiquement décrits comme riches en acides phénoliques (rosmarinique, caféique) et en flavonoïdes, ce qui leur confère une forte capacité de piégeage du DPPH et de l’ABTS. Adamczyk-Szabela et al. (2023) ont démontré que le stress environnemental augmente à la fois la teneur en composés phénoliques et l’activité antioxydante de M.O., confirmant son solide potentiel d’oxydoréduction. De même, les formulations nano-éthosomales de M.O. conservaient une forte activité DPPH et une importante capacité de chélation des métaux. Arnica montana L. est également reconnue pour sa riche composition phénolique, comprenant des acides chlorogéniques et caféoylquiniques, responsables de ses puissantes propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. Petrova et al. (2025) ont rapporté que l’élicitation par un extrait de levure ou par l’acide salicylique augmentait la teneur en composés phénoliques et la capacité antioxydante d’A.M., ce qui concorde avec les valeurs élevées observées ici. Bien que Capsella bursa-pastoris Medik. ait été moins largement étudiée, des recherches récentes confirment son potentiel antioxydant significatif. Une analyse comparative de 2022 portant sur des plantes de l’Himalaya a montré que l’extrait éthanolique de C.B.P. présentait une activité DPPH et ABTS modérée par rapport aux espèces plus riches en polyphénols. D’autres travaux attribuent le pouvoir antioxydant de C.B.P. principalement aux flavonoïdes (quercétine, kaempférol) et aux acides phénoliques, ce qui pourrait expliquer sa forte réponse FRAP dans notre étude. Les légères différences entre les essais peuvent s’expliquer par la chimie d’oxydoréduction distincte explorée par chaque test — DPPH et ABTS reflétant le piégeage des radicaux, tandis que FRAP et CUPRAC indiquent l’efficacité de réduction des métaux.
Les fortes performances d’A.M. et de M.O. résultent probablement de concentrations totales plus élevées en composés phénoliques et en flavonoïdes, directement corrélées au potentiel antioxydant. La valeur FRAP relativement élevée de C.B.P. suggère un enrichissement en agents réducteurs spécifiques, éventuellement des composés soufrés ou azotés typiques des plantes de la famille des Brassicaceae. En outre, C.B.P. est connue pour contenir des glucosinolates et leurs produits d’hydrolyse, qui peuvent participer aux réactions d’oxydoréduction et contribuer au comportement antioxydant global.
3.3. Analyse LC-MS
Les résultats obtenus par analyse LC/MS ont mis en évidence la présence et permis la quantification de composés phénoliques et de flavonoïdes d’une importance biologique majeure, reconnus pour leur potentiel antioxydant, anti-inflammatoire et antimicrobien. Arnica montana L. et Melissa officinalis L. ont toutes deux présenté un profil phytochimique complexe, mais avec des différences quantitatives notables.
L’extrait d’Arnica montana L. s’est révélé présenter une teneur élevée en lutéoline-7-O-glucoside (121,8 µg/mL) et en tilianine (11,7 mg/mL). Il a été rapporté que la lutéoline et ses dérivés possèdent une activité antibactérienne contre Streptococcus mutans et Porphyromonas gingivalis, agents impliqués dans l’étiologie des caries et des maladies parodontales. En outre, la lutéoline inhibe la production d’IL-6 et de TNF-α, cytokines impliquées dans l’inflammation gingivale. La tilianine, un flavonoïde glycosidique, est décrite pour ses propriétés antioxydantes et ses effets protecteurs sur les tissus vasculaires, ce qui suggère un possible rôle adjuvant dans la réduction du stress oxydatif présent dans plusieurs affections.
Melissa officinalis L. présentait des concentrations plus faibles pour la plupart des composés, mais se distinguait par une teneur accrue en acacétine (3,26 µg/mL). Il a été établi que les composés de la famille des flavonoïdes (dont l’acacétine) possèdent des activités antifongiques contre Candida albicans et des effets anti-inflammatoires. M.O. est aussi une source connue d’acides phénoliques (acide chlorogénique, acide caféique), composés qui pourraient contribuer à inhiber la déminéralisation dentaire et le développement bactérien. Comparativement, une concentration de quercétine plus élevée a été identifiée chez A.M. (22,8 µg/mL) que chez M.O. (1,7 µg/mL). Les propriétés antimicrobiennes et anti-inflammatoires de la quercétine sont bien établies, et celle-ci pourrait être utilisée dans les traitements adjuvants de la parodontite. La présence de composés phénoliques — acide chlorogénique (4,02 µg/mL chez A.M. ; 0,95 µg/mL chez M.O.) et acide caféique (0,33 µg/mL chez Arnica montana L. ; 0,24 µg/mL chez Melissa officinalis L.) — complète l’activité biologique par des effets antioxydants et une action contre les bactéries cariogènes.
