Effet anti-Toxoplasma gondii des triterpènes de type lupane de l’écorce de l’aulne noir (Alnus glutinosa) et identification d’une cible potentielle par docking inverse
Référence : Parasite 2022. — PMID 35142606 · DOI 10.1051/parasite/2022008 Type : etude in vitro · Plante : Aulne glutineux · Propriété → Antiparasitaire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
La toxoplasmose est une parasitose mondiale généralement bénigne. L’infestation peut présenter un risque pour les patients immunodéprimés et pour les fœtus lorsque les femmes enceintes ont récemment séroconverti. Les traitements actuels ont de nombreux effets secondaires et une chimiorésistance émerge, d’où la nécessité de trouver de nouvelles substances anti-Toxoplasma gondii. Cette étude se concentre sur le potentiel antiparasitaire des triterpènes pentacycliques de type lupane isolés de l’écorce de l’aulne noir (Alnus glutinosa), ainsi que sur l’hypothèse de leur cible macromoléculaire par une méthode originale de docking inverse. Parmi les triterpènes isolés, la bétulone était le composé le plus actif avec une IC50 de 2,7 ± 1,2 μM, une CC50 supérieure à 80 μM, et un indice de sélectivité supérieur à 29,6. Une étude complémentaire du potentiel anti-T. gondii de composés disponibles dans le commerce (ester méthylique de l’acide bétulonique et acide bétulonique) a montré le rôle important de la fonction cétone en C3 et du niveau d’oxydation en C28 sur le triterpène de type lupane dans l’activité antiparasitaire, puisque leurs IC50 et CC50 étaient similaires à celles de la bétulone. Enfin, les composés les plus actifs ont été soumis au flux de travail de docking inverse AMIDE. Un jeu de données de 87 protéines de T. gondii provenant de la Protein Data Bank a été créé. Il a identifié la protéine kinase dépendante du calcium CDPK3 comme la cible la plus probable des dérivés de la bétuline.
1. Introduction
Toxoplasma gondii est un parasite apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Cette parasitose affecte environ un tiers de la population mondiale. Bien que bénigne dans la plupart des cas, elle peut néanmoins présenter des risques pour les patients immunodéprimés ou les fœtus. Le traitement de première intention consiste en l’association de pyriméthamine et de sulfadiazine avec ajout de leucovorine pour prévenir la toxicité hématologique. L’atovaquone ou l’azithromycine peuvent être utilisées comme thérapie alternative en association avec la pyriméthamine ou la sulfadiazine pour le traitement et la prophylaxie de la toxoplasmose lorsque le traitement de première intention est contre-indiqué (possibilité d’effets secondaires graves lorsque la pyriméthamine est associée à la sulfadiazine). De plus, il a été montré que le parasite peut développer une résistance aux traitements.
Les plantes sont un important réservoir naturel de composés antimicrobiens. Dans ce contexte, les écorces d’arbres sont un matériau de départ d’intérêt car elles protègent le bois de cœur contre les attaques d’insectes, de champignons ou de micro-organismes. L’aulne noir (Alnus glutinosa, Betulaceae) est un arbre présent dans toute l’Europe. Une décoction de l’écorce est utilisée dans certaines médecines traditionnelles pour lutter contre la fièvre, l’inflammation de la bouche et du pharynx, et les rhumatismes. Cette espèce est connue pour sa richesse en composés triterpéniques tels que la bétuline, l’acide bétulinique, le lupéol et le lupénone. De nombreuses études ont rapporté l’activité biologique des triterpènes comme les activités antitumorale, anti-inflammatoire, hépatoprotectrice, gastroprotectrice, antimicrobienne, antidiabétique et hémolytique. Chez les apicomplexes et plus particulièrement chez Plasmodium falciparum, l’acide bétulinique et ses analogues perturbent le processus d’invasion du parasite in vitro. D’autres dérivés de l’acide bétulinique ont montré une activité antiparasitaire in vivo sur deux espèces de Plasmodium. Les dérivés de l’acide ursolique inhibent l’activité in vitro de la protéine PfHsp70-1 impliquée dans le développement du parasite. Pour T. gondii, les triterpènes de type lupane et ursane de Quercus crispula ont démontré des activités antiparasitaires in vitro. L’acide maslinique (triterpène de type oléanane) extrait d’Olea europaea pourrait également perturber le processus d’invasion de la cellule hôte. Néanmoins, le mécanisme d’action des triterpènes sur T. gondii reste largement inconnu. Seul le docking de dérivés de l’acide ursolique sur la protéine TgCDPK1 a été réalisé et a montré une forte affinité entre les deux entités, mais la qualification de l’interaction des triterpènes sur d’autres cibles de T. gondii n’a pas été étudiée.
