Comparaison de la variation phytochimique des métabolites non volatils dans des teintures mères d’Arnica montana préparées à partir de la plante entière fraîche et séchée, par empreinte UHPLC-HRMS et analyse chimiométrique
Référence : Molecules 2022. — PMC9103735 · DOI 10.3390/molecules27092737 Type : étude phytochimique · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Arnica montana L. est reconnue depuis des siècles comme remède à base de plantes pour traiter les plaies et favoriser la cicatrisation. Elle possède également une longue tradition d’utilisation en homéopathie. Selon son usage médicinal, les réglementations de normalisation autorisent différents procédés de fabrication, impliquant différentes matières premières, telles que la plante entière d’arnica à l’état frais ou séché. Dans cette étude, une approche métabolomique non ciblée par UHPLC-HRMS/MS a été utilisée pour comparer la composition phytochimique de teintures mères d’A. montana préparées soit à partir de plante entière fraîche (TMf), soit à partir de plante entière séchée à l’étuve (TMs). L’analyse multivariée des données a montré des différences significatives entre les TMf et les TMs. La déréplication des spectres HRMS et MS/MS des composés les plus discriminants a conduit à l’annotation de l’acide quinique, d’acides dicaféoylquiniques, du caféate d’éthyle, de dérivés du thymol et de la déhydrophytosphingosine, dont les teneurs étaient accrues dans les TMf, tandis que les produits de réarrangement d’Amadori (PRA) et les esters d’acide dicaféoylquinique méthoxyoxaloylés étaient enrichis dans les TMs. Ni les lactones sesquiterpéniques ni les flavonoïdes n’étaient affectés par le procédé de séchage. C’est la première fois qu’une sphingosine, le caféate d’éthyle et des PRA sont décrits chez A. montana. En outre, de nouveaux produits naturels putatifs ont été détectés sous la forme de 10-hydroxy-8,9-époxy-thymolisobutyrate et d’un conjugué fructose-proline oxydée, dont l’isolement et l’élucidation structurale complète seront nécessaires pour vérifier cette observation.
1 Introduction
Arnica montana L. (Asteraceae) est une plante herbacée vivace. Elle pousse à l’état sauvage dans toute l’Europe, dans les prairies, les pâturages et les landes, principalement en montagne, depuis le sud de la Norvège et la Lettonie jusqu’au sud du Portugal, aux Apennins septentrionaux et aux Carpates méridionales. Les fleurs d’Arnica sont connues depuis des siècles comme remède à base de plantes ; elles étaient initialement utilisées par voie interne en phytothérapie et ne sont actuellement appliquées que par voie externe sur des lésions telles que les ecchymoses, les entorses, les inflammations causées par les piqûres d’insectes, ainsi que dans la gingivite, les ulcères aphteux et le traitement symptomatique des affections rhumatismales musculaires et articulaires. A. montana possède également une très longue histoire d’utilisation homéopathique, puisqu’elle a été décrite à l’origine par Samuel Hahnemann, l’inventeur de cette forme de traitement.
La composition chimique d’A. montana est bien connue ; plus de cent cinquante substances thérapeutiquement actives ont été décrites dans les différentes parties de la plante. Globalement, elle contient des lactones sesquiterpéniques de type pseudoguaianolide, principalement l’hélénaline et la 11α,13-dihydrohélénaline ainsi que leurs esters avec les acides acétique, isobutyrique, méthacrylique, tiglique et d’autres acides carboxyliques. Les autres constituants comprennent des diterpènes, des triterpènes (arnidiol), des flavonols ainsi que leurs glycosides et glucuronides, des alcaloïdes pyrrolizidiniques (tussilagine et isotussilagine), des polyacétylènes, des dérivés de l’acide chlorogénique (esters caféoyliques, cinnamoyliques, féruloyliques, fumaroyliques et méthoxyoxaloyliques), des coumarines, des acides gras, des caroténoïdes et de l’huile essentielle.
Selon la Pharmacopée européenne (monographie 1391), A. montana est définie, sur le plan médicinal, comme les « capitules floraux séchés, entiers ou partiellement fragmentés, d’Arnica montana L. ». Selon le Comité des médicaments à base de plantes (HMPC) de l’Agence européenne des médicaments (EMA), les préparations végétales destinées aux phytomédicaments contenant A. montana sont une teinture de fleurs séchées (rapport drogue/extrait [DER] de 1:10) extraite avec de l’EtOH à 70 %, une teinture de fleurs séchées (DER de 1:10 ou 1:5) extraite avec de l’EtOH à 60 %, ou un extrait liquide de fleurs fraîches (DER de 1:20) obtenu avec de l’EtOH à 50 %. Il convient de mentionner que, pour les préparations homéopathiques décrites dans la Pharmacopée européenne, la teinture mère d’arnica (monographie 2371 ; méthode 1.1.10 renvoyant à la Pharmacopée française) est obtenue à partir de la plante entière fleurie fraîche, extraite avec de l’EtOH à 45 % (DER de 1:10), ce que confirme la matière médicale homéopathique.
Au cours de la dernière décennie, des approches métabolomiques visant à identifier et à quantifier tous les composants de mélanges complexes ont été développées ; l’ensemble des données acquises peut ainsi être exploité pour comparer les compositions phytochimiques de différents extraits. Toutefois, la capacité de la métabolomique à rendre compte de toute la complexité des mélanges phytochimiques dépend fortement de la méthode utilisée pour recueillir les données. Il a par exemple été montré que les méthodes séparatives fournissent des modèles statistiques plus précis et des taux d’identification plus élevés que les empreintes spectroscopiques directes.
L’objectif de ce travail était donc d’évaluer si des différences de composition chimique sont détectables dans des teintures mères homéopathiques (TM) préparées à partir de plante entière fraîche (TMf) ou de plante entière séchée (TMs) d’A. montana, au moyen d’une approche métabolomique fondée sur la LC-MS, sans modification des molécules natives. À cette fin, six lots de plante entière d’A. montana ont été obtenus auprès de six fournisseurs différents et divisés en deux parties, dont l’une a été séchée selon un procédé industriel utilisant un séchoir multicouche chauffé à 65 °C. Douze teintures mères ont été préparées à partir des matières premières et échantillonnées en double, soit un total de 24 échantillons (lot 1 : TMf1, TMf2, TMs1, TMs2 ; lot 2 : TMf1, TMf2, …). Toutes les empreintes LC-MS ont ensuite été soumises à une analyse multivariée des données afin d’évaluer les différences moléculaires et d’identifier putativement les composés les plus discriminants entre les TMf et les TMs.