Il convient de noter que certaines substances, telles que l’apigénine, le lutéoline-7-O-rutinoside et la vitexine, étaient sous la limite de quantification chez Melissa officinalis L. ou n’ont pas été détectées chez Arnica montana L. Cependant, la littérature montre que l’apigénine, même à de faibles concentrations, peut inhiber la formation du biofilm et la production de glucanes par Streptococcus mutans ; leur absence dans les extraits analysés n’exclut donc pas un potentiel biologique pertinent dans d’autres préparations phytothérapeutiques, comme le biofilm bactérien.
Dans l’ensemble, les résultats étayent l’hypothèse selon laquelle les extraits d’Arnica montana L. et de Melissa officinalis L. pourraient constituer des sources précieuses de composés bioactifs susceptibles de jouer un rôle adjuvant dans la prévention et la prise en charge de diverses maladies. Cependant, les différences quantitatives observées entre les espèces soulignent la nécessité de standardiser les extraits et de mener des études in vitro et in vivo supplémentaires afin de confirmer leur pertinence biologique et leur applicabilité clinique potentielle.
L’analyse LC-MS de Capsella bursa-pastoris Medik. a révélé un profil phytochimique dominé par les acides phénoliques, en particulier l’acide chlorogénique et ses isomères, suivis de l’acide caféique, qui étaient présents en quantités importantes. Ces composés majeurs sont probablement les principaux contributeurs à l’activité antioxydante de l’extrait, en raison de leur capacité bien établie à piéger les radicaux libres et à agir comme agents réducteurs, ainsi que cela a été observé dans l’essai FRAP. Leur forte abondance pourrait expliquer la réduction importante et stable des espèces réactives de l’oxygène, comparativement à d’autres extraits végétaux présentant des profils phytochimiques plus uniformément répartis.
Bien que des flavonoïdes tels que la quercétine, la tilianine et le lutéoline-7-O-glucoside aient été détectés à des concentrations plus faibles, ils pourraient néanmoins exercer un effet antioxydant de soutien et une activité antimicrobienne modeste par des interactions avec les membranes ou par inhibition enzymatique. Cependant, leur abondance relativement faible explique probablement l’activité antimicrobienne plus faible de C.B.P. par rapport aux extraits plus riches en flavonoïdes.
En résumé, les effets biologiques de C.B.P. semblent être principalement déterminés par les principaux acides phénoliques, les flavonoïdes jouant un rôle secondaire et complémentaire. Cette répartition suggère que le potentiel antioxydant et l’activité antimicrobienne partielle de l’extrait sont directement corrélés aux composés présents aux concentrations les plus élevées, tandis que les constituants mineurs n’exercent qu’une influence limitée.
3.4. Activité antimicrobienne des espèces Capsella bursa-pastoris Medik., Arnica montana L. et Melissa officinalis L.
Les résultats obtenus se sont révélés conformes aux rapports antérieurs sur les propriétés antimicrobiennes de ces plantes. M.O. est riche en acides phénoliques (acide rosmarinique, acide caféique), en flavonoïdes et en monoterpènes, tels que le citral et le citronellal, connus pour perturber les membranes microbiennes et inhiber les capteurs de quorum. Plusieurs études ont rapporté une forte activité antibactérienne des extraits de M.O. ainsi qu’une forte inhibition de Staphylococcus aureus. Nos résultats corroborent ces observations et confirment que M.O. est particulièrement efficace contre les bactéries à Gram positif.
A.M. présentait une activité modérée, conformément aux études antérieures rapportant une inhibition de Staphylococcus aureus et d’autres pathogènes buccaux par des extraits de fleurs d’A.M. La bioactivité d’A.M. est attribuée aux lactones sesquiterpéniques (par exemple, l’hélénaline) et aux flavonoïdes, qui possèdent des propriétés antibactériennes, antifongiques et antibiofilm. L’activité plus faible de C.B.P. par rapport à M.O. et A.M. concorde avec les études montrant que les extraits de C.B.P. exercent principalement des effets anticandidosiques et antibiofilm à des concentrations relativement élevées. Néanmoins, l’inhibition mesurable observée dans notre étude suggère que C.B.P. pourrait encore apporter une contribution précieuse aux formulations à base de plusieurs plantes.
L’inefficacité des trois extraits contre Pseudomonas aeruginosa n’est pas surprenante compte tenu des mécanismes de résistance intrinsèques de cet agent pathogène à Gram négatif, notamment les pompes d’efflux et la faible perméabilité de la membrane externe. Cela met en évidence une limite courante de l’activité antimicrobienne d’origine végétale, qui est généralement plus efficace contre les bactéries à Gram positif en raison de l’absence de barrière constituée par la membrane externe.
