Nouvelles données sur les caractéristiques phytochimiques et les propriétés biologiques de l’écorce de tige de Alnus glutinosa
Référence : Plants (Basel) 2022. — PMID 36235365 · DOI 10.3390/plants11192499 Type : etude in vitro · Plante : Aulne glutineux · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Alnus glutinosa (à savoir l’aulne noir ou aulne d’Europe) est un arbre de la famille des Betulaceae largement répandu en Europe, en Asie du Sud-Est, dans les montagnes du Caucase et en Sibérie occidentale. Son écorce est traditionnellement utilisée à des fins médicinales comme astringent, cathartique, fébrifuge, émétique, hémostatique et tonique, ce qui suggère qu’elle pourrait contenir des composés bioactifs utiles pour lutter contre l’inflammation. Le but de cette étude était d’étudier le profil phytochimique de l’extrait d’écorce de tige de A. glutinosa (AGE) par analyse LC-DAD-ESI-MS/MS et de valider certaines activités biologiques telles que les propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-angiogéniques par des modèles in vitro et in vivo (membranes chorio-allantoïdiennes de poussin et embryons de poisson-zèbre), qui peuvent justifier son utilisation contre les maladies à base inflammatoire. L’AGE a montré une teneur élevée en phénols totaux exprimée en équivalents d’acide gallique (0,71 g GAE/g d’AGE). Les diaryheptanoïdes ont été identifiés comme les composés prédominants (0,65 g/g d’AGE) avec l’orégonine, qui à elle seule constitue 74,67 % de l’AGE. L’AGE a montré une activité antioxydante (IC50 0,15–12,21 µg/mL) et anti-inflammatoire (IC50 5,47–12,97 µg/mL) forte et dépendante de la concentration. De plus, il a montré une activité anti-angiogénique prometteuse, inhibant à la fois la croissance des vaisseaux (IC50 23,39 µg/œuf) et la libération d’une enzyme phosphatase alcaline endogène (IC50 44,24 µg/embryon). En conclusion, l’AGE est une source prometteuse de composés antioxydants, anti-inflammatoires et angio-modulateurs.
1. Introduction
Le genre Alnus (Betulaceae) comprend plus de 40 espèces, dont beaucoup ont une longue histoire d’utilisation traditionnelle. Alnus glutinosa (L.) Gaertn, connu sous le nom d’aulne noir ou aulne d’Europe, est un arbre largement répandu en Europe et en Asie. De nombreuses études ont montré que les extraits d’écorce d’aulne noir présentent des activités antimicrobiennes, anti-inflammatoires et anticancéreuses. Cependant, outre le fait qu’il s’agit d’une matrice végétale prometteuse d’un point de vue phytothérapeutique, il ne faut pas oublier que l’écorce des arbres représente un déchet forestier, qui compte jusqu’à 12 % de la biomasse ligneuse totale. Compte tenu de cela, une étude récente s’est concentrée sur la valorisation de cette importante biomasse pour obtenir des extraits d’écorce d’aulne noir de haute qualité, à teneur élevée en phénols totaux et à forte activité antioxydante, en utilisant des techniques de chimie verte. Les investigations phytochimiques ont révélé que de nombreux composés bioactifs, notamment des acides phénoliques, des flavonoïdes, des diaryheptanoïdes, des terpénoïdes et des stéroïdes, ont été isolés de l’écorce de tige de A. glutinosa. Malgré cela, une composition chimique très différente peut être trouvée parmi les écorces d’arbres selon le lieu de croissance et les conditions pédoclimatiques.
Les diaryheptanoïdes sont des polyphénols que l’on trouve typiquement dans le genre Alnus et représentent de loin les composés bioactifs les plus prédominants, bien que, à ce jour, aucune étude phytochimique quantitative n’ait été réalisée. Ils sont constitués de deux groupes aryle joints par une chaîne heptane dans le squelette principal, avec de nombreux substituants qui peuvent influencer significativement leur activité biologique. De nombreux diaryheptanoïdes ont été signalés comme présentant une activité antioxydante, antibactérienne, antivirale et anticancéreuse. Par conséquent, la valorisation de cette biomasse représente certainement une source très importante de composés bioactifs aux propriétés prometteuses pour la santé.
Il est bien connu que, outre le déséquilibre du système de défense antioxydant physiologique et la survenue d’un événement inflammatoire aigu, qui évolue souvent vers un état inflammatoire chronique, une angiogenèse non régulée est également impliquée dans de nombreuses pathologies telles que la rétinopathie diabétique, la polyarthrite rhumatoïde et d’autres maladies à base inflammatoire, jouant également un rôle central dans la croissance tumorale et la formation de métastases. Ainsi, il existe aujourd’hui un intérêt croissant pour découvrir de nouveaux agents naturels capables de moduler ces événements à des fins préventives et thérapeutiques.
Compte tenu de cela, le but de la présente étude était de réaliser, pour la première fois, une caractérisation quali-quantitative de l’extrait d’écorce de A. glutinosa (AGE) et d’étudier ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-angiogéniques par plusieurs modèles in vitro et in vivo. De plus, cette étude a également été conçue pour étudier le rôle du diaryheptanoïde prédominant trouvé, l’orégonine, dans les activités observées.