2 Résultats
2.1 Comparaison des résidus secs
À titre d’étape préliminaire, les résidus secs des TM obtenues à partir de plantes entières fraîches (TMf) et séchées (TMs) ont été évalués afin de confirmer que les échantillons étaient quantitativement comparables pour une étude métabolomique. Comme le montre la figure S1 des documents supplémentaires, les résidus secs des TMf présentent une moyenne de 2,597 % (m/v), avec une variation entre les échantillons allant de 1,977 à 3,035 % (n = 12). La moyenne des résidus secs des TMs était de 2,664 %, avec des valeurs allant de 1,800 à 3,315 % (n = 12). Le test t de Student appliqué aux moyennes ne montre aucune différence significative.
2.2 Analyse multivariée des données
L’analyse UHPLC-HRMS des 24 échantillons de TMf et de TMs d’A. montana et le traitement des données avec MSDial ont permis de créer une liste de 924 caractéristiques de pics. Une analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée comme analyse exploratoire des données afin de fournir une vue d’ensemble non supervisée des empreintes chromatographiques (figure 1).
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La représentation de l’ACP selon les deux premières composantes rend compte de 60,5 % de la variance totale des échantillons (2,2 % pour la composante principale 1 [CP1] et 18,3 % pour la composante principale 2 [CP2]). Plusieurs groupes distincts apparaissent sur les graphiques des scores de la CP1 et de la CP2 et, comme attendu, les échantillons de contrôle qualité, CQ, se situent près du centre de l’ACP puisqu’ils contiennent une aliquote de chaque TM. Une réponse reproductible a été observée, car toutes les répétitions indépendantes d’un même groupe étaient regroupées. Concernant la CP1, la tendance principale semble liée aux lots de production des teintures mères, provenant de fournisseurs différents. La distribution selon la CP2 est clairement due à l’état, frais ou sec, de la matière première végétale utilisée pour préparer les TM.
2.3 Analyse multivariée supervisée
Compte tenu de l’ACP non supervisée, qui montre que l’état de la matière première végétale était une force motrice de la séparation des différentes TM, un modèle d’analyse discriminante orthogonale par les moindres carrés partiels (OPLS-DA) a été élaboré en filtrant les caractéristiques selon l’état frais ou séché de la matière première (figure 2A). Des valeurs de R²Y de 0,988 et de Q² de 0,965 démontrent non seulement une bonne capacité à discriminer les TMf des TMs, mais également une très bonne capacité à prédire l’état de la matière première utilisée pour préparer une nouvelle TM. Ainsi, compte tenu du petit nombre d’échantillons analysés, le modèle peut être considéré comme robuste. La part de variance liée à la différence entre les deux classes correspond à 17,7 % (R²p(X) = 0,177). Le graphique en S des charges de l’OPLS-DA (figure 2B) représente la covariance en fonction de la corrélation des variables des composantes discriminantes. Dans cette représentation, les caractéristiques métaboliques les plus significatives sont éloignées du centre du graphique. Des valeurs seuils de p(corr) > |0,6| et p > |0,05| ont été utilisées pour sélectionner les métabolites qui influencent le plus les différences entre TMf et TMs. Avec les valeurs seuils choisies pour l’analyse du graphique en S de l’OPLS-DA, 15 couples Rt-m/z au total ont été détectés comme étant accrus dans l’une ou l’autre TM.
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Une seconde approche par OPLS-DA (données non présentées) a été menée avec un seuil plus élevé afin de ne sélectionner sur les chromatogrammes que les composés les plus ionisés en modes ions négatifs et positifs. L’objectif était de déterminer le rôle des composés les plus intenses des chromatogrammes LC-MS capables de discriminer les TMf des TMs. Cependant, pour le modèle développé, une valeur de R²(Y) de 0,745 et une valeur de Q² de 0,43, avec R²(Y) >> Q², indiquent que cette analyse supervisée distingue difficilement les matières premières fraîches des matières premières séchées. Néanmoins, l’application d’un seuil plus élevé a abouti à 71 caractéristiques, au lieu de 924, et a mis en évidence deux composés supplémentaires à m/z 197 (ion négatif) et 251 (ion positif) jouant un rôle dans la discrimination des échantillons. Dans l’analyse globale (modèle à 924 pics), ces deux caractéristiques ont moins d’influence et se situent dans la partie centrale du graphique en S (figure 2B). Malgré cette observation, nous avons estimé qu’il serait intéressant d’ajouter ces 2 caractéristiques aux 15 composés précédents, ce qui conduit à 17 marqueurs distinctifs entre les TMf et les TMs qu’il convient désormais d’identifier putativement. Tous les composés distinctifs sont récapitulés dans le tableau 1.
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2.4 Déréplication des composés discriminants
Afin d’annoter les composés discriminants, chaque ion moléculaire a été dérépliqué « manuellement » — c’est-à-dire sans aucun traitement automatisé de la formule moléculaire à l’aide de bases de données — au moyen de la MS haute résolution, de la fragmentation MS/MS, de l’analyse du spectre UV, de la chimiotaxonomie et de la littérature.
L’examen des produits enrichis dans les TMf (tableau 1) montre clairement qu’ils appartiennent à différents groupes chimiques. Cela explique pourquoi les ions moléculaires distinctifs détectés par OPLS-DA relèvent des deux polarités et sont respectivement de type [M+H]⁺ et [M−H]⁻ pour la détection ESI-MS en modes ions positifs et négatifs. La colonne « facteur » indique le rapport entre l’intensité d’un ion moléculaire présent dans les lots de TMf et celle du même ion moléculaire dans les lots de TMs. Ce rapport va de 1,3 pour un dérivé du thymol à 3,1 pour la 4-hydroxy-8-sphingénine.