À la suite des déterminations effectuées sur les extraits individuels, leurs mélanges ont été obtenus et étudiés afin d’évaluer l’incidence de la combinaison sur le profil phytochimique et l’activité biologique.
3.5. Capacité antioxydante du mélange de Capsella bursa-pastoris Medik., Melissa officinalis L. et Arnica montana L.
Tous les mélanges testés ont présenté une activité antioxydante considérable, avec des valeurs d’inhibition comprises entre environ 64 % et 75 %. Parmi eux, le mélange ACM4 présentait l’activité de piégeage la plus élevée (75,34 % avec 0,1 mL d’extrait), suivi d’ACM2 (72,68 %) et d’ACM1 (71,48 %). L’augmentation de la concentration au-delà de 0,3 mL n’a pas renforcé de manière significative l’effet inhibiteur, ce qui suggère que les composés antioxydants atteignaient un niveau de saturation à des volumes plus faibles.
Ces résultats indiquent que Melissa officinalis L., riche en acide rosmarinique et en flavonoïdes, joue un rôle majeur dans le piégeage des radicaux libres, comme l’ont rapporté Oroian et Escriche ainsi que Sipos et al. La tendance observée concorde avec la teneur en polyphénols et les effets synergiques entre les composés phénoliques d’Arnica montana L. (notamment les lactones sesquiterpéniques) et de Capsella bursae-pastoris L. (contenant des dérivés de l’acide sinapique).
Des observations similaires ont été rapportées dans des formulations à base de plusieurs plantes, dans lesquelles des rapports synergiques augmentaient l’efficacité antioxydante jusqu’à 20 % par rapport aux extraits seuls. Ces résultats suggèrent que la combinaison d’A.M., de C.B.P. et de M.O. pourrait conduire à une formulation possédant à la fois de puissantes propriétés antioxydantes et une activité anti-inflammatoire potentielle.
Bien que l’activité antioxydante des extraits ait été démontrée au moyen d’essais chimiques in vitro, des études supplémentaires utilisant des modèles cellulaires seraient utiles pour mieux comprendre la pertinence biologique et les mécanismes d’action des composés phénoliques identifiés.
3.6. Activité antimicrobienne du mélange des espèces Capsella bursa-pastoris Medik., Melissa officinalis L. et Arnica montana L.
Les présents résultats démontrent que les combinaisons des trois extraits végétaux (A.M., C.B.P., M.O.) dilués dans de l’alcool à 70 % présentent une activité antimicrobienne modérée contre les bactéries à Gram positif, avec une efficacité variable selon le rapport. Le fait qu’ACM4 (1:1:2) et ACM5 (2:2:1) aient obtenu l’inhibition la plus forte contre Streptococcus pneumoniae suggère que l’augmentation de la proportion d’un composant par rapport aux autres peut accroître l’efficacité. Une explication possible est un effet synergique entre les extraits, dans lequel une proportion plus élevée d’un extrait plus actif favorise la pénétration ou perturbe plus efficacement les membranes microbiennes.
Fait intéressant, dans certains cas, l’extrait dilué à 1:1 produisait des zones d’inhibition plus petites que certains échantillons plus dilués. Cette observation pourrait être liée à la capacité de diffusion réduite des extraits très concentrés. Une viscosité accrue et la présence de composés moins diffusibles peuvent limiter la diffusion radiale, tandis qu’une dilution modérée peut faciliter une meilleure diffusion des constituants antimicrobiens actifs, entraînant des zones d’inhibition plus grandes. En outre, des effets physicochimiques dépendant de la concentration pourraient également contribuer à ce comportement. À des concentrations plus élevées, une agrégation partielle ou des interactions intermoléculaires entre les constituants de l’extrait peuvent réduire leur biodisponibilité effective, même en l’absence de précipitation visible. À des dilutions modérées, une meilleure dispersion des composés bioactifs peut favoriser leur interaction avec les cellules microbiennes, entraînant une augmentation de l’activité apparente.
Cette observation pourrait également s’expliquer par une relation dose-réponse hormétique, dans laquelle les effets biologiques maximaux se produisent à des concentrations intermédiaires plutôt qu’élevées. Dans les extraits végétaux complexes, un tel comportement pourrait refléter le passage d’interactions synergiques à des concentrations modérées à des effets antagonistes ou à une biodisponibilité réduite aux doses plus élevées. Des réponses non linéaires similaires ont été rapportées dans les études phytochimiques et concordent avec la nature multifactorielle des mélanges d’origine végétale.