2. Résultats
2.1. Profil phytochimique
La procédure d’extraction adoptée a permis d’obtenir un rendement d’extraction élevé (24,36 %). L’extrait sec (DE), convenablement solubilisé dans le méthanol, a d’abord été soumis à une analyse préliminaire de la teneur en phénols totaux avec le test de Folin-Ciocalteu, montrant une teneur élevée en composés phénoliques exprimée en équivalents d’acide gallique (0,71 g GAE/g DE). Ensuite, une caractérisation qualitative de l’AGE a été réalisée au moyen de la LC-DAD-ESI-MS/MS. Cette analyse a mis en évidence un profil phytochimique très intéressant [ ], montrant une très forte teneur en orégonine [ ], pic n° 2), qui à elle seule représente environ 74,50 % de l’ensemble de l’extrait. L’AGE est une source très riche en diaryheptanoïdes en général, avec 12 autres composés identifiés appartenant à la même classe et représentant environ 25,20 % de l’AGE. De plus, deux nouveaux diaryheptanoïdes ont été identifiés pour la première fois dans l’extrait d’aulne noir, l’hirsutanonol 5-O-glucoside et le coumaroyl-orégonine. Cependant, l’extrait apparaît pauvre en flavonoïdes (0,30 %). Le seul composé identifié appartenant à cette classe de composés est, en fait, un dérivé de la quercétine, la quercétine-3-sophoroside [ ], pic n° 5).
L’analyse quantitative, obtenue en exprimant la teneur en diaryheptanoïdes en équivalents d’orégonine, et la teneur en quercétine-3-sophoroside en équivalents de quercétine-3-O-glucoside, nous a permis de mettre en évidence les composés les plus abondants dans l’AGE. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes en triple (n = 3) [ ]. Selon l’analyse quantitative, l’orégonine est le composé prédominant (484,18 mg/g DE), suivie de l’hirsuténone (33,71 mg/g DE), du rubranoside B (27,21 mg/g DE), du 5(S)-1,7-di(4-hydroxyphényl)-5-O-β-D-[6-(E-3,4-diméthoxycinnamoylglucopyranosyl)] heptane-3-one (21,88 mg/g DE), du 5-O-méthylhirsutanonol (17,91 mg/g DE), du 5(S)-1-(4-hydroxyphényl)-7-(3,4-dihydroxyphényl)-5-O-β-D-[6-(3,4-diméthoxycinnamoylglucopyranosyl)] heptane-3-one (16,48 mg/g DE) et de l’hirsutanonol-5-O-glucoside (13,95 mg/g DE).
2.2. Propriétés biologiques
Dans cette étude, les propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-angiogéniques de l’AGE ont été évaluées. À cet égard, des tests in vitro basés sur différents environnements et mécanismes de réaction, ainsi que des tests in vivo sur deux des modèles les plus reconnus pour l’étude des substances angio-modulatrices, ont été réalisés.
En ce qui concerne l’activité antioxydante, six tests différents ont été réalisés visant à évaluer : (i) la capacité de l’extrait examiné à protéger de la peroxydation lipidique induite par la chaleur (test de blanchiment du β-carotène, BCB) ; (ii) l’activité de piégeage des radicaux libres contre le radical 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH) ; (iii) le pouvoir antioxydant réducteur du fer (FRAP) ; (iv) la capacité antioxydante équivalente au trolox (TEAC) ; (v) la capacité d’absorption des radicaux oxygène (test ORAC) et, enfin, (vi) l’activité chélatrice du fer (test de la ferrozine).
La figure [ ] montre les courbes cinétiques (diminution de l’absorbance en fonction du temps exprimé en minutes) de différentes concentrations d’AGE (1,25–10 µg/mL) comparées à l’étalon de référence butylhydroxytoluène (BHT, 30 µg/mL), un antioxydant synthétique bien connu pour ses propriétés inhibitrices de la peroxydation lipidique, ainsi qu’aux contrôles positif (émulsion de β-carotène avec le véhicule, c’est-à-dire le méthanol, à la place de l’échantillon) et négatif (émulsion vierge sans β-carotène). Comme on peut le voir sur la figure [ ], l’AGE présente une activité antioxydante forte et dépendante de la concentration, inhibant, de manière statistiquement significative (p < 0,001 vs BHT et CTR+), le blanchiment du β-carotène en réponse à la peroxydation de l’acide linoléique induite par la chaleur.
La figure [ ] montre les résultats des tests DPPH (a), FRAP (b), TEAC (c) et ORAC (d) exprimés en pourcentages d’inhibition (%). Bien que l’AGE présente une forte puissance antioxydante, il n’a montré aucune activité chélatrice du fer dans la plage de concentration testée (50–400 µg/mL), bien au-dessus des concentrations auxquelles l’AGE a montré une activité antioxydante prometteuse. Comme on peut le voir sur la figure [ ], l’extrait présente également dans ce cas des propriétés antioxydantes marquées et dépendantes de la concentration dans tous les tests réalisés ; en effet, un indice de corrélation linéaire calculé (R²) ≥ 0,9121 a été observé. Dans tous les cas, le comportement de l’AGE n’est pas toujours le même, et en regardant les résultats obtenus par rapport à la concentration d’AGE testée, l’ordre de puissance suivant peut être établi : ORAC > TEAC > blanchiment du β-carotène > FRAP > DPPH.
Dans la figure [ ], les barres de graphique indiquées par les lettres (e) et (f) se réfèrent à l’activité anti-inflammatoire, qui a été évaluée par deux tests in vitro différents : le test de dénaturation de l’albumine sérique bovine (BSA) et l’activité inhibitrice de la protéase. Le premier évalue la capacité de l’AGE à contrer la dénaturation des protéines induite par la chaleur, tandis que le second évalue la capacité de l’AGE à inhiber l’une des enzymes clés impliquées dans les maladies à base inflammatoire.
Dans ces deux tests, l’AGE a montré un comportement tout à fait comparable, inhibant à la fois la dénaturation de l’albumine en réponse au stress physique, et la protéase de manière dépendante de la concentration (R² ≥ 0,9244).