Dans une étude précédente, nous avons démontré la forte activité anti-T. gondii de l’extrait à l’n-heptane de l’écorce d’aulne noir (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) parmi 30 extraits de différentes polarités provenant de 10 espèces d’arbres tempérés. L’étude phytochimique de cet extrait a révélé la présence majoritaire de triterpènes de type lupane. Les premiers bioessais ont montré une corrélation de l’activité biologique avec la présence de triterpènes, en particulier la bétulone. Une approche combinant la détermination des IC50 et CC50 des composés d’intérêt et un flux de travail original de docking moléculaire inverse est proposée pour mieux comprendre le mécanisme d’action de ces molécules sur T. gondii. Le docking moléculaire vise à simuler l’interaction entre un ligand et une cible potentielle. L’expérimentation de docking trouve les meilleurs complexes ligand/récepteur selon l’énergie de liaison. Le croisement de ces données théoriques avec des données expérimentales peut définir davantage l’effet agoniste d’une petite molécule vis-à-vis d’un récepteur. Le docking inverse permet le criblage d’un ligand sur de multiples récepteurs. De cette façon, il est possible de prédire la cible préférentielle d’un ligand.
Dans cette étude, nous présentons la purification des triterpènes de l’extrait d’écorce de Alnus glutinosa et leur activité sur T. gondii par la détermination de leurs valeurs d’IC50. Un processus de docking inverse a ensuite été utilisé pour émettre l’hypothèse de la cible potentielle des composés les plus actifs avec le cadre de docking inverse AMIDE. L’ensemble des protéines a été construit à partir des structures de la Protein Data Bank (PDB) disponibles sur le site du Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) (mi-2019) après élimination des modèles redondants et de faible qualité. Le docking inverse a été exécuté à l’aide du cadre AMIDE récemment mis à jour.
2. Matériel et méthodes
2.1. Produits chimiques et matériel végétal
L’écorce d’arbre de Alnus glutinosa (L.) Gaertn. (aulne noir, Betulaceae) a été récoltée en 2014 dans le territoire de Champagne-Ardenne (nord-est de la France) avec l’autorisation de l’Office National des Forêts (ONF) français. Un spécimen de référence (JH-2014-3) a été déposé à l’Herbier du laboratoire de Botanique de la faculté de Pharmacie de Reims (Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims, France). Il a été séché pendant 72 h et broyé comme décrit dans une publication précédente.
L’acide bétulonique (CAS : 4481-62-3) et l’ester méthylique de l’acide bétulonique (CAS : 4356-31-4) ont été achetés chez ClickBetulin (Ventspils, Lettonie).
L’acétonitrile (CH₃CN), le méthanol (MeOH), le méthyl-tert-butyléther (MtBE) et le n-heptane ont été achetés chez Carlo Erba Réactifs SDS (Val-de-Reuil, France). Le chloroforme deutéré (chloroforme-d) a été acheté chez Sigma-Aldrich (Saint-Quentin, France).
2.2. Analyse RMN
Les composés à analyser ont été dissous dans 600 μL de CDCl₃. Les expériences RMN ¹H, ¹³C et 2D (HSQC, HMBC et COSY) ont été réalisées à 298 K sur un spectromètre Avance AVIII-600 (Bruker, Allemagne) (¹H à 600 MHz et ¹³C à 150 MHz) équipé d’une cryosonde TCI de 5 mm. Les expériences RMN 2D ont été réalisées à l’aide de microprogrammes Bruker standard (logiciel TopSpin 3.2).