Concernant l’annotation de l’acide quinique (AQ), de l’acide fumarique et des acides 1,5-dicaféoylquinique et 3,5-dicaféoylquinique (DCQA), ceux-ci ont déjà été décrits chez A. montana et leurs fragmentations MS/MS étayent les structures proposées. Pour distinguer les 6 régioisomères de DCQA (1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 3,4 ; 3,5 ou 4,5) identifiés chez A. montana, Lin et Harnly ont établi une méthode fondée sur leur ordre d’élution dans diverses conditions de LC. En outre, Clifford et ses collègues ont élaboré des solutions pour discriminer les isomères de dérivés de l’AQ sur la base de l’intensité des fragments détectés par ESI-MSⁿ en mode ions négatifs. Ainsi, en combinant les ordres d’élution et les profils de fragmentation des ions parents à m/z 515, les deux isomères de DCQA dont la teneur était accrue dans les TMf ont été distingués sans ambiguïté et annotés comme 1,5-DCQA et 3,5-DCQA (figure S2).
Le pic à Rt 31,9 min a aisément été annoté comme caféate d’éthyle d’après sa formule moléculaire, son spectre UV caractéristique et son profil de fragmentation (figure S3). L’ester éthylique de l’acide caféique a été décrit chez plusieurs espèces d’Asteraceae, comme l’ont rapporté De Athayde et ses collègues dans un article récent, mais il n’a pas été identifié dans une teinture mère préparée à partir d’A. montana.
L’ion moléculaire positif à m/z 316, élué à Rt 50,89 min et plus de 3 fois plus abondant dans les TMf que dans les TMs, correspond à un composé de formule moléculaire C₁₈H₃₇O₃N. Cette formule renvoie à 39 occurrences dans la base de données Dictionary of Natural Products (DNP). Elles correspondent toutes à des chaînes alkyles C18 aminées trihydroxylées, également appelées bases sphingolipidiques à longue chaîne et, plus précisément, phytosphingosines lorsqu’elles sont présentes chez les plantes. La structure proposée, la 4-hydroxy-8-sphingénine, est étayée par des considérations chimiotaxonomiques, car les sphingamines C18 di- ou tri-OH constituent des squelettes courants chez les plantes ; lorsqu’une double liaison est présente dans la structure, elle se situe en C-4 et/ou C-8, avec une prédominance en C-8 pour les dérivés tri-OH. Le spectre MS/MS représenté à la figure S4 confirme la présence de 3 groupes hydroxyle. La double liaison peut se présenter sous la forme d’un isomère (E) ou (Z), et les configurations en C-2, C-3 et C-4 sont invariantes — toutes les bases sphingoïdes trihydroxylées possèdent une configuration D-ribo.
Le composé à Rt 37,07 min a été putativement identifié comme un dérivé du thymol sur la base de deux arguments principaux : son profil de fragmentation, illustré à la figure 3, et le fait qu’il s’agit du dérivé 10-désacétylé du 10-acétoxy-8,9-époxy-thymolisobutyrate, précédemment isolé dans une teinture préparée à partir de capitules frais d’A. montana. Il convient de noter que divers dérivés du thymol ont été signalés chez les Asteraceae et dans les racines d’A. montana, mais que le dérivé proposé ici n’a jamais été décrit dans la nature. Par conséquent, au regard des considérations chimiotaxonomiques — 20 dérivés ont déjà été isolés dans le genre Eupatorium —, la structure suggérée est tout à fait plausible, mais l’isolement et la démonstration de la structure au moyen de techniques spectrales approfondies (RMN, DC…) seront nécessaires pour vérifier cette hypothèse.
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Le composé suivant dont la teneur est accrue dans les TMf, avec un facteur de 1,6, est élué à Rt 8,44 min et présente un ion moléculaire négatif à m/z 197,0823 [M−H]⁻ compatible avec la formule moléculaire C₁₀H₁₄O₄. Ce composé à 10 carbones suggère une structure de type thymol, comme décrit ci-dessus. Son spectre MS/MS en mode ions négatifs, représenté à la figure 4, est entièrement compatible avec un trihydroxythymol.
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Malgré la possibilité de plusieurs isomères, nous proposons pour cette annotation le 8,9,10-trihydroxythymol putatif, car ce dérivé a été isolé dans divers genres de la famille des Asteraceae.
Toutes les structures proposées pour les composés annotés des TMf sont récapitulées à la figure 5.
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La déréplication des pics dont l’intensité était accrue dans les teintures mères préparées à partir de plantes entières séchées d’A. montana (TMs) a conduit à l’annotation de neuf composés (tableau 1 et figure 6). En suivant l’ordre chronologique des temps de rétention, le premier pic, à Rt 1,09, présente un ion moléculaire positif à m/z 116,0704, compatible avec la formule moléculaire C₅H₉O₂N et renvoyant, a priori, à la structure de l’acide aminé proline, fréquemment rencontré dans les extraits végétaux. Cependant, les ions produits par MS/MS (figure S5) à partir de l’ion parent à m/z 116 n’étaient pas compatibles avec cette déduction, en raison d’une perte neutre importante de 32 Da conduisant au pic de base à m/z 84. Une structure putative de pyrrolidinone méthoxylée est proposée pour ce composé sur la base des fragments MS/MS (figure S5), avec l’appui de la littérature, dans laquelle un dérivé de la pyrrolidine a déjà été identifié chez A. montana.