Compte tenu des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires prometteuses de l’AGE et compte tenu du profil phytochimique particulier de l’extrait, montrant l’orégonine comme composé prédominant, l’étape suivante consistait à évaluer quelle était la contribution de ce diaryheptanoïde aux activités trouvées. En exprimant les résultats obtenus en concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) et en calculant les limites de confiance à 95 % (C.L.) respectives, il est possible de comparer facilement les résultats obtenus avec l’AGE, l’orégonine et les étalons de référence respectifs, comme rapporté dans le tableau [ ].
L’AGE et l’orégonine ont tous deux montré des activités antioxydantes et anti-inflammatoires très prometteuses par rapport aux étalons de référence (RS). Plus précisément, le trolox pour les tests DPPH, TEAC, FRAP et ORAC, le BHT pour le blanchiment du β-carotène, et le diclofénac sodique pour les tests anti-inflammatoires ont été utilisés comme étalons de référence [ ]. Fait intéressant, aucune différence statistiquement significative par rapport au RS n’a été trouvée pour l’AGE dans les tests DPPH, TEAC, FRAP, de dénaturation de la BSA et en termes d’activité inhibitrice de la protéase, l’extrait montrant une activité comparable à celle du RS respectif. Au contraire, l’orégonine n’a montré aucune différence statistiquement significative par rapport au RS uniquement dans les tests suivants : TEAC, FRAP et activité inhibitrice de la protéase. Cependant, de manière encore plus intéressante, l’extrait et le composé pur orégonine ont tous deux montré des activités antioxydantes et anti-inflammatoires comparables, sans aucune différence statistiquement significative dans tous les tests réalisés, démontrant ainsi que l’orégonine est le principal composé responsable des activités antioxydantes et anti-inflammatoires trouvées dans la présente étude.
Compte tenu de ces preuves et sachant que certains diaryheptanoïdes se sont révélés être des agents antitumoraux prometteurs, l’activité anti-angiogénique potentielle de l’AGE et de l’orégonine à l’aide de deux modèles in vivo (membranes chorio-allantoïdiennes de poussin et embryons de poisson-zèbre) a été évaluée.
Dans le premier cas, la capacité de l’AGE et de la molécule pure orégonine à inhiber la croissance des vaisseaux sanguins de la membrane chorio-allantoïdienne (CAM) sans provoquer de toxicité a été évaluée, tandis que dans le second cas, leur capacité à contrer la libération du marqueur angiogénique phosphatase alcaline endogène (EAP) des cellules endothéliales des embryons de poisson-zèbre a été étudiée. Dans les deux cas, des étalons de référence à l’activité anti-angiogénique prouvée ont été utilisés : l’acide rétinoïque (CTR+, 1 µg/œuf) et le 2-méthoxyestradiol (CTR+, 30 µg/embryon), respectivement.
L’orégonine, ainsi que l’AGE, ont été testés à différentes concentrations, bien que dans la barre de graphique présentée dans les figures [ ] et [ ], elle n’apparaisse qu’à la concentration maximale testée (30 µg/œuf et 30 µg/embryon, respectivement), qui correspond à la quantité d’orégonine dans l’AGE à la concentration la plus élevée testée (AGE 50 µg/œuf et 50 µg/embryon, respectivement).
Comme on peut le voir sur la figure [ ], l’AGE présente des propriétés anti-angiogéniques marquées et dépendantes de la concentration (IC50, 23,39 µg/œuf, C.L. 16,78–28,15), comme on peut le déduire de l’indice de corrélation linéaire calculé (R² = 0,9988) et comme il est possible de l’observer aussi sur les images c–e [ ]. La concentration la plus élevée testée montre une activité anti-angiogénique significativement plus élevée [ ] que le CTR+ [ ]. À l’inverse, les deux concentrations les plus faibles [ ] ont montré une activité anti-angiogénique significativement plus faible (p < 0,05 et p < 0,001 pour l’AGE 25 et 12,50 µg/mL, respectivement) par rapport au CTR+ [ ]. Il est cependant intéressant de noter que, dans ce cas, l’activité de l’orégonine (IC50, 23,89 µg/œuf, C.L. 14,22–34,88) est également significativement plus élevée que le contrôle positif [ ] ; cependant, à la même concentration présente dans l’AGE 50 µg/œuf [ ], l’activité anti-angiogénique est significativement plus faible, suggérant l’implication d’autres composés bioactifs dans l’activité biologique enregistrée.
Cette hypothèse a été confirmée par le second modèle in vivo. En effet, comme on peut le voir sur la barre de graphique de la figure [ ], l’AGE inhibe la libération d’EAP par les embryons de poisson-zèbre (IC50, 44,24 µg/embryon, C.L. 37,53–55,26) de manière dépendante de la concentration (R² ≥ 0,9385), avec un comportement superposable à celui trouvé dans le modèle in vivo précédent, avec des résultats statistiquement significatifs à toutes les concentrations testées, à la fois vis-à-vis du CTR+ et de l’orégonine (IC50, 44,42 µg/embryon, C.L. 35,21–53,84). Cette dernière, également dans ce cas, ne contribue que partiellement à l’activité de l’AGE (50 µg/embryon), confirmant l’hypothèse précédemment postulée.
Enfin, il convient de noter que dans les deux modèles in vivo, aux concentrations efficaces testées, aucune toxicité n’a été trouvée, suggérant une utilisation potentiellement sûre et efficace à la fois de l’AGE et du composé pur orégonine.