2.3. Extraction solide-liquide et fractionnement par chromatographie de partage centrifuge
Les écorces séchées et pulvérisées de A. glutinosa (100 g) ont été macérées dans 1,5 L de n-heptane sous agitation à température ambiante pendant une nuit. L’extrait a ensuite été filtré et séché dans un évaporateur rotatif, pour donner 1,1 g d’extrait (rendement 1,1 %). Le fractionnement de l’extrait a été réalisé par chromatographie de partage centrifuge (CPC) sur une colonne d’une capacité de 303,5 mL (FCPE300®, Rousselet–Robatel–Kromaton, Annonay, France) contenant sept disques de partage gravés de 231 cellules de partage jumelles (≈1 mL par cellule jumelle). La colonne CPC a d’abord été remplie en pompant la phase inférieure du système solvant biphasique n-heptane/méthanol (1:1, v/v) avec 1 % d’eau à un débit de 50 mL/min avec une pompe KNAUER Preparative 1800 V7115 (Berlin, Allemagne) en mode descendant et une vitesse de rotation de 500 rpm (27 g). Ensuite, la colonne CPC a été équilibrée en pompant la phase mobile (c’est-à-dire la phase supérieure du même système solvant biphasique) en mode ascendant. La rotation a été augmentée à 1200 rpm (158 g). L’extrait d’écorce (1,2 g) solubilisé dans 20 mL d’un mélange de phase stationnaire et de phase mobile (8:2, v/v) a été injecté à travers une vanne d’injection Rheodyne 3725 après solubilisation. Ensuite, 120 fractions ont été collectées chaque minute à l’aide d’un collecteur Pharmacia Superfrac (Uppsala, Suède). La séparation a été suivie par UV à 210, 254, 280 et 366 nm (détecteur UVD 170S, Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Toutes les fractions ont été analysées par chromatographie sur couche mince (CCM) puis regroupées selon leur profil chromatographique, donnant 20 fractions chimiquement simplifiées. La CCM a été réalisée sur des plaques de gel de silice pré-enduites Merck 60 F254 et développées avec du n-heptane/acétone (75:25 v/v). Les plaques CCM ont ensuite été pulvérisées avec de la vanilline (5 % w/v dans EtOH) et une solution de H₂SO₄ (50 % v/v dans MeOH), suivies d’un chauffage à 100–120 °C pendant 2–3 min.
2.4. Purification par HPLC semi-préparative
Les fractions riches en terpènes ont été solubilisées dans du MtBE puis purifiées à l’aide d’une colonne semi-préparative Uptisphere Strategy C18-HQ 250 × 10,0 mm (5 μm) (Interchim, Montluçon, France) et d’une chaîne HPLC Dionex équipée d’un passeur automatique d’échantillons ASI-100, d’une pompe P580, d’un détecteur à barrette de diodes UVD 340S, d’un collecteur de fractions automatisé Ultimate 3000 et du logiciel Chromeleon 6.8. Une élution en gradient à débit constant de 5 mL·min⁻¹ a été utilisée, commençant avec 90 % d’éluant A (CH₃CN) et 10 % d’éluant B (H₂O avec 0,025 % d’acide trifluoroacétique) atteignant 100 % d’éluant A en 5 min, suivie d’une élution isocratique avec 100 % d’éluant A pendant 25 min. L’effluent a été surveillé à 200 nm. Six triterpènes ont été purifiés : 4,7 mg d’acide bétulinique (3) (tr = 7,0 min), 31 mg de lupénone (6) (tr = 7,4 min), 20,9 mg de bétuline (1) (tr = 8,7 min), 2,7 mg de bétulone (4) (tr = 9,2 min), 11,7 mg de bétulinaldéhyde (2) (tr = 10,5 min) et 16,2 mg de lupéol (5) (tr = 11,0 min). Un phytostérol a également été purifié, 7,2 mg de β-sitosténone (9) (tr = 7,8 min).