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Les trois composants suivants répertoriés dans le tableau 1 présentent des ions pseudo-moléculaires pairs, en mode ions positifs ou négatifs, ce qui indique qu’il s’agit de composés azotés. De manière surprenante, ils paraissent particulièrement surexprimés dans les TMs, leurs facteurs allant de 104 à 577. Pour le pic à Rt 1,23 min, la formule moléculaire calculée C₁₁H₂₁O₇N ne renvoie qu’à 2 occurrences dans la base de données DNP, dont l’une est la fructose-valine (figure 6). Un examen attentif de la fragmentation MS/MS de son ion parent [M−H]⁻ est entièrement compatible avec la structure proposée, comme le montre la figure 7. En effet, en ESI-MS/MS en mode ions négatifs, ce composé suit un profil de fragmentation très classique, tel que décrit pour les hétérosides naturels et en particulier pour les flavonoïdes C-glycosylés, chez lesquels les ions produits [M−H−90]⁻ et/ou [M−H−120]⁻, formés par clivage transversal d’un cycle dans un résidu sucre, sont caractéristiques et très abondants. Selon ces considérations, la nature aminoacide de ce composé conjugué à un sucre est vérifiée, comme l’atteste un ion à m/z 116 compatible avec un motif valine, mais la structure du sucre reste à préciser. Il convient de noter que les conjugués sucre-acide aminé sont bien connus en chimie alimentaire, car ils constituent des intermédiaires importants d’une réaction de Maillard précoce. La réaction de Maillard est un terme générique désignant un vaste ensemble de réactions qui impliquent typiquement des sucres réducteurs, comme le glucose, et des groupes aminés aliphatiques de molécules biologiques. Une cascade réactionnelle complexe est initiée par la formation d’une base de Schiff — une glycosylamine — entre un sucre réducteur et un acide aminé et/ou les acides aminés de peptides ou de protéines. En présence d’un catalyseur nucléophile, une glycosylamine dérivée d’un aldose peut se réarranger en une 1-amino-1-désoxy-2-cétose plus stable ; une telle réaction est appelée réarrangement d’Amadori et conduit à un produit de réarrangement d’Amadori (PRA) qui dépend de l’acide aminé impliqué dans la réaction. Lorsque la glycosylamine est dérivée d’un sucre cétose, elle peut se réarranger en un 2-amino-2-désoxyaldose, également appelé produit de réarrangement de Heyns (PRH). La dégradation successive des PRA ou des PRH produit des composés carbocycliques et hétérocycliques volatils, des oligomères et des polymères, conférant ainsi diverses saveurs et des couleurs allant du jaunâtre au brun aux produits alimentaires. Concernant la déréplication de ces produits de réarrangement, il convient de noter que, pour un même acide aminé impliqué dans la réaction de Maillard, les produits de réarrangement — c’est-à-dire la base de Schiff, le PRA et le PRH — sont des isomères, comme le montre la figure S6. Il faut donc déterminer quel type de produit est généré dans la teinture mère d’arnica préparée à partir de la plante entière séchée.
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Heureusement, l’ESI-MS/MS en mode d’ionisation positive des glycoconjugués d’acides aminés a fait l’objet d’études approfondies. Les ions produits diagnostiques dérivés de l’ion parent [M+H]⁺ peuvent donc être utilisés pour distinguer les trois types de produits. La combinaison des données publiées dans la littérature a révélé que l’ion [acide aminé−H+CH₂]⁺, bien que faible — moins de 10 % d’intensité relative —, est caractéristique des composés d’Amadori. La présence de cet ion dans le spectre MS/MS de l’ion protoné positif du glycoconjugué putatif de la valine à m/z 280 (figure S7) plaide de facto en faveur d’un conjugué fructose-valine, c’est-à-dire d’Amadori. Ce motif fructose est représenté à la figure 6 sous sa forme β-pyranose, car celle-ci a été identifiée comme prédominante en solution et à pH 7 ; toutefois, des structures acycliques et α- et/ou β-furanose sont présentes dans des équilibres tautomériques et en proportions variables selon le pH. À la suite de ces observations, un deuxième produit de réarrangement d’Amadori, la fructose-leucine ou la fructose-isoleucine — les deux isomères étant possibles —, a été annoté à Tr 1,35 min, car ses fragments MS² sont identiques à ceux de la fructose-valine, avec toutefois un décalage de 14 Da (tableau 1 et figure S8). Comme la valine-fructose, l’(iso)leucine-fructose est un PRA fréquemment rencontré chez les plantes. En revanche, un troisième dérivé, annoté comme PRA et plus de 570 fois plus abondant dans les TMs, n’a jamais été décrit auparavant. Son pic à Rt 1,25 min possède une formule moléculaire C₁₁H₁₇O₈N et un profil de fragmentation MS/MS en mode ions négatifs très proche de celui de la leucine-fructose (voir figure S8 dans les documents supplémentaires). Son spectre MS² en mode ions positifs, obtenu à partir de l’ion parent [M+H−H₂O]⁺ à m/z 274 (tableau 1), présente l’ion diagnostique [acide aminé−H+CH₂]⁺ à m/z 142, ce qui suggère un dérivé PRA. On peut donc en déduire que la formule moléculaire de l’acide aminé correspondant est C₅H₇NO₃. Dans la base de données DNP, cette formule ne renvoie qu’à deux occurrences présentant une structure d’acide aminé ; celles-ci correspondent à deux dérivés ou isomères oxydés de la proline — oxoprolines ou hydroxydéhydroproline. Nous proposons pour ce PRA putatif une structure de 4-oxoproline (figure 6), mais l’isolement et l’identification structurale complète au moyen de techniques spectroscopiques approfondies seront nécessaires pour identifier pleinement ce nouveau produit de réarrangement d’Amadori.