3. Discussion
La méthode d’extraction adoptée dans cette étude a permis d’obtenir un extrait d’écorce de tige avec un rendement d’extraction élevé (24,36 % vs 2,45–16,41 %) et avec une teneur en phénols totaux plus élevée (environ cinq fois supérieure) que celles obtenues avec d’autres méthodes d’extraction qui utilisaient des solvants organiques purs ou des mélanges aqueux. Des résultats similaires ont été obtenus en revanche, en termes de rendement d’extraction et de phénols totaux, avec de nouvelles techniques de chimie verte, utilisant principalement de l’eau déionisée comme solvant d’extraction à hautes températures, bien que cette dernière détermine irrémédiablement une diminution des polyphénols, composés bien connus pour leur thermolabilité, donnant une plus grande importance aux terpénoïdes, stéroïdes et tanins. Par conséquent, il est important, en plus de considérer le choix le plus vert, d’identifier également la technique d’extraction la plus appropriée pour obtenir les meilleurs résultats en termes de rendement des classes de composés bioactifs les plus intéressantes pour des applications de santé spécifiques.
Comme on peut le voir dans une revue récente, qui rapporte un tableau complet des constituants chimiques du genre Alnus, la méthode d’extraction adoptée dans la présente étude nous a permis d’obtenir un extrait riche en polyphénols au détriment des terpénoïdes. À ce jour, 25 diaryheptanoïdes, 3 ellagitanins, 2 flavonoïdes et 13 terpénoïdes ont été identifiés dans A. glutinosa. Évidemment, le profil phytochimique varie considérablement selon la partie de la plante prise en considération et selon le type de méthode d’extraction adoptée. Cependant, sur les 25 diaryheptanoïdes rapportés, 11 ont été identifiés dans la présente étude, et seulement l’un des deux flavonoïdes précédemment rapportés, à savoir la quercétine-3-sophoroside. De plus, deux diaryheptanoïdes, un dérivé de l’hirsutanol, l’hirsutanonol 5-O-glucoside, et le dérivé coumaroyl de l’orégonine, ont été identifiés pour la première fois dans A. glutinosa. En outre, un autre aspect certainement innovant de la présente étude est d’avoir réalisé une caractérisation qualitative et quantitative de l’AGE. Jusqu’à présent, les rares études disponibles sur A. glutinosa se sont concentrées sur l’isolement des diaryheptanoïdes prédominants, qui ont été identifiés selon leurs données de spectres RMN, UV, IR, CD et de masse. La caractérisation qualitative et quantitative par LC-DAD-ESI-MS/MS a ainsi permis d’obtenir plus d’informations sur la distribution quantitative des différents diaryheptanoïdes, donnant une perspective plus rationnelle sur les utilisations possibles de l’AGE en tant que complexe végétal, en tant que source riche en diaryheptanoïdes et, en particulier, en orégonine, en plus d’établir une relation structure-activité plus concrète de la contribution de chaque constituant à l’activité totale.
Il existe de nombreux rapports qui attestent que les extraits et les composés isolés de différentes espèces d’Alnus ont une activité antimicrobienne, immunomodulatrice, antioxydante et anti-inflammatoire significative. Outre l’écorce de tige, d’autres parties de A. glutinosa étudiées étaient les bourgeons et les feuilles, les premiers pour leur potentiel de guérison des maladies des voies aériennes supérieures, et les secondes pour leur activité antimicrobienne contre certaines bactéries à Gram positif et à Gram négatif, et Candida albicans. Entre autres, certains produits commerciaux à base de bourgeons ou d’extraits de bourgeons de A. glutinosa sont disponibles dans le commerce comme compléments alimentaires et remèdes à base de plantes, respectivement, pour les processus inflammatoires aigus et chroniques affectant les muqueuses.
Selon nos résultats, il a été rapporté que l’orégonine et l’hirsuténone, les composés les plus abondants détectés dans cette étude, ont montré une forte capacité à piéger les radicaux oxygène par rapport aux contrôles positifs dans les tests TEAC, DPPH et ORAC. De plus, de nombreux autres composés ont également présenté une capacité remarquable de piégeage des radicaux libres, par exemple le rubranoside A. En examinant la relation structure/activité, il a été démontré que l’hirsuténone, l’hirsutanonol, l’orégonine et le rubranoside B, qui possèdent deux cycles 3,4-dihydroxyphényle, étaient plus actifs contre les ROS que l’alnuside A et l’alnuside B, qui ont un cycle 3,4-dihydroxyphényle et un cycle 4-hydroxyphényle. Au contraire, le platyphylloside, qui a deux cycles 4-hydroxyphényle, a montré une faible activité, permettant d’affirmer que la capacité de piégeage contre les radicaux peroxyle est étroitement liée aux hydroxyles phénoliques. Cette hypothèse a été corroborée par certaines autres études, qui ont également révélé que les hydroxyles phénoliques étaient essentiels à l’activité antioxydante supérieure des diaryheptanoïdes, par rapport à d’autres composés bioactifs. Enfin, il a récemment été observé que le fragment catéchol était très important pour la propriété de piégeage des radicaux libres. En ce qui concerne le complexe végétal, il s’agit de la première étude qui a évalué l’activité antioxydante et anti-inflammatoire d’un extrait d’écorce d’aulne noir avec différents tests in vitro basés sur différents environnements et mécanismes de réaction. La seule étude disponible à ce jour qui a évalué l’activité antioxydante des extraits d’écorce de A. glutinosa est celle de Lauberts et Pals. Ils ont spécifiquement évalué et corrélé l’influence de différentes techniques d’extraction avec l’activité antioxydante trouvée par les tests DPPH, TEAC et ORAC, obtenant au mieux des résultats comparables à ceux obtenus dans la présente étude.