2.5. Essais biologiques
2.5.1. Culture cellulaire
Les cellules Vero (cellules hôtes du tachyzoïte de T. gondii) ont été achetées à l’ATCC (référence CCL-81), cultivées dans un milieu Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) GlutaMAX (Gibco) supplémenté avec 5 % de sérum de veau fœtal décomplémenté avec 1 % de pénicilline/streptomycine. La culture a été incubée à 37 °C et 5 % de CO₂. Les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (souche RH, type I) ont été cultivés dans les mêmes conditions que les cellules Vero sauf que la concentration de sérum de veau fœtal était de 2 %.
2.5.2. Solutions mères et dilutions
Les solutions mères à 1 mg/mL ont été préparées dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, PanReac AppliChem, Darmstadt, Allemagne) de qualité culture cellulaire. Les dilutions ultérieures ont été effectuées dans un milieu de culture identique à celui utilisé pour le maintien des tachyzoïtes.
2.5.3. Évaluation de la cytotoxicité
La cytotoxicité in vitro a été évaluée sur des cultures de cellules Vero à l’aide du test de comptage de cellules viables Uptiblue® (Interchim, Montluçon, France). Les essais de CC50 ont été réalisés dans des plaques à 96 puits contenant 20 000 cellules Vero et 200 μL de milieu de culture identique à celui utilisé pour le maintien des cellules Vero. Après 4 h d’incubation, les puits ont été vidés. L’IC50 a été réalisée avec 100 μL de solutions contenant les composés testés avec une plage de concentration finale de 0–80 μM. Après 72 h d’incubation, les puits ont été lavés avec 100 μL de tampon phosphate salin (PBS) (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France). Ensuite, 100 μL de milieu de culture IMDM supplémenté avec 2 % (v/v) de sérum de veau fœtal et 10 % (v/v) d’Uptiblue® ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont été placées à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 h. Les mesures spectrophotométriques ont été effectuées à 570 nm et corrigées à 600 nm sur un spectrophotomètre AMR-100 (AllSheng, Hangzhou, Chine).
2.5.4. Criblage à 10 μM et concentration inhibitrice demi-maximale (IC50)
Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Le criblage des composés a été réalisé à 10 μM dans des plaques à 96 puits. Ainsi, 20 000 cellules Vero contenues dans 200 μL de milieu de culture ont été déposées dans chaque puits et laissées adhérer pendant 4 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Ensuite, 50 000 parasites contenus dans 50 μL de milieu de culture ont été déposés, suivis de 3 h d’incubation dans les mêmes conditions. Les puits ont ensuite été vidés et 100 μL de solutions contenant chaque médicament à une concentration finale de 10 μM ont été ajoutés. L’incubation s’est poursuivie pendant 72 h. Les multiplications parasitaires ont été révélées par dosage immuno-enzymatique.
Les essais d’IC50 ont été traités dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Les dilutions ont été réalisées dans un milieu de culture. L’IC50 a été déterminée à l’aide d’un protocole adapté de Doliwa et al. Les parasites et les cellules ont d’abord été fixés avec 100 μL de méthanol froid pendant 5 min à −20 °C. Les cellules ont ensuite été réhydratées avec 100 μL de PBS à température ambiante. Les puits ont ensuite été vidés et remplis avec 60 μL d’une solution d’anticorps de lapin anti-T. gondii (Réf. 9070-0556, Biorad) dilué au 1/1000. Après 1 heure d’incubation à 37 °C, les puits ont été lavés trois fois avec du PBS, et 60 μL d’anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Réf. 170-6515, Bio-Rad) au 1/1000 ont été ajoutés, suivis de 1 h d’incubation à 37 °C. Les puits ont été lavés trois fois de plus, et 200 μL d’une solution de dichlorhydrate d’o-phénylènediamine (Sigma, France) ont été ajoutés. Après 15 min à température ambiante, la réaction enzymatique a été arrêtée par l’ajout de 50 μL d’acide chlorhydrique (HCl) 3 M. Pour finir, 200 μL de chaque puits ont été transférés dans un nouveau puits et une lecture au spectrophotomètre a été effectuée à 492 nm, corrigée à 630 nm. Chaque expérience a été réalisée avec trois contrôles : contrôle avec les cellules hôtes seules, contrôle avec les cellules hôtes et les parasites sans le médicament pour la multiplication parasitaire, et contrôle avec les cellules hôtes avec les parasites et la pyriméthamine à 1 μM.