Les cinq derniers ions enrichis dans les TMs ont été faciles à annoter, car ils avaient déjà été identifiés dans les fleurs d’A. montana. Ils ont tous été provisoirement assignés à des dérivés de l’acide dicaféoylquinique (figure 6), substitués par un motif méthoxyoxaloyle — les quatre régioisomères à m/z 601, [M−H]⁻ — ou par deux motifs méthoxyoxaloyle — m/z 687, [M−H]⁻. Ce dernier composé ne possède pas d’isomère, car le chromatogramme de l’ion extrait à m/z 687 ne montre qu’un seul pic (figure S9). Il a produit le pic de base MS/MS à m/z 601 (tableau 1) en raison de la perte d’un résidu méthoxyoxaloyle (−86), ce qui suggère que l’un des deux résidus d’acide méthoxyoxalique se trouve en position C-1 du motif acide quinique, comme l’ont proposé Jaiswal et Kuhnert, qui ont étudié en détail par ESI-MSⁿ en mode ions négatifs les dérivés de l’acide quinique présents chez A. montana. Sur la base de leurs données, nous proposons ici le même isomère, l’acide 3,5-dicaféoyl-1,4-diméthoxyoxaloylquinique, mais il convient de souligner que ce composé n’a été identifié que par LC-MS et que Lin et Harnly ont proposé un autre régioisomère, un dérivé 1,5-dicaféoyl-3,4-diméthoxyoxaloyle. Il importe également de noter qu’en étudiant le spectre MS/MS de l’ion à m/z 687, nous avons observé — comme le montrent le tableau 1 et la figure S10 — des fragments inhabituels liés à la présence des motifs méthoxyoxaloyle. Il s’agit de la perte de deux CO₂ successifs [m/z 643 (−44) et 599 (−2 × 44)] à partir de l’ion pseudo-moléculaire à m/z 687. Ces pertes expliquent les ions diagnostiques relativement abondants à m/z 437 et 275, interprétés respectivement comme les ions [M−H−2CO₂−caféoyle]⁻ et [M−H−2CO₂−2 caféoyles]⁻. Nous suggérons que cette décarboxylation se produit sous la forme d’un résidu méthoxyoxaloyle impliquant un réarrangement conduisant à un nouveau résidu acétyle, comme illustré pour le fragment [M−H−2CO₂−caféoyle]⁻ à la figure S10. À notre connaissance, c’est la première fois que ce type de « substitution » d’un ester par un autre est décrit dans des fragmentations MS² ; une analyse plus poussée, par exemple par MSⁿ, serait intéressante pour confirmer ou réfuter cette observation. Les quatre régioisomères à m/z 601 étaient correctement séparés (~25–30 min), comme l’illustre le chromatogramme de l’ion extrait (figure S11). Ces isomères ont été provisoirement assignés à des acides dicaféoyl-méthoxyoxaloylquiniques (DCMOQA), d’après leurs ions produits MS/MS caractéristiques (tableau 1 et figure S11). Les quatre composés perdent un motif méthoxyoxaloyle, conduisant à m/z 515 avec des abondances relatives différentes, et présentent le même pic de base à m/z 395 (−44−162 = −162), correspondant aux pertes neutres de molécules de CO₂ et de caféoyle. Selon Jaiswal et Kuhnert, il est possible de distinguer les quatre régioisomères puisque les spectres MS/MS correspondants produisent des pics secondaires d’abondances relatives différentes, comme observé ci-dessus pour les ions à m/z 515. D’après ces observations et les travaux de Jaiswal et Kuhnert, ainsi que ceux antérieurs de Clifford et ses collègues, un fragment élevé à m/z 515 associé à un signal élevé à m/z 439 indique le 1,5-DC-3-MOQA ; un signal élevé à m/z 515 et faible à m/z 439 indique le 1-MO-4,5-DCQA ; et de faibles signaux à m/z 515 ont été observés pour le 1,3-DC-4-MOQA et le 3,5-DC-4-MOQA. La distinction entre ces deux derniers régioisomères peut être établie par les abondances relatives des ions à m/z 439, plus importantes pour le 3,5-DC-4-MOQA que pour le 1,3-DC-4-MOQA. Ces déductions concordaient avec les résultats obtenus par Lin et Harnly concernant l’ordre d’élution de ces dérivés en chromatographie en phase inverse et leur abondance chez A. montana, où le 1,3-DC-4-MOQA présente la concentration la plus élevée (voir figure S9).
3 Discussion
Cette étude a examiné les différences de composition phytochimique entre des teintures mères homéopathiques préparées à partir de plantes entières fraîches ou séchées d’A. montana, au moyen d’une approche métabolomique multiplexée fondée sur la LC-MS. L’analyse statistique multivariée a révélé des différences significatives entre les teintures mères « fraîches » et « sèches » et nous a permis de mettre en évidence les caractéristiques distinctives les plus manifestes. Il est remarquable que les lactones sesquiterpéniques n’aient pas été affectées par le procédé de séchage. Il s’agit d’un résultat important, car elles sont considérées comme les principaux métabolites responsables des activités biologiques de l’arnica. Il en va de même pour les flavonoïdes. Cette observation est contraire aux résultats obtenus par Asadi et ses collègues, qui ont constaté une augmentation de la teneur en flavonoïdes des capitules d’Arnica chamissonis après séchage à l’étuve à 40 °C. Afin d’explorer les raisons de cette différence entre les résultats, une analyse multivariée ciblant les flavonoïdes (graphique en S) est présentée à la figure S12 des informations supplémentaires. Elle montre que les flavonoïdes sont légèrement plus concentrés dans les TMs, mais qu’ils n’ont pas été détectés comme composés discriminants avec les paramètres seuils définis. L’annotation, par raisonnement humain — les annotations in silico se sont révélées particulièrement décevantes (données non présentées) —, des métabolites discriminants a montré que les esters de l’acide caféoylquinique et les composés nouvellement décrits chez A. montana, tels que l’hydroxysphingénine et les dérivés du thymol, étaient plus abondants dans les TM préparées à partir de la plante entière fraîche, tandis que les esters d’acide dicaféoylquinique méthoxyoxaloylés (MODCQA) et, en particulier, les produits de réarrangement d’Amadori étaient plus abondants après le procédé de séchage.