En ce qui concerne l’activité anti-inflammatoire, Kim et al., qui ont isolé neuf diaryheptanoïdes de l’écorce de A. japonica, ont montré que l’orégonine et l’hirsuténone présentaient les effets inhibiteurs les plus prometteurs sur la production de NO et de COX-2 induite par les lipopolysaccharides (LPS), suggérant que la présence d’un groupe céto-énol dans le fragment heptane ou d’un groupe caféoyl dans le cycle aromatique était importante pour l’activité inhibitrice. Par la suite, une autre étude a mis en évidence l’importance du groupe carbonyle pour l’efficacité des diaryheptanoïdes contre la production de NO induite par les LPS. De plus, Lee et al. ont donné un mécanisme moléculaire possible en notant que l’orégonine était capable d’inhiber la transcription du gène de l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) via la suppression de l’activité transcriptionnelle du facteur nucléaire kappa-B (NF-κB) et de la protéine activatrice-1 (AP-1), ainsi que la régulation à la hausse de la molécule anti-inflammatoire HO-1. En outre, l’orégonine était capable de contrer l’accumulation de lipides, l’inflammation et la production de ROS dans les macrophages humains primaires. Enfin, l’hirsuténone peut exercer un effet préventif contre les maladies cutanées inflammatoires induites par les LPS par l’inhibition de la voie de la kinase à signal extracellulaire (ERK) médiée par l’activation de NF-κB. Le rubranoside B et l’hirsutanolol isolés de l’écorce de A. hirsuta, et l’alnuside A, l’orégonine et le platyphylloside isolés de A. firma ont montré une capacité significative à inhiber l’inflammation induite par les LPS dans les macrophages ou les cellules microgliales BV2. Enfin, Sajida et al. ont évalué l’extrait méthanolique et les fractions dérivées de l’écorce de tige de A. nitida pour l’activité anti-inflammatoire en utilisant le test in vitro de dénaturation de l’albumine induite par la chaleur et divers modèles in vivo, suggérant que les diaryheptanoïdes peuvent jouer un rôle central dans les activités anti-inflammatoires et analgésiques du complexe végétal.
Toutes ces preuves confirment ce que nous avons observé dans la présente étude, à savoir que l’activité antioxydante et anti-inflammatoire de l’AGE est principalement attribuable aux diaryheptanoïdes et que l’orégonine, qui est le composé prédominant dans cet extrait, joue un rôle central dans l’activité antioxydante et anti-inflammatoire du complexe végétal, bien que l’hirsuténone et d’autres composés mineurs puissent également contribuer marginalement.
Malgré plusieurs études étudiant les activités antioxydantes et anti-inflammatoires des diaryheptanoïdes isolés, et de certains complexes végétaux appartenant à plusieurs espèces d’Alnus, aucune donnée n’est aujourd’hui disponible sur leur activité anti-angiogénique potentielle. Cependant, pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’effet anticancéreux des diaryheptanoïdes, reconnu comme l’effet biologique le plus important de ces composés, certaines études ont été menées récemment afin d’évaluer les propriétés antiangiogéniques de certains composés isolés. Hu et al. ont constaté que le diaryheptanoïde 1-phényl-7-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)-4E-en-3-heptanone (PHMH) d’Alpinia officinarum exerce une activité anti-angiogénique à la fois in vitro, ex vivo et in vivo. Le PHMH a significativement inhibé la formation de bourgeons vasculaires induite par le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) ex vivo sur l’anneau aortique, la formation de vaisseaux sanguins chez la souris, l’angiogenèse chez le poisson-zèbre, et les vaisseaux sanguins nouvellement formés dans le modèle CAM. Ces résultats sont conformes aux effets inhibiteurs enregistrés sur la prolifération et la migration cellulaires observés dans les HUVEC. Les auteurs ont émis l’hypothèse, comme mécanisme moléculaire possible, de l’inhibition de l’auto-phosphorylation de VEGFR-2 et de l’inhibition subséquente des cibles en aval protéine kinase B (Akt)/cible mécanistique de la rapamycine (mTOR), kinase régulée par signal extracellulaire ½ (ERK1/2), et kinase d’adhésion focale (FAK).
Ces preuves ont été corroborées par une autre étude récente, qui a démontré que le diaryheptanoïde (S,E)-1-(3,4-diméthoxyphényl)-6-hydroxy-7-phénylhept-4-en-3-one (DPHP), un analogue de l’Alpinoïde C, supprimait l’angiogenèse en inhibant l’expression du facteur inhibiteur du facteur inductible par l’hypoxie (HIF-1α), du VEGF et de sa voie de signalisation en aval, empêchant également le processus vasculogénique dans le modèle CAM. Les deux études ont utilisé des concentrations allant de 0 à 20 µM qui, compte tenu du poids moléculaire des molécules, sont des concentrations comparables à celles testées dans la présente étude pour l’orégonine.
Actuellement, il n’existe aucune étude disponible qui étudie la relation structure/activité possible concernant l’activité anti-angiogénique, s’agissant d’un domaine presque inexploré, mais à la lumière des observations précédentes concernant l’activité antioxydante et anti-inflammatoire, il serait intéressant de réaliser le même type d’études avec les diaryheptanoïdes typiques du genre Alnus et en particulier avec l’orégonine en référence à l’espèce A. glutinosa, qui, avec l’hirsuténone, s’est révélée être le composé le plus prometteur du point de vue biologique.