Ces observations concordent avec les données de la littérature indiquant que les extraits de plantes médicinales présentent souvent une activité antimicrobienne renforcée lorsqu’ils sont utilisés en combinaison, en raison de mécanismes multicibles (par exemple, perturbation de la paroi cellulaire, inhibition des pompes d’efflux, interférence avec le biofilm) plutôt que d’une action classique des antibiotiques sur une cible unique. En outre, la revue d’Oulahal et Degraeve (2022) souligne que les mélanges d’extraits phénoliques végétaux peuvent présenter une activité à plus large spectre que les extraits individuels.
L’activité relativement plus faible contre Staphylococcus aureus que contre Streptococcus pneumoniae suggère que Streptococcus pneumoniae pourrait être plus sensible à ces combinaisons d’extraits, ou que les extraits pourraient affecter préférentiellement des cibles plus pertinentes chez Streptococcus pneumoniae. Il s’agit de limites connues des extraits phénoliques végétaux : leur activité antimicrobienne in vitro pourrait ne pas être directement transposable à tous les micro-organismes, particulièrement aux bactéries à Gram négatif, en raison des effets de matrice ou des contraintes de diffusion.
Comparativement aux antibiotiques témoins, les mélanges d’extraits produisaient des zones d’inhibition plus petites que les antibiotiques standards ; toutefois, étant donné l’origine végétale et la nature brute des extraits, ces résultats sont encourageants en tant que dépistage préliminaire. Ils suggèrent que les combinaisons d’extraits pourraient servir de pistes en vue d’un affinage, d’une purification et d’une combinaison synergique avec des antibiotiques. En effet, des études antérieures soulignent que les composés d’origine végétale peuvent agir en synergie avec les antibiotiques conventionnels afin de surmonter la résistance.
L’activité biologique observée pour les extraits étudiés pourrait être liée à plusieurs classes de composés phytochimiques précédemment signalés chez Arnica montana L., Capsella bursa-pastoris Medik. et Melissa officinalis L. Arnica montana L. est connue pour contenir des lactones sesquiterpéniques (particulièrement l’hélénaline et ses dérivés), des flavonoïdes tels que les glycosides de quercétine et de lutéoline, ainsi que des acides phénoliques, qui ont été associés à des activités anti-inflammatoires, antimicrobiennes et antioxydantes. Capsella bursa-pastoris Medik. contient un large éventail de constituants bioactifs, notamment des flavonoïdes (dérivés de quercétine et de kaempférol), des acides phénoliques, des glucosinolates et des amines biogènes, dont il a été rapporté qu’ils contribuent aux effets antioxydants et antimicrobiens. Chez Melissa officinalis L., l’activité biologique est communément attribuée à des composés phénoliques tels que l’acide rosmarinique, les dérivés de l’acide caféique et les flavonoïdes, ainsi qu’à des terpénoïdes volatils, dont le citral et le géraniol, dont les propriétés antioxydantes, antimicrobiennes et anti-inflammatoires sont bien établies. Il convient cependant de souligner que les extraits utilisés dans cette étude constituent des mélanges phytochimiques complexes. Par conséquent, la bioactivité observée ne peut pas être attribuée sans équivoque à un composé ou à une classe de composés unique. Les effets pourraient au contraire résulter d’interactions additives ou synergiques entre de multiples constituants présents dans les extraits. Comme la présente étude n’a pas comparé l’activité des extraits totaux à celle des principaux composés isolés, l’attribution des effets biologiques observés exclusivement à des composés phytochimiques individuels demeure spéculative et doit être interprétée avec prudence. Des études supplémentaires comportant un fractionnement guidé par la bioactivité et des essais sur les constituants isolés seraient nécessaires pour clarifier la contribution de composés spécifiques.
4. Matériels et méthodes
4.1. Matériel végétal
Les échantillons de Capsella bursa-pastoris Medik. (C.B.P.) et de Melissa officinalis L. (M.O.) utilisés dans cette étude ont été récoltés en 2023 dans la flore spontanée du département de Bihor, dans des zones non polluées. C.B.P. a été récoltée entre avril et juin, et M.O. en juin, toutes deux dans des zones non polluées de la ville d’Oradea (département de Bihor, Roumanie). A.M. a été achetée à la Farmacia Parmelia, Hidisel, département de Bihor, Roumanie, en novembre 2024. Elle est disponible sous forme de tisane de fleurs d’arnica, commercialisée par Stefmar, Ramnicu Vâlcea, Roumanie, et sa date de validité court jusqu’en 2026.
Le type de sol sur lequel C.B.P. et M.O. ont été récoltées est classé comme préluvisol, de texture argileuse et riche en carbonates. Un spécimen de chaque espèce a été conservé dans l’herbier de la Faculté de médecine et de pharmacie d’Oradea, en Roumanie, enregistré dans le NYBG Steere Herbarium comme suit :
Capsella bursa-pastoris Medik. — U0P 05.136.
Melissa officinalis L. — U0P 05.707.