2.5.5. Indice de sélectivité
La valeur de l’indice de sélectivité (SI) a été calculée pour chaque composé selon la formule :
SI = CC50 / IC50.
2.5.6. Analyse statistique du criblage in vitro
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel R (version 4.1.1) avec l’IDE RStudio (version 1.4.1717). Avant la comparaison par paires, la normalité des données a été évaluée par un test de Shapiro. L’homogénéité de la variance entre les échantillons a ensuite été vérifiée à l’aide d’un test de Fisher avant les comparaisons par paires des résultats de criblage avec un test t de Student classique lorsque les deux hypothèses nulles de normalité et d’homogénéité de la variance étaient vérifiées, ou un test t de Welsh à deux échantillons lorsque seule l’hypothèse nulle sur la normalité des données était vérifiée. Enfin, un test exact de Wilcoxon rank-sum a été utilisé pour tous les autres cas. Les niveaux de signification pour les valeurs p sont : inférieur à 0,05 (), inférieur à 0,01 (), inférieur à 0,001 ().
2.6. Calcul de l’absorption et de la perméation
L’outil SwissADME (http://www.swissadme.ch/) calcule les descripteurs physicochimiques d’intérêt et prédit les paramètres ADME, les propriétés pharmacocinétiques et la nature de druglikeness des composés donnés.
Ainsi, les descripteurs de triterpènes liés à la conformité de Lipinski ont été calculés (poids moléculaire, coefficient de partage octanol-eau de Moriguchi MlogP, accepteurs de liaison H, donneurs de liaison H) ainsi que l’absorption gastro-intestinale (GI) ou la perméation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) [ ]. Les règles de Lipinski suggèrent qu’une faible absorption ou une faible perméation peut être associée à un poids moléculaire supérieur à 500 Da, à un MlogP supérieur à 4,15, à plus de 10 accepteurs de liaison H, et à plus de 5 donneurs de liaison H. Une seule violation de ces règles est acceptée. Le modèle BOILED-Egg estime l’absorption GI et la perméation de la BHE selon la lipophilie et la polarité des composés.
[ ]
2.7. Procédure de docking inverse
2.7.1. Matériel informatique
Toutes les procédures de docking ont été réalisées sur un Dell Optiplex 7920 équipé d’un Intel® Xeon® Silver 4216 2,1 GHz et d’un NVidia Quadro RTX 4000 fonctionnant sous Ubuntu 20.04.
2.7.2. Préparation des ligands et des protéines pour le docking inverse
Le docking inverse a été réalisé à l’aide du cadre AMIDE v2. Sa caractéristique principale est sa rapidité d’obtention des résultats. Chaque cible (protéine) est divisée en douze boîtes. Le ligand est docké sur chaque boîte et les calculs sont répartis entre plusieurs entités, telles que les cœurs de CPU ou les GPU.
Les structures 2D des molécules ont été dessinées sur ChemDraw 18.0 (https://perkinelmerinformatics.com/). Les structures moléculaires 3D à énergie minimisée des composés dockés ont ensuite été obtenues avec l’outil LigPrep de la suite Schrödinger (https://www.schrodinger.com/) avec le champ de force OPLS3e, ionisation à pH 7 sans génération de tautomères. Les fichiers résultants ont été convertis au format PDBQT lisible par AutoDock avec Open Babel (https://openbabel.org/).