4. Matériels et méthodes
4.1. Produits chimiques
Le réactif de Folin-Ciocalteu, l’acide gallique, le carbonate de sodium (Na₂CO₃), le β-carotène, l’acide linoléique, le Tween 40, le chloroforme, l’hydroxytoluène butylé (BHT), le 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH), l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (trolox), la 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ), le sulfate de fer heptahydraté (FeSO₄·7H₂O), l’acétate de sodium (CH₃COONa), l’acide acétique glacial, l’acide 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS), le persulfate de potassium (K₂S₂O₈), le dihydrochlorure de 2,2′-azobis(2-méthylpropionamidine) (AAPH), le sel de sodium de la fluorescéine, le phosphate de sodium dibasique (Na₂HPO₄), le phosphate de potassium monobasique (KH₂PO₄), la ferrozine, le chlorure de fer tétrahydraté (FeCl₂·4H₂O), l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l’albumine sérique bovine (BSA) fraction heat-shock protéase, sans acide gras et essentiellement sans globuline (pH 7, ≥98 %), la trypsine de pancréas porcin type IX-S poudre lyophilisée (13 000–20 000 unités BAEE/mg de protéine), l’acide perchlorique, le trizma-base, la caséine, le diclofénac sodique, l’acide rétinoïque, la diéthanolamine, le sel disodique de p-nitrophényl phosphate et l’hydroxyde de sodium (NaOH) ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). L’acétonitrile, l’acide formique et l’orégonine (pureté ≥ 95 %) étaient de qualité HPLC et ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). La quercétine-3-O-glucoside était de qualité HPLC (pureté ≥ 99 %) et a été achetée chez Extrasynthese (Genay, France). Lorsque cela n’est pas spécifié, les réactifs étaient de qualité analytique.
4.2. Matériel végétal et préparation de l’échantillon
L’écorce de tige de A. glutinosa a été collectée sur différents arbres (n = 5) sur la crête montagneuse des Nebrodi (Messine, Italie) en avril 2020. Un spécimen de référence (20/04 AG), identifié par le Prof. F. M. Raimondo, a été déposé au Département des sciences chimiques, biologiques, pharmaceutiques et environnementales de l’Université de Messine (Italie). Après la collecte, l’écorce a été séchée à température ambiante (RT) jusqu’à ce que la teneur en humidité soit ≤ 10 %, réduite en poudre (tamis 355) avec un broyeur à lames (IKA® A11 basic analytical mill, IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Allemagne) et ensuite extraite selon la méthode rapportée par Smeriglio et al. avec quelques modifications. Brièvement, 100 g de poudre d’écorce de tige ont été extraits sous agitation avec 500 mL de mélange méthanol/eau (80:20, v/v) à température ambiante pendant 72 h. L’extraction a été répétée trois fois, les surnageants récupérés, filtrés sur papier Whatman n° 1, et séchés par un évaporateur rotatif à 37 °C (Büchi R-205, Cornaredo, Italie) obtenant un rendement d’extraction de 24,36 %. L’extrait séché (AGE), avec un espace de tête d’azote, a été conservé à −20 °C jusqu’aux analyses suivantes.
4.3. Phénols totaux
Les phénols totaux ont été quantifiés selon Cornara et al. Cinquante microlitres de solution d’échantillon (AGE) et d’acide gallique comme composé de référence, tous deux dans la même plage de concentration (75–600 μg/mL), ont été ajoutés à 500 μL du réactif de Folin-Ciocalteu et 450 μL d’eau déionisée, en incubant pendant 3 min. Après cela, 50 μL de Na₂CO₃ à 10 % w/v ont été ajoutés au mélange, et les échantillons ont été laissés à l’obscurité à RT pendant 60 min, en mélangeant toutes les 10 min. L’absorbance a été lue à 785 nm contre un blanc constitué de méthanol à la place de l’échantillon en utilisant un spectrophotomètre UV-Vis (Shimadzu UV 1601, Kyoto, Japon). Les résultats ont été exprimés en g d’équivalents d’acide gallique (GAE)/g d’AGE.
4.4. Analyse phytochimique
Le profil phytochimique de l’AGE a été étudié par chromatographie liquide couplée à une détection par barrette de diodes et à la spectrométrie de masse en tandem électrospray/piège à ions (analyse LC-DAD-ESI-MS/MS). La séparation a été réalisée par une colonne Luna Omega PS C18 (150 × 2,1 mm, 5 μm ; Phenomenex, Torrance, CA, USA) à RT et avec un débit de 0,4 mL/min en utilisant de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et du méthanol (solvant B) comme phase mobile, selon le programme d’élution et les paramètres du spectromètre de masse rapportés dans Smeriglio et al. Les spectres de masse ont été acquis en utilisant une énergie de fragmentation de 1,2 V (MS/MS). Les pics ont été identifiés en comparant les temps de rétention, les spectres UV-VIS et de masse des analytes avec ceux des étalons de référence de qualité HPLC disponibles dans le commerce (pureté ≥ 95 %), ainsi que par comparaison avec ceux rapportés dans la littérature, et quantifiés en utilisant des courbes d’étalonnage externe d’orégonine (1–50 μg/mL) pour les diaryheptanoïdes et de quercétine-3-O-glucoside pour les dérivés de la quercétine.