Pour C.B.P., un autre article de recherche a démontré que la partie aérienne contient la plus grande quantité de principes actifs ; la partie aérienne de la plante a donc été utilisée pour effectuer les déterminations et préparer les extraits. Seules les feuilles ont été utilisées pour M.O., et seules les fleurs l’ont été pour A.M., car ces parties des plantes sont les plus riches en composés bioactifs.
Pour l’analyse chimique, les matières végétales de Capsella bursa-pastoris Medik., d’Arnica montana L. et de Melissa officinalis L. ont été traitées séparément. Les matières ont été séchées à une température moyenne de 40 °C pendant 96 h.
Des extraits à une concentration de 10 % (w/w) ont ensuite été préparés pour chaque plante par macération de la matière séchée dans de l’éthanol à 70 % (v/v). Les matières végétales ont macéré pendant 10 jours dans un environnement frais et sombre afin de préserver leurs composés bioactifs.
Après la période de macération, chaque mélange a été filtré et les solutions résultantes ont été conservées à 6 °C ± 2 °C. Cinq jours plus tard, les extraits ont été soigneusement décantés, puis différents mélanges ont été préparés en vue d’analyses ultérieures.
Après filtration, le solvant a été partiellement éliminé au moyen d’un évaporateur rotatif Heidolph, Savski Nasip 7, Belgrade, Serbie, afin d’évaporer l’éthanol et d’obtenir des extraits bruts concentrés. Les résidus aqueux restants ont ensuite été dilués avec de l’alcool éthylique afin d’obtenir les concentrations souhaitées pour les essais phytochimiques et biologiques.
Les concentrations des extraits ont été définies sur la base de la préparation initiale à 10 % (w/w), et des dilutions en série (1:1, 1:2, 1:4 et 1:6) ont été réalisées. Les concentrations résultantes ont été calculées proportionnellement selon le principe de dilution (C1V1 = C2V2) et exprimées en concentrations relatives, donnant des valeurs finales respectives de 5 %, 3,33 %, 2 % et 1,43 %. Cette approche a assuré un cadre contrôlé et reproductible pour l’évaluation des effets dépendant de la dose. Les dilutions sont présentées dans le Tableau 7.
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Comme tous les extraits présentaient l’activité antimicrobienne la plus efficace à une dilution de 1:4, les mélanges ont été préparés à partir d’extraits dilués selon un rapport de 1:4.
Après avoir analysé chaque espèce séparément, nous avons observé que tous les extraits présentaient l’activité antimicrobienne la plus efficace à une dilution de 1:4. Les mélanges ont été préparés à partir d’extraits dilués selon un rapport de 1:4 (2 %), comme le montre le Tableau 8, et ACM 1–7 sont les abréviations désignant les mélanges.
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4.2. Analyse phytochimique
L’analyse phytochimique des plantes est essentielle pour identifier, quantifier et caractériser les composés secondaires (alcaloïdes, flavonoïdes, tanins, terpénoïdes, glycosides, etc.) qui déterminent les propriétés biologiques et pharmacologiques des espèces étudiées. Les tests suivants ont été réalisés dans le cadre de l’analyse phytochimique : détermination des polyphénols totaux, des flavonoïdes et des anthocyanines contenus dans les plantes, ainsi que de la capacité antioxydante des différentes plantes puis du mélange de plantes.
4.2.1. Détermination de la teneur totale en polyphénols
La teneur totale en polyphénols des échantillons a été déterminée au moyen de la méthode de Folin-Ciocalteu. Cette technique colorimétrique repose sur l’oxydation des groupes hydroxyle phénoliques en milieu alcalin, facilitée par le carbonate de sodium. La coloration bleue qui en résulte présente une absorbance qui augmente proportionnellement au nombre de groupes OH phénoliques et est mesurée à 765 nm.
Pour chaque mesure, 0,1 mL de solution d’extrait (contenant 1 000 μg de l’échantillon) a été ajouté dans une fiole jaugée de 50 mL contenant 46 mL d’eau distillée. Ensuite, 1 mL de réactif de Folin-Ciocalteu (Merck) a été introduit, et la fiole a été vigoureusement agitée afin d’assurer le mélange. Après une période de réaction de 3 min, 3 mL d’une solution aqueuse de carbonate de sodium (Na2CO3) à 2 % ont été ajoutés. Le mélange a ensuite été incubé à température ambiante pendant 2 h. L’absorbance a été mesurée à 765 nm au moyen d’un spectrophotomètre UV-VIS Shimadzu UV-1700 PharmaSpec (UV-1700 PharmaSpec, Shimadzu, Kyoto, Japon). Une courbe d’étalonnage a été construite à l’aide de solutions standards d’acide gallique préparées et analysées dans les mêmes conditions. La droite d’étalonnage (Figure 2) a été créée en utilisant la quercétine (QE) comme standard.