Nous ne sommes pas en mesure de proposer une explication à l’augmentation des MODCQA dans les TMs, mais la formation de glycoconjugués d’acides aminés au cours du séchage ou de la cuisson a été étudiée en profondeur dans le contexte alimentaire il y a déjà quelque temps. Leur présence dans les drogues végétales est beaucoup moins documentée. On peut toutefois citer les racines de ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer), traditionnellement transformées pour produire le ginseng blanc — dont les racines sont séchées à l’air après épluchage — et le ginseng rouge — dont les racines sont étuvées à 98–100 °C sans épluchage. On considère que l’étuvage renforce les activités biologiques du ginseng rouge et que ce renforcement peut être lié aux PRA, dont les activités antioxydantes ont été démontrées. D’autres activités biologiques ont été rapportées pour les produits de la réaction de Maillard (PRM) en général — depuis les intermédiaires précoces, tels que les PRA ou les PRH, ou les groupes aminés glyqués de peptides/protéines, jusqu’aux produits finaux comme les mélanoïdines ou les dérivés volatils, d’origine aussi bien végétale qu’animale. Parmi les propriétés notables figurent des activités antibactériennes, des effets anti-inflammatoires, des propriétés bifidogènes et des activités inhibitrices de l’enzyme de conversion de l’angiotensine. À l’inverse, plusieurs aspects négatifs des PRM ne peuvent être ignorés. Par exemple, le brunissement non enzymatique — produits finaux de la réaction de Maillard — est un facteur limitant susceptible de réduire la durée de conservation de certains produits alimentaires, comme le lait humain. Chez l’être humain, la réaction de Maillard se produit également entre les groupes aminés libres des protéines et les sucres réducteurs, ce qui conduit à la production de produits finaux de glycation avancée (AGE), associés à la prévalence accrue de plusieurs maladies telles que le diabète, l’athérosclérose ou les maladies neurodégénératives. Les aspects bénéfiques et nocifs des PRM semblent donc coexister, et des recherches supplémentaires sur la stabilité systématique et la toxicologie associées aux PRA et aux PRM sont nécessaires. Il paraît ainsi important de maîtriser les conditions de transformation et de limiter la progression de la réaction de Maillard jusqu’à ces stades avancés. La détection de produits de stade précoce, tels que les PRA, par ESI-MS/MS en mode ions négatifs et/ou positifs, comme décrit dans ce travail, peut contribuer au suivi de la progression de la réaction de Maillard ainsi qu’à l’amélioration du contrôle qualité et de la normalisation des médicaments à base de plantes en général, et de ceux contenant A. montana en particulier.
Un autre type de métabolites d’intérêt mis en évidence par l’analyse statistique multivariée concernait les dérivés du thymol. Deux composés dont la teneur était accrue dans les TMf ont été provisoirement identifiés : le trihydroxythymol, nouvellement décrit chez A. montana, et un nouveau produit naturel putatif, le 8,9-époxy-10-hydroxy-thymolisobutyrate. Le thymol, ses dérivés et les extraits qui les contiennent sont bien connus et utilisés, entre autres, pour leurs propriétés antibactériennes et anti-biofilm. Il s’agit typiquement de métabolites rencontrés dans les huiles essentielles — en particulier chez les espèces du genre Thymus — et, pour A. montana, Weremczuk-Jezyna et ses collègues ont indiqué que ces composés sont présents dans les huiles essentielles obtenues à partir des racines et des racines chevelues. Fait intéressant, la présence de composés de type thymol dans la TM d’A. montana peut contribuer indirectement aux propriétés cicatrisantes de l’arnica, car ils entrent dans la composition de médicaments topiques en raison de leurs propriétés antiseptiques et antiphlogistiques. Cela explique l’intérêt de la recherche pour l’utilisation de la TM d’A. montana dans des préparations topiques, puisque celles-ci sont officiellement préparées — selon les Pharmacopées européenne et française — à partir de la plante entière fraîche, ce qui inclut donc les racines. Il serait toutefois intéressant d’étudier la teneur en dérivés du thymol des capitules d’arnica afin de confirmer cette hypothèse, mais le rendement en huile essentielle obtenue à partir des fleurs est environ vingt fois inférieur à celui des racines. Si les plantes sont dépourvues de capitules, les dérivés du thymol pourraient constituer des marqueurs de qualité intéressants pour distinguer les deux matières premières pouvant servir à produire des teintures : les capitules séchés utilisés pour les phytomédicaments ou la plante entière fraîche utilisée en homéopathie.
Un dernier composé nouvellement décrit chez A. montana et enrichi dans les TMf est la 4-hydroxy-8-sphingénine putative, couramment appelée déhydrophytosphingosine. Sperling et Heinz ont passé en revue les fonctions des sphingolipides chez les plantes et ont signalé leur importance dans la signalisation cellulaire, la stabilité membranaire, la réponse au stress abiotique, la mort cellulaire programmée et les interactions plante-pathogène. Les propriétés biologiques de la phytosphingosine, analogue saturé de la déhydrophytosphingosine, sont bien documentées, car la phytosphingosine est un ingrédient cosmétique possédant plusieurs applications potentielles, notamment en dermatologie. Par exemple, la phytosphingosine pourrait agir comme inhibiteur efficace de la mélanogenèse dans les mélanocytes et être utilisée comme produit éclaircissant pour la peau. La phytosphingosine est également présente dans la couche cornée de la peau, où elle contribue à la fonction de barrière cutanée et exerce des activités anti-inflammatoires et antimicrobiennes. Il a été montré qu’un dérivé acétylé de la phytosphingosine exerce une action inhibitrice sur l’angiogenèse en inhibant l’activation de la protéine kinase activée par les mitogènes et l’augmentation du calcium intracellulaire, affectant ainsi le processus de cicatrisation des plaies. La phosphorylation de la phytosphingosine exerce également une influence sur les activités biologiques de fibroblastes dermiques humains in vitro en favorisant l’activité du facteur de croissance épidermique et en atténuant l’arrêt de la croissance cellulaire induit par H₂O₂. La déhydrophytosphingosine est donc un autre composé nouvellement annoté dans l’arnica qui pourrait contribuer aux activités de l’arnica sur la peau lésée.
4 Matériels et méthodes
4.1 Préparation des échantillons
Les plantes entières fleuries d’A. montana (320–786 kg selon le fournisseur) ont été acquises auprès de six fournisseurs français différents (EARL du Patuet, Jourd’hui, Herboristerie de la Chartreuse, Horizon Nature, Sicarappam, SICA Vivaplantes). Les plantes ont été récoltées manuellement durant l’été 2020 dans cinq zones géographiques différentes — 4 zones en France : massif du Morvan, Massif central (2 échantillons), Ardèche, Auvergne ; et 1 zone en Allemagne : Hesse —, puis contrôlées par les Laboratoires Boiron (Messimy, France) au moyen d’une identification botanique macroscopique et microscopique et enregistrées sous les numéros de spécimens de référence 20066019, 20066025, 20066052, 20066110, 20076001 et 20066041, respectivement pour l’EARL du Patuet, Jourd’hui, l’Herboristerie de la Chartreuse, Horizon Nature, Sicarappam et SICA Vivaplantes. Il convient de noter qu’A. montana figure sur la liste des espèces menacées de l’Union internationale pour la conservation de la nature (UICN), et que sa récolte est réglementée et limitée à plusieurs zones en France et en Allemagne.