La structure de 218 protéines liées à T. gondii a été obtenue à partir de la Protein Data Bank (https://rcsb.org/) mi-2019. Les structures protéiques obtenues par cristallographie aux rayons X et correspondant à une résolution inférieure à 3 Å ont été sélectionnées. Ainsi, un ensemble final de 87 structures non redondantes, incluant les structures avec cofacteurs co-cristallisés, a été créé. Ensuite, chaque protéine a été soumise à AMIDE pour être découpée en 12 boîtes de docking chevauchantes. Le nombre d’exécutions AutoDock par boîte a été fixé à 20.
2.7.3. Procédure générale de docking
Dans une première étape, la bétulone, le composé le plus actif in vitro, a été dockée sur les 87 protéines par le processus de docking inverse. Les 10 premiers clusters bétulone/protéine obtenus après l’application des scorings 1 et 2 (décrits ci-dessous) ont été sélectionnés et analysés visuellement avec PyMol 2 (https://pymol.org/2/) pour distinguer les poses plausibles des poses improbables. En particulier, la présence du ligand dans une cavité protéique et l’existence de liaisons hydrogène ont été vérifiées. Enfin, les poses sélectionnées des complexes protéine-ligand ont été explorées plus en profondeur par de nouvelles expériences de docking se concentrant sur une boîte de 40 × 40 × 40 ų centrée dans la zone du meilleur cluster. Les paramètres de ces expériences étaient les suivants : espacement égal à 0,375 Å, 150 exécutions utilisant la méthode de recherche locale Solis-Wets combinée à l’utilisation d’AutoDock-GPU. Enfin, les poses générées ont également été étudiées avec PyMol 2.
2.7.4. Analyses de docking inverse et compléments
Après le processus AMIDE, tous les complexes protéine-ligand ont été soumis à un script de clustering modifié d’AutoDock Tools. La distance seuil utilisée dans le processus de clustering a été choisie en fonction de la valeur moyenne du rayon de giration du ligand. Chaque cluster identifié a été caractérisé par deux paramètres : sa population et la meilleure énergie libre de liaison parmi ses éléments. Pour un complexe ligand/protéine donné, le caractère statistique de l’expérience de docking a été considéré à travers la définition d’une fonction de scoring (scoring 1, Éq. (1)) qui pondère l’énergie et la population du cluster. Le scoring 1 a été utilisé pour re-classer les clusters d’un ligand considéré pour chaque protéine. Suivant la même idée, la nature diverse de l’ensemble des protéines a été considérée à travers la définition d’une seconde fonction de scoring (scoring 2, Éq. (2)) qui pondère les différences entre les complexes. Ce second classement a été utilisé pour trouver la cible la plus prometteuse de la bétulone. Pour les deux équations, ΔG min était l’énergie libre de liaison la plus faible identifiée soit au sein d’un complexe donné (scoring 1), soit parmi tous les complexes (scoring 2), ΔG x était l’énergie libre de liaison du cluster considéré, Pop max était la population de cluster la plus élevée identifiée soit au sein d’un complexe donné (scoring 1), soit parmi tous les complexes (scoring 2), et Pop x était la population du cluster considéré. Pour l’équation (2), Score 1 min était le score correspondant au meilleur complexe parmi tous les clusters, et Score 1 x était le score du cluster considéré. Plus le scoring est faible, meilleur est le résultat :
(1) Scoring 1 = √[ ((ΔG min − ΔG x)/ΔG min)² + ((Pop max − Pop x)/Pop max)² ]
(2) Scoring 2 = √[ ((ΔG min − ΔG x)/ΔG min)² + ((Pop max − Pop x)/Pop max)² + ((Score 1 min − Score 1 x)/Score 1 min)² ]
3. Résultats
3.1. Purification des composés d’intérêt
L’extrait à l’n-heptane de l’écorce de Alnus glutinosa a d’abord été fractionné par chromatographie de partage centrifuge, puis les fractions riches en triterpènes ont été purifiées par HPLC semi-préparative en phase inverse. Sept composés ont été purifiés et leurs structures ont été identifiées par analyse des données RMN comme 6 triterpènes de type lupane connus : la bétuline (1), le bétulinaldéhyde (2), l’acide bétulinique (3), la bétulone (4), le lupéol (5) et le lupénone (6) ainsi que la β-sitosténone (9), un phytostérol [ ]. L’activité des composés purifiés (1–5, 9) a ensuite été évaluée contre Toxoplasma gondii sauf pour le lupénone (6) qui n’était pas soluble dans le DMSO.