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4.2.2. Détermination des flavonoïdes totaux
La teneur totale en flavonoïdes a été estimée au moyen d’une technique colorimétrique modifiée déjà décrite. Pour commencer, 1 mL de solution d’échantillon (extrait à 0,1 mg/mL) a été ajouté dans une fiole jaugée de 10 mL, puis 4 mL d’eau distillée ont été ajoutés. Ensuite, 3 mL d’une solution de nitrite de sodium (NaNO2) à 5 % ont été introduits. Après un intervalle de cinq minutes, 0,3 mL d’une solution de chlorure d’aluminium (AlCl3) à 10 % a été ajouté. Six minutes plus tard, 2 mL d’hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M ont été incorporés. Le mélange a ensuite été complété au volume avec de l’eau distillée et soigneusement homogénéisé. L’absorbance de la solution finale a été mesurée à 510 nm au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Shimadzu UV-1700 Pharmaspec. Cette procédure a également été appliquée aux solutions standards de quercétine, ce qui a permis d’obtenir une droite d’étalonnage (Figure 3).
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4.2.3. Détermination de la teneur totale en anthocyanines
La concentration totale en anthocyanines a été évaluée au moyen d’une approche spectrophotométrique adaptée de la méthode décrite par Connor et al. (2002). Cette technique repose sur la variation de couleur des molécules d’anthocyanines en fonction du pH, ce qui permet de les quantifier même dans des mélanges complexes où d’autres pigments ou produits de dégradation peuvent être présents. La méthode est fondée sur la transformation structurale des anthocyanines en réponse au pH. À pH 1,0, les anthocyanines existent principalement sous leur forme colorée de cation flavylium (oxonium), tandis qu’à pH 4,5, elles se transforment en une structure hémiacétal presque incolore (de type chalcone). La mesure de la différence d’absorbance entre ces deux niveaux de pH fournit une estimation précise de la teneur totale en anthocyanines monomériques.
Les réactifs étaient un tampon de chlorure de potassium 0,025 M, pH 1,0, un tampon d’acétate de sodium 0,4 M, pH 4,5, et du méthanol contenant 0,3 % d’acide chlorhydrique (v/v). Environ 0,15 g d’échantillon a été pesé et homogénéisé dans du méthanol acidifié au moyen d’un homogénéisateur Ultraturrax (IKA Works GmbH & Co. KG, Staufen im Breisgau, Allemagne) à 3 000 tr/min pendant 1 min. L’homogénat a été centrifugé à 5 000 tr/min pendant 20 min. Le solide restant a été réextrait deux fois dans les mêmes conditions, et tous les surnageants ont été réunis pour l’analyse. L’extrait regroupé a été dilué dans deux systèmes tampons : l’un à pH 1,0 (tampon KCl) et l’autre à pH 4,5 (tampon acétate), selon un rapport de 5:95 (v/v). Les dilutions ont été laissées à l’équilibre à température ambiante pendant 15 min. L’absorbance a ensuite été enregistrée à la longueur d’onde maximale dans le visible (λ_vis-max, généralement 530 nm) et à 700 nm afin de corriger le voile ou la turbidité, les tampons correspondants étant utilisés comme blancs.
L’absorbance corrigée (A) a été calculée au moyen de l’équation suivante :
A = (A λvis-max − A700) pH 1,0 − (A λvis-max − A700) pH 4,5 (1)
La concentration en anthocyanines monomériques (exprimée en équivalents cyanidine-3-glucoside) a été calculée comme suit :
Anthocyanines monomériques (mg/L) = (A × MW × DF × 1 000)/(ε × 1) (2)
où A est l’absorbance calculée à partir de l’Équation (1) ; MW est la masse moléculaire de la cyanidine-3-glucoside (449,2 g/mol) ; DF est le facteur de dilution ; ε est l’absorptivité molaire (26 900 L·mol−1·cm−1) ; 1 est le trajet optique de la cuve en cm.
Les résultats finaux ont été exprimés en milligrammes de cyanidine-3-glucoside pour 100 g de poids sec (mg C3G/100 g DW).
4.2.4. Capacité antioxydante
Pouvoir antioxydant réducteur du fer (essai FRAP)
La capacité antioxydante des échantillons a été évaluée au moyen de l’essai du pouvoir antioxydant réducteur du fer (FRAP), tel qu’initialement décrit par Benzie et Strain (1996). Cette méthode quantifie la capacité des antioxydants présents dans l’échantillon à réduire le complexe ferrique-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ) en sa forme ferreuse (Fe2+-TPTZ) dans des conditions acides, produisant un chromophore de couleur bleue dont l’absorbance maximale se situe à 595 nm. Trois solutions mères ont été préparées : tampon acétate 300 mM (pH 3,6) ; solution de FeCl3·6H2O : 270 mg de chlorure ferrique hexahydraté dissous dans 50 mL d’eau distillée ; et solution de TPTZ : 150 mg de 2,4,6-tripyridyl-s-triazine dissous dans 150 µL de HCl et complétés à un volume de 50 mL avec de l’eau distillée.