4.5. Activité antioxydante et anti-inflammatoire in vitro
L’activité antioxydante et anti-inflammatoire de l’AGE a été évaluée par plusieurs tests in vitro basés sur différents mécanismes et environnements de réaction. Les résultats, qui représentent la moyenne de trois expériences indépendantes en triple (n = 3), ont été exprimés en pourcentage d’inhibition (%) de l’activité oxydative/radicalaire/inflammatoire, en calculant la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) avec les limites de confiance à 95 % (C.L.) respectives par le test de Litchfield et Wilcoxon en utilisant le logiciel PHARM/PCS version 4 (MCS Consulting, Wynnewood, PA, USA). Toutes les plages de concentration suivant celles rapportées se réfèrent aux concentrations finales d’AGE et de composés de référence dans le mélange réactionnel. Les mesures spectroscopiques et fluorométriques ont été enregistrées par un spectrophotomètre UV-Vis (Shimadzu UV 1601, Kyoto, Japon), un lecteur de plaques UV-VIS (Multiskan GO ; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) et un lecteur de plaques de fluorescence (Fluostar Omega, BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne).
4.5.1. Test BCB
Le test BCB a été réalisé en utilisant une émulsion de β-carotène préparée selon Muscarà et al. Brièvement, 0,320 mL de solution méthanolique d’AGE (1,25–10 µg/mL), d’orégonine (2,5–20 μg/mL) et d’étalon de référence (BHT, 30 µg/mL) ont été ajoutés à 8 mL d’émulsion de β-carotène. Une émulsion sans β-carotène a été utilisée comme contrôle négatif, tandis qu’une émulsion de β-carotène avec du méthanol à la place de l’échantillon a été utilisée comme contrôle positif. L’absorbance a été enregistrée au temps de départ et pendant l’incubation à 50 °C, toutes les 20 min pendant 120 min à 470 nm, enregistrant la décroissance de l’absorbance.
4.5.2. Test DPPH
Le test DPPH a été réalisé selon Smeriglio et al. Brièvement, 37,5 μL de solution méthanolique d’AGE (3,0–24,0 μg/mL), d’orégonine (2,5–20 μg/mL) et de trolox comme composé de référence (1,25–10,0 μg/mL) ont été ajoutés à 1,5 mL de solution méthanolique fraîche de DPPH 10⁻⁴ M, mélangés et incubés à l’obscurité pendant 20 min. L’absorbance a été enregistrée à 517 nm contre un blanc constitué de méthanol à la place de l’échantillon.
4.5.3. Test FRAP
Le pouvoir antioxydant réducteur du fer a été évalué selon Denaro et al. Cinquante microlitres de solution méthanolique d’AGE (1,5–12 μg/mL) et d’orégonine (1,25–10 μg/mL) ont été ajoutés à 1,5 mL de réactif FRAP de travail frais préchauffé (37 °C) et ont été incubés pendant 4 min à RT à l’obscurité. L’absorbance a été enregistrée à 593 nm en utilisant le trolox comme composé de référence (0,63–5,0 μg/mL) et le méthanol comme blanc.
4.5.4. Test TEAC
L’activité de piégeage des radicaux a été évaluée selon Danna et al. Le mélange réactionnel (K₂S₂O₈ 4,3 mM : ABTS 1,7 mM, 1:5 v/v) a été incubé pendant 12 h à l’obscurité à RT, dilué pour obtenir une absorbance de 0,7 ± 0,02 (734 nm), et utilisé dans les 4 h. Cinquante microlitres d’AGE (0,75–6,0 μg/mL) et d’orégonine (1,25–10 μg/mL) ont été ajoutés au mélange réactionnel (1 mL) et ont été incubés à RT pendant 6 min. La diminution de l’absorbance a été enregistrée à 734 nm en utilisant le trolox comme composé de référence (0,63–5,0 μg/mL) et le méthanol comme blanc.
4.5.5. Test ORAC
Le test ORAC a été réalisé selon Bazzicalupo et al. Brièvement, 20 µL de solution méthanolique d’AGE (0,031–0,25 μg/mL) et d’orégonine (0,03–0,20 μg/mL) ont été ajoutés à 120 μL de fluorescéine fraîche 117 nM et ont été incubés pendant 15 min à 37 °C. Soixante microlitres d’AAPH 40 mM ont été ajoutés pour déclencher la réaction, qui a été enregistrée toutes les 30 s pendant 90 min (λ ex 485 ; λ em 520) par le lecteur de plaques de fluorescence rapporté à la Section 4.5 et en utilisant le trolox comme composé de référence (0,25–2,5 μg/mL).
4.5.6. Test à la ferrozine
L’activité chélatrice du fer a été évaluée selon Smeriglio et al. Cinquante microlitres d’AGE (50–400 μg/mL) ont été ajoutés à 2 mM de FeCl₂·4H₂O (25 µL) et ont été incubés à RT pendant 5 min. Cinquante microlitres de ferrozine 5 mM et 1375 µL d’eau déionisée ont ensuite été ajoutés au mélange réactionnel. L’absorbance a été enregistrée après 10 min à 562 nm. L’EDTA a été utilisé comme composé de référence (1,25–10 μg/mL).
4.5.7. Test de dénaturation de la BSA
La capacité de l’AGE à inhiber la dénaturation de la BSA induite par la chaleur a été évaluée selon Smeriglio et al. Brièvement, 100 µL de solution de BSA à 0,4 % et 20 µL de PBS (pH 5,3) ont été ajoutés dans une plaque à 96 puits. Ensuite, 80 µL de solution méthanolique d’AGE (2,0–16,0 μg/mL) et d’orégonine (1,25–10,0 μg/mL) ont été ajoutés au mélange. L’absorbance a été enregistrée immédiatement à 595 nm et après incubation (30 min à 70 °C). Un blanc constitué de méthanol a été utilisé comme blanc. Le diclofénac sodique a été utilisé comme composé de référence (3,0–24,0 μg/mL).
4.5.8. Test d’inhibition de la protéase
L’activité inhibitrice de la protéase de l’AGE a été évaluée selon Smeriglio et al. Brièvement, 200 µL de solution méthanolique d’AGE (2,0–16,0 μg/mL) et d’orégonine (1,25–10,0 μg/mL) ont été ajoutés au mélange réactionnel constitué de 10 μg/mL de trypsine (12 μL) et de tampon Tris-HCl 25 mM pH 7,5 (188 μL). Deux cents microlitres de caséine à 0,8 % ont été ajoutés et le mélange réactionnel incubé pendant 20 min à 37 °C dans un bain-marie. Après cela, 400 μL d’acide perchlorique ont été ajoutés pour arrêter la réaction. La suspension trouble a été centrifugée à 3500 × g pendant 10 min et l’absorbance du surnageant a été enregistrée à 280 nm contre un blanc constitué de méthanol. Le diclofénac sodique a été utilisé comme composé de référence (2,0–16,0 μg/mL).
4.6. Activité anti-angiogénique in vivo
4.6.1. Test CAM
L’évaluation des propriétés anti-angiogéniques de l’AGE a été réalisée selon Smeriglio et al. Des œufs fécondés de Gallus gallus ont été incubés pendant 96 h à 37 °C pour favoriser la croissance des vaisseaux et le développement de la CAM. Les embryons malformés ou morts ont été écartés. D’abord, un criblage pour trouver une plage de concentration non toxique pour l’AGE et l’orégonine a été réalisé. Après cela, la solution méthanolique d’AGE (12,50–50 μg/œuf), l’orégonine (3,75–30 μg/œuf), l’acide rétinoïque (1 μg/œuf) comme contrôle positif ou le méthanol comme contrôle négatif ont été appliqués sur les surfaces de la CAM et les œufs ont été incubés pendant 24 h. L’effet anti-angiogénique a été évalué par un stéréomicroscope (SMZ-171 Series, Motic, Hong Kong, Chine) équipé d’une caméra numérique (Moticam® 5 plus). Les micrographies ont été traitées par le GNU Image Manipulation Program (GIMP version 2.10.2). Les résultats, obtenus par trois expériences indépendantes en quintuple (n = 5), ont été exprimés comme rapporté à la Section 4.5.
4.6.2. Activité EAP sur les embryons de poisson-zèbre
La quantification de l’EAP dans les embryons de poisson-zèbre a été réalisée selon Certo et al. en suivant les directives éthiques décrites par le National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Des spécimens mâles et femelles de poisson-zèbre ont été achetés dans une animalerie locale et maintenus dans un aquarium à 28 °C avec une photopériode de 14/10 (lumière/obscurité). Après un accouplement naturel, les embryons ont été collectés et maintenus dans l’eau à 28,5 °C. Vingt-quatre heures après la fécondation (hpf), les embryons sains et réguliers ont été sélectionnés. D’abord, des plages de concentration plus larges ont été testées pour vérifier la toxicité possible de l’AGE et de l’orégonine.
Après déchorionation, les embryons ont été ensemencés dans une plaque à 96 puits et incubés avec 100 μL d’eau d’embryons contenant la solution méthanolique d’AGE (12,50–50 μg/embryon), l’orégonine (3,75–30 μg/embryon) et l’étalon de référence 2-méthoxyestradiol (30 μg/embryon). Le méthanol a été utilisé comme contrôle négatif. Tous les embryons ont été incubés pendant 72 hpf. Après cela, les embryons ont été déshydratés par des concentrations croissantes d’éthanol, lavés trois fois avec du tampon diéthanolamine 1M (pH 9,8) puis incubés pendant 30 min à RT avec le sel disodique de p-nitrophényl phosphate. De l’hydroxyde de sodium (2 mM) a été ajouté pour arrêter la réaction. L’absorbance a été enregistrée à 405 nm par le lecteur de microplaques rapporté à la Section 4.5. Les résultats, obtenus par trois expériences indépendantes en quintuple (n = 5), ont été exprimés comme rapporté à la Section 4.5.
4.7. Analyse statistique
Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition moyen, en calculant l’IC50 et les C.L. respectives à 95 % de trois expériences indépendantes en triple (n = 3) pour les expériences in vitro et de trois expériences indépendantes en quintuple (n = 5) pour les expériences in vivo. La signification statistique a été évaluée par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de Tukey, en utilisant le logiciel SigmaPlot 12.0. Les données ont été considérées comme statistiquement significatives pour p < 0,05.
5. Conclusions
En conclusion, la méthode d’extraction adoptée dans la présente étude a permis d’obtenir un extrait d’écorce d’aulne noir très riche en diaryheptanoïdes. Deux diaryheptanoïdes, l’hirsutanonol 5-O-glucoside et le coumaroyl-orégonine, ont été identifiés pour la première fois. Il s’agit de la première étude à réaliser une caractérisation qualitative et quantitative de l’extrait d’écorce d’aulne noir, identifiant l’orégonine comme le composé prédominant suivie de l’hirsuténone, deux des diaryheptanoïdes reconnus, grâce à des études SAR, comme capables d’exercer les activités antioxydantes et anti-inflammatoires les plus fortes. En effet, la présente étude démontre, grâce à une comparaison directe des propriétés biologiques étudiées entre le complexe végétal et le diaryheptanoïde le plus abondant l’orégonine, que l’activité antioxydante, anti-inflammatoire et anti-angiogénique prometteuse trouvée dans le complexe végétal est presque entièrement attribuable à l’orégonine.
Bien que d’autres études soient nécessaires pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces activités biologiques intéressantes, l’extrait d’écorce de tige de A. glutinosa s’est certainement révélé être un complexe végétal très intéressant et prometteur qui pourrait avoir des applications dans les domaines cosméceutique, nutraceutique et pharmaceutique.