[ ]
3.2. Criblage à 10 μM
Le criblage des composés purifiés 1–5 et 9 a été réalisé à 10 μM [ ]. Le phytostérol β-sitosténone (9) isolé de A. glutinosa n’a montré aucune activité pertinente. L’acide bétulinique (3) et la bétuline (1) ont montré respectivement 49 % et 44 % d’inhibition de la croissance parasitaire. Le lupéol (5) a eu une action modérée de 60 %, mais ce résultat doit être modulé en raison de l’écart-type élevé probablement dû à la faible solubilité de ce triterpène. Le bétulinaldéhyde (2) et la bétulone (4) ont montré la plus forte activité d’inhibition de la croissance : 93 % et 99 %, respectivement. Seuls les triterpènes de type lupane 1–5 ont donc été conservés pour des études ultérieures. À titre de comparaison, l’inhibition de la croissance parasitaire de la pyriméthamine (composé de référence) est de 78 % à 1 μM, mais le composé est cytotoxique à 10 μM, il n’a donc pas été utilisé comme contrôle positif à cette concentration.
[ ]
3.3. Concentration inhibitrice demi-maximale (IC50)
Le tableau [ ] montre les IC50 des triterpènes de type lupane (1–5) ainsi que des deux composés structurellement apparentés disponibles dans le commerce, l’acide bétulonique (7) et l’ester méthylique de l’acide bétulonique (8). Bien que ces derniers n’aient jamais été décrits dans les écorces de Alnus glutinosa, ils ont néanmoins été introduits dans cette étude pour des considérations de relation structure-activité. La bétulone (4) et l’ester méthylique de l’acide bétulonique (8) ont montré les IC50 les plus faibles à 2,7 μM ± 1,2 et 3,1 μM ± 0,4, respectivement. L’IC50 du bétulinaldéhyde (2) et de l’acide bétulonique (7) était un peu plus élevée, avec des valeurs de 5,1 μM ± 0,6 et 4,3 μM ± 1,4, respectivement. L’acide bétulinique (3), la bétuline (1) et le lupéol (5) avaient des IC50 similaires à 8,3 μM ± 2,7, 13,3 μM ± 7,3 et 13,8 μM ± 4,0, respectivement. L’écart-type des résultats obtenus pour la bétuline (1) et le lupéol (5) était élevé et n’a pas pu être réduit en raison des difficultés à solubiliser ces composés dans le milieu de culture. Concernant les résultats du bioessai à 10 μM, l’IC50 de l’acide bétulinique (3) aurait théoriquement dû être supérieure à 10 μM mais cette différence mineure est inhérente à la détermination graphique de l’IC50.
[ ]
3.4. Évaluation de la cytotoxicité (CC50) et indice de sélectivité
Le tableau [ ] met en évidence les CC50 de 0 μM à 80 μM calculées pour les triterpènes de type lupane (1–5). Toutes les CC50 étaient supérieures à 80 μM et une vérification microscopique a été réalisée pour chaque puits. Les valeurs précises n’ont pas pu être déterminées car des problèmes de solubilité ont été rencontrés à des concentrations supérieures à 80 μM. Selon les résultats, la bétulone avait un indice de sélectivité plus élevé (supérieur à 29,6).
3.5. Calcul de l’absorption et de la perméation
À la lumière de la forte activité antiparasitaire de certains de ces triterpènes de type lupane, il apparaît important d’étudier les valeurs des paramètres critiques liés à leur utilisation potentielle comme antiparasitaires in vivo.
En conséquence, chacun des huit composés s’est avéré conforme à Lipinski puisque seul leur MlogP avait une valeur supérieure à la limite donnée par les règles de Lipinski. Cependant, leur capacité à être absorbés par le tractus gastro-intestinal est faible, et la simulation suggère également qu’ils ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique.