Le réactif de travail FRAP a été fraîchement préparé en mélangeant 50 mL de tampon acétate, 5 mL de solution de FeCl3·6H2O et 5 mL de solution de TPTZ. Ce réactif a été incubé à 37 °C avant utilisation. Pour la quantification, le Trolox (un analogue de la vitamine E) a été utilisé comme antioxydant standard. Une courbe standard a été construite en utilisant des concentrations de Trolox allant de 0 à 300 µM, produisant une courbe d’étalonnage linéaire dont le coefficient de corrélation (R2) était de 0,9956 et l’équation de régression :
y = 0,0017x + 0,0848, où y représente l’absorbance mesurée à 595 nm.
L’absorbance des échantillons a été déterminée à 595 nm après mélange avec le réactif FRAP. La capacité antioxydante a été exprimée en micromoles d’équivalents Trolox pour 100 µL d’extrait (µmol TE/100 µL).
Essai CUPRAC de réduction des ions cuivriques (Cu2+)
La capacité antioxydante de réduction des ions cuivriques des extraits végétaux a été évaluée au moyen d’une version modifiée de la méthode décrite par Karaman et al. (2010). Dans cette procédure, 0,25 mL de solution de CuCl2 (0,01 M), 0,25 mL de solution de néocuproïne dans l’éthanol (7,5 × 10−3 M) et 0,25 mL de tampon d’acétate d’ammonium (1 M) ont été ajoutés successivement dans un tube à essai. Ce mélange a ensuite été combiné avec l’extrait végétal. Le volume total a été porté à 2 mL avec de l’eau distillée, puis le contenu a été soigneusement homogénéisé. Les mélanges réactionnels ont été conservés à température ambiante pendant 30 min dans des tubes bouchés. Après incubation, l’absorbance a été enregistrée à 450 nm par rapport à un blanc de réactif. Une augmentation de l’absorbance traduit une capacité antioxydante supérieure par une plus grande réduction des ions cuivriques (Cu2+).
Méthode de piégeage des radicaux libres (DPPH) selon Brand-Williams et al. (1995)
La capacité des extraits végétaux à piéger le radical libre stable 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) a été évaluée selon une procédure légèrement modifiée fondée sur Brand-Williams et al. (1995). Dans cet essai, les antioxydants présents dans les extraits réduisent les radicaux DPPH en donnant des atomes d’hydrogène, ce qui provoque un changement de couleur, du violet foncé au jaune pâle. Ce changement a été suivi par spectrophotométrie à 517 nm au moyen d’un spectrophotomètre UV-Vis. Une solution fraîche de DPPH (6,0 × 10−5 M dans le méthanol) a été préparée quotidiennement afin de garantir la constance des résultats. Les mélanges réactionnels ont été incubés dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min avant les mesures d’absorbance. Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires afin d’assurer la reproductibilité. Le pourcentage d’activité de piégeage des radicaux a été calculé à l’aide de la formule :
% d’inhibition = [(AB − AA)/AB] × 100
où AB = absorption de l’échantillon blanc (t = 0 min), et AA = absorption de la solution d’extrait testée (t = 15 min).
Méthode ABTS
L’essai ABTS repose sur la capacité des antioxydants à neutraliser le cation radicalaire ABTS (ABTS•+ ; acide 2,2′-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)), un chromophore bleu-vert présentant une absorbance maximale à 734 nm. Le radical ABTS•+ a été généré en faisant réagir une solution d’ABTS (7 mM) avec du persulfate de potassium (2,45 mM) à température ambiante, puis en l’incubant dans l’obscurité pendant 16 h. La capacité antioxydante des échantillons a été évaluée par comparaison avec le standard Trolox. En bref, 0,1 mL d’extrait de l’échantillon a été mélangé avec 0,9 mL de solution d’ABTS•+, et l’absorbance a été mesurée à 734 nm après 30 min d’incubation.
Les résultats ont été exprimés en µmol d’équivalents Trolox par mL d’extrait. Les valeurs ABTS ont été calculées à l’aide de la courbe d’étalonnage :
y = 629x + 98,94 (R2 = 0,998), où y représente l’absorbance et x correspond à la concentration en équivalents Trolox (µmol).