Les teintures mères ont été produites par les Laboratoires Boiron. À cette fin, chaque lot indépendant de plantes d’A. montana provenant des différentes zones géographiques a été divisé en deux parties. Une partie a été utilisée comme matière première fraîche, conformément à la monographie 2371 de la Pharmacopée européenne (Méthodes de préparation des souches homéopathiques et déconcentration), méthode 1.1.10, tandis que l’autre partie a été séchée par l’entreprise « Herboristerie de la Chartreuse et du Grésivaudan » (France) dans un séchoir multicouche (type AMB-Rousset de 30 m³) avec circulation d’air pendant 2 h à 65 °C. Les étapes de fabrication de la méthode 1.1.10 prescrites dans la monographie 2371 ont été suivies. Les plantes fraîches et séchées ont été mises à macérer en double pendant 21 jours dans une solution finale d’éthanol à 45 % (v/v) (DER 1:10), puis filtrées afin d’obtenir les teintures mères. Celles-ci ont été aliquotées et conservées à +4 °C dans des flacons opaques de 30 mL, en double, avant utilisation. Ce procédé nous a permis d’obtenir les lots de teintures correspondants à partir des plantes fraîches et séchées. Au total, 24 échantillons ont été analysés — 12 TMf (6 origines différentes extraites en double) et 12 TMs — avec un mélange de chaque teinture analysé en triplicat (échantillons CQ). Les chromatogrammes LC-MS des échantillons séchés et frais représentant les positions des composés discriminants sont présentés à la figure S13.
4.2 Détermination des résidus secs
Cinq mL de teinture mère ont été pesés dans un flacon séché et préalablement pesé, puis les échantillons ont été séchés sous flux d’azote pendant 24 h. Les résidus secs ont été déterminés en double pour chaque échantillon et le résultat est directement exprimé en pourcentage (m/v) de matière.
4.3 Analyse par chromatographie liquide à ultra-haute performance-Orbitrap
Les teintures mères ont été séparées au moyen d’un système UHPLC Dionex™ Ultimate 3000 comprenant une pompe Ultimate 3000 RS, un passeur automatique d’échantillons Ultimate 3000 RS et un compartiment à colonne Ultimate 3000. Les analytes ont été détectés à l’aide d’un DAD Ultimate 3000 pour la détection UV (200 à 400 nm) et d’un LTQ Orbitrap XL pour la détection de masse (Thermo Scientific™, Hemel Hempstead, Royaume-Uni). La détection de masse a été réalisée au moyen d’une source d’ionisation par électrospray (ESI), en modes d’ionisation positive (IP) et négative (IN), à un pouvoir de résolution de 15 000 — largeur totale à mi-hauteur (FWHM) — à m/z 400. La plage de balayage de masse était de m/z 100–2 000 Da, la température du capillaire était de 300 °C et la tension de pulvérisation d’ionisation de 3,5 kV. Chaque balayage complet était suivi d’une analyse MS/MS dépendante des données sur les quatre pics les plus intenses, au moyen d’une dissociation induite par collision (CID) par paliers à 35 unités arbitraires (largeur d’isolement de 1 m/z, Q d’activation de 0,25).
Divers essais ont été menés afin de trouver les meilleures conditions de séparation et de détection MS du plus grand nombre de composés. Ainsi, la séparation des composés les plus polaires à l’aide d’une colonne de chromatographie liquide à interactions hydrophiles (HILIC) n’a pas donné de résultats satisfaisants en raison de pics très larges. De même, les essais en phase inverse utilisant des mélanges acétonitrile/eau acidifiés n’ont pas permis de bonnes séparations. Pour la détection MS, la fonction de réglage automatique du spectromètre a été utilisée afin d’optimiser les paramètres, en sélectionnant l’ion à m/z 515 — dérivé de l’acide quinique — en mode ions négatifs et l’ion à m/z 333 — ester d’une lactone sesquiterpénique — en mode ions positifs. Une élution par gradient a donc été réalisée sur une colonne C18 Acquity (150 mm, d.i. 2,1 mm, 1,7 µm, Waters, MA, États-Unis) munie d’une précolonne, à 40 °C dans le compartiment à colonne. Un gradient d’élution composé du solvant A — acide formique à 0,1 % dans l’eau — et du solvant B — méthanol — a été appliqué comme suit : 0–3 min, 10 % B ; 3–9 min, 10–15 % B ; 9–30 min, 15–35 % ; 30–45 min, 35–60 % B ; 45–50 min, 60–80 % B ; 50–55 min, 80 % B ; 55–58 min, 80–10 % B. Le volume d’échantillon injecté a été fixé à 3 µL et le débit d’élution à 0,4 mL/min.
4.4 Traitement des données
Les données brutes de l’UHPLC-HRMS en modes d’ionisation positive et négative ont été converties en fichier .abf (Reifycs Abf Converter, Tokyo, Japon), puis traitées avec MS-DIAL 4.48. Le signal a été extrait entre 50 et 2 000 Da et entre 0 et 60 min. En mode centroïde, la variation de masse a été fixée à 0,01 Da pour la MS¹ et à 0,025 Da pour la MS². Les pics ont été alignés sur le contrôle qualité (CQ), avec une tolérance de temps de rétention de 0,05 min et une tolérance de masse de 0,015 Da. Deux seuils de détection ont été utilisés, avec une largeur de tranche de masse de 0,1 Da : le premier, à 7 × 10⁴, nous a permis de récupérer 924 pics ; le second, à 1,2 × 10⁷, nous a permis d’en récupérer 71. Les adduits et les complexes ont été identifiés afin de les exclure de la liste finale des pics.