Ces données indiquent que malgré la forte activité antiparasitaire in vitro des triterpènes de type lupane mentionnés, un travail de pharmacomodulation et/ou de formulation sur les composés les plus actifs devra être réalisé pour améliorer les paramètres d’absorption et de perméation tout en maintenant une activité antiparasitaire satisfaisante.
3.6. Identification de la cible des composés les plus actifs par docking inverse
Une stratégie de docking inverse utilisant un jeu de données de protéines de T. gondii obtenu à partir de la Protein Data Bank a été réalisée pour identifier les cibles biologiques potentielles de la bétulone, de l’acide bétulonique, de l’ester méthylique de l’acide bétulonique et de l’acide bétulinique sur T. gondii, et ainsi obtenir une première suggestion du mécanisme d’action. La bétulone a d’abord été criblée seule sur les 87 protéines pour identifier les protéines les plus prometteuses pour le docking des trois autres composés. Le tableau [ ] présente les données relatives aux 10 clusters les plus pertinents identifiés à partir du docking de la bétulone ; le classement est opéré selon le scoring 2 (Éq. (2)) qui considère et compare la population du cluster, l’énergie libre de liaison, ainsi que le scoring 1 (Éq. (1)).
[ ]
Les valeurs du scoring 2 s’étendent entre 0,6577 et 0,7887 et peuvent donc être considérées comme proches. Pour réduire le nombre de protéines utilisées comme cibles dans les expériences de re-docking, une étude visuelle des 10 complexes a été réalisée avec le logiciel PyMol 2. La bétulone a été sélectionnée comme référence puisqu’elle montrait la meilleure activité in vitro. Les meilleurs complexes étaient censés présenter le ligand dans une cavité et montrer une liaison électrostatique avec la protéine. Les protéines avec les identifiants PDB 2O50, 3HZT et 3BYV correspondaient aux exigences et ont donc été sélectionnées. La protéine avec l’identifiant PDB 4JRN est équivalente à l’identifiant PDB 3BYV dans la région définie ; de plus, les poses du meilleur cluster de la bétulone étaient similaires dans les deux structures. En conséquence, la protéine avec l’identifiant PDB 4JRN n’a pas été retenue dans la sélection.
Sur la base des résultats précédents, les quatre composés les plus pertinents précédemment identifiés à partir des expériences in vitro (bétulone, acide bétulonique, ester méthylique de l’acide bétulonique et acide bétulinique) ont été soumis à des simulations de docking centrées sur le site de liaison précédemment identifié pour les trois protéines. Ce docking affiné a été réalisé avec 150 exécutions AutoDock pour mieux qualifier les poses. Les résultats sont présentés dans le tableau [ ]. La population élevée et la faible énergie libre de liaison des différents complexes suggèrent une forte liaison entre les quatre ligands et les trois protéines. La valeur AutoDock supplémentaire de l’efficacité du ligand a été ajoutée pour aider à la sélection du meilleur complexe. Tous les composés et protéines ont montré une forte affinité. Le premier hit était le complexe ester méthylique de l’acide bétulonique-3HZT avec une efficacité de ligand de −0,39, suivi du complexe bétulone-3HZT avec une efficacité de ligand de −0,36. Les deux complexes cités sont décrits ci-dessous ainsi que le premier hit complexe bétulone-2O50 identifié dans le tableau [ ].
[ ]
Les meilleures efficacités de ligand ont été obtenues pour les complexes avec les ligands bétulone et ester méthylique de l’acide bétulonique (BAME) avec les protéines aux identifiants PDB 3HZT, 2O50 et 3BYV. Elles ont été visualisées avec PyMol [ ]. Chacun des ligands se trouvait dans une zone repliée qui pouvait être assimilée à une poche (voir les encarts de la figure [ ]). De plus, la bétulone et le BAME se trouvaient systématiquement dans le site de liaison des ligands originaux pour les identifiants PDB 3HZT et 2O50, ce qui garantit que les ligands étaient dockés dans une zone d’intérêt. Cette comparaison n’était pas possible avec