4.2.5. Analyse LC-MS
L’analyse LC-MS (chromatographie liquide-spectrométrie de masse) a été réalisée au moyen d’un système UHPLC Shimadzu Nexera I LC/MS-8045 (Kyoto, Japon), équipé d’une pompe quaternaire, d’un échantillonneur automatique, d’une source d’ionisation par électrospray (ESI) et d’un spectromètre de masse à quadripôle. La séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne en phase inverse Luna C18 (150 × 4,6 mm, granulométrie de 3 μm, taille des pores de 100 Å) de Phenomenex (Torrance, Californie, États-Unis). La température de la colonne a été maintenue à 40 °C pendant toute l’analyse.
La phase mobile, décrite dans le Tableau 9, consistait en un mélange avec gradient de méthanol (Merck, Darmstadt, Allemagne) et d’eau ultrapure obtenue au moyen d’un système de purification d’eau ultrapure Simplicity (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, États-Unis). De l’acide formique (Merck, Darmstadt, Allemagne) de qualité LC/MS a été utilisé comme modificateur organique. Le débit a été fixé à 0,5 mL/min et la durée totale de chaque analyse était de 36 min.
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La détection a été réalisée au moyen d’un spectromètre de masse à quadripôle équipé d’une source d’ionisation par électrospray (ESI), fonctionnant en modes positif et négatif de suivi de réactions multiples (MRM) (voir le Tableau des standards, Tableau 9). La température de l’interface a été maintenue à 300 °C. L’azote a été employé à la fois comme gaz de nébulisation (35 psi) et comme gaz de séchage (10 L/min). La tension capillaire a été réglée à +3 000 V.
Les standards analytiques (Tableau 9) ont été obtenus auprès de Phytolab (Vestenbergsgreuth, Allemagne). Pour chaque niveau de concentration, 1 µL de solution standard a été injecté. Les extraits d’échantillons ont été dilués à 1:5 dans du méthanol, et 1 µL d’extrait dilué a été injecté en trois exemplaires.
L’identification des composés cibles reposait sur la comparaison des spectres de masse et des transitions MRM caractéristiques des pics séparés par chromatographie avec ceux des standards de référence. La quantification a été effectuée au moyen de la transition principale de chaque analyte, et des courbes d’étalonnage ont été générées à cette fin. Le Tableau 9 présente les équations d’étalonnage, les coefficients de corrélation (R2) et les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) calculées.
4.3. Activité antimicrobienne
L’activité antimicrobienne de C.B.P., M.O., A.M. et de mélanges de différents rapports a été évaluée au moyen de la méthode de diffusion sur disque selon la méthodologie standard et par détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI).
Les micro-organismes utilisés étaient les suivants : Staphylococcus aureus (Gram positif) — ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae — ATCC 49619, et Pseudomonas aeruginosa (−) — ATCC 27853 (Gram négatif).
La gélose Mueller-Hinton a été utilisée pour Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa. Les inoculums ont été préparés par mise en suspension directe, dans une solution saline, de colonies cultivées pendant 20 à 24 h, puis ajustés à un standard de 0,5 McFarland. Chaque souche a été inoculée sur le milieu de culture approprié au moyen d’un écouvillon stérile, et les boîtes ont été séchées pendant 10 à 15 min. Des microdisques stériles de 6 mm de diamètre, saturés avec un extrait de C.B.P., M.O. ou A.M. dilué à 1:20, avec des mélanges de plantes en différents rapports et avec des mélanges de ces plantes dans les proportions décrites précédemment, ont été placés sur les boîtes inoculées. Après une nuit d’incubation à 35,9 °C, les diamètres des zones d’inhibition ont été mesurés en millimètres. Des microdisques imprégnés d’éthanol à 70 % (20 μL) ont été utilisés comme témoins négatifs. Tous les essais antimicrobiens ont été réalisés en trois exemplaires afin d’assurer la fiabilité et la reproductibilité des résultats. Chaque expérience a été répétée indépendamment trois fois à l’aide de cultures bactériennes fraîchement préparées. Les diamètres des zones d’inhibition ont été mesurés et exprimés sous forme de valeurs moyennes ± écart-type (SD).
5. Conclusions
Les extraits éthanoliques d’Arnica montana L., de Melissa officinalis L. et de Capsella bursa-pastoris Medik. ont présenté des teneurs élevées en polyphénols et en flavonoïdes ainsi qu’une activité antioxydante pertinente. Parmi eux, Arnica montana L. a montré la capacité antioxydante la plus forte et le profil phénolique le plus riche. L’analyse LC-MS a révélé des composés caractéristiques, notamment le lutéoline-7-O-glucoside et la tilianine chez Arnica montana L., l’acacétine chez Melissa officinalis L., et la rutine et l’hypéroside chez Capsella bursa-pastoris Medik. Les essais fonctionnels antioxydants et les tests antimicrobiens ont indiqué des effets synergiques, particulièrement dans le mélange ACM4.
Ces résultats étayent le développement potentiel d’une formulation pharmaceutique.