Les listes de pics ont été concaténées et nettoyées au moyen du programme MS-CleanR sur l’interface Shiny de RStudio 4.0.3. Le rapport minimal par rapport au blanc a été fixé à 0,8, avec une différence de masse maximale de 0,01 Da et une tolérance maximale de temps de rétention de 0,025 min. Une corrélation de Pearson minimale de 0,8 a été utilisée pour le regroupement, avec une valeur de p maximale de 0,05. La liste finale des pics est directement exportée au format CSV (valeurs séparées par des virgules) avant l’analyse multivariée des données.
4.5 Analyse statistique
Pour l’analyse multivariée des données, les fichiers CSV ont été directement importés dans SIMCA®® 14.0 (Sartorius Stedim Biotech, Umeå, Suède). Les données ont été mises à l’échelle selon une variance unitaire pour l’analyse en composantes principales (ACP). Le jeu de données a été centré et mis à l’échelle de Pareto afin de construire un modèle supervisé par projection orthogonale sur les structures latentes-analyse discriminante (OPLS-DA), les classes fraîche (F) et séchée (S) étant utilisées comme entrées Y. La qualité du modèle OPLS-DA a été évaluée au moyen du paramètre de qualité d’ajustement (R²) et du paramètre de capacité prédictive (Q²).
Pour les résidus secs, le test t de Student a été utilisé pour les comparaisons statistiques. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
La valeur du facteur représente l’enrichissement en métabolites d’un extrait par rapport à l’autre. Cette valeur a été déterminée pour chaque caractéristique par le rapport entre l’aire moyenne — chromatogrammes du pic de base MS — dans la TM séchée et celle dans la TM fraîche. Les résultats sont ici toujours exprimés par une valeur supérieure à 1, représentant ainsi un enrichissement des métabolites dans la TM sélectionnée.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants au département de recherche des Laboratoires Boiron, qui a soutenu financièrement ce projet et, en particulier, a financé une bourse d’un an pour S.D.
Note de l’éditeur
MDPI reste neutre à l’égard des revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.
Documents supplémentaires
Les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées à l’adresse : https://www.mdpi.com/article/10.3390/molecules27092737/s1, figure S1 : rapport moyen des résidus secs (en mg·mL⁻¹) obtenus à partir des teintures mères. TMf : barre verte (n = 12) et barre jaune pour les TMs (n = 12) ; figure S2 : chromatogramme de l’ion sélectionné (m/z 515, ESI négative) de la TMf et spectres MS/MS des 6 isomères du DCQA (m/z 515), montrant des différences dans les intensités relatives de certains ions produits. Les 1,5- et 3,5-DCQA sont coélués à Tr 25,6 min ; figure S3 : spectres UV et MS complets en mode ions négatifs ESI du pic à 32,8 min (TMf) et spectre MS/MS de l’ion à m/z 207, compatibles avec la structure du caféate d’éthyle, comme le montrent les structures proposées des fragments ; figure S4 : spectre MS complet en mode ions positifs ESI du pic à Rt 50,8 min et spectre MS/MS de l’ion à m/z 316, correspondant à la trihydroxysphingénine et montrant les trois pertes successives de H₂O ; figure S5 : spectre MS complet en mode ions positifs ESI du pic à Rt 1,09 min et spectre MS/MS de l’ion à m/z 116, annoté comme dérivé éther méthylique de pyrrolidinone, avec les structures proposées des fragments ; figure S6 : structures de la base de Schiff de la valine et des produits de réarrangement d’Amadori et de Heyns ; figure S7 : spectre MS/MS de l’ion moléculaire positif protoné du conjugué valine-fructose à m/z 280, montrant l’ion [acide aminé−H+CH₂]⁺ caractéristique des produits de réarrangement d’Amadori ; figure S8 : de haut en bas, spectres MS/MS en mode ions négatifs des conjugués valine-, (iso)leucine- et oxyproline-fructose, avec des ions diagnostiques montrant les similitudes entre les profils de fragmentation des trois dérivés ; figure S9 : chromatogrammes des ions extraits (EIC) des ions négatifs à m/z 601 et m/z 687 ; figure S10 : spectre MS/MS de l’ion [M−H]⁻ à m/z 687 — acide 3,5-dicaféoyl-1,4-diméthoxyoxaloylquinique putatif — avec les structures suggérées pour les principaux ions produits ; figure S11 : spectres MS/MS des ions [M−H]⁻ des 4 régioisomères à m/z 601. De haut en bas : ions à m/z 601 à Rt 25,4, 25,8, 28,5 et 30,6 min, correspondant respectivement aux 1-MO-4,5-DCQA, 1,5-DC-3-MOQA, 3,5-DC-4-MOQA et 1,3-DC-4-MOQA ; figure S12 : analyse multivariée — graphique en S de l’OPLS-DA — représentant en rouge les flavonoïdes annotés à l’aide de MS-Finder et montrant qu’ils sont plus concentrés dans les TMs que dans les TMf, mais en dessous du seuil fixé (p > |0,05|) ; figure S13 : chromatogrammes LC-MS du pic de base en modes ions positifs et négatifs des teintures mères obtenues à partir d’arnica séchée (TMs) et de plante entière fraîche (TMf), montrant les composés discriminants.
Cliquez ici pour accéder au fichier de données supplémentaire.
Contributions des auteurs
Conceptualisation, P.T., N.B. et N.F. ; méthodologie, S.D. ; validation, N.F., A.G. et P.T. ; analyse formelle, S.D. ; investigation, S.D. et N.F. ; ressources, N.B. et P.T. ; conservation des données, S.D. et P.T. ; rédaction — préparation de la version initiale, S.D., A.G. et N.F. ; rédaction — révision et correction, N.F. et A.G. ; visualisation, S.D., A.G. et N.F. ; supervision, N.F. ; administration du projet, P.T. ; acquisition du financement, N.B. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Financement
Cette recherche n’a reçu aucun financement externe.
Déclaration du comité d’examen institutionnel
Sans objet.
Déclaration de consentement éclairé
Sans objet.
Déclaration de disponibilité des données
Sans objet.
Conflits d’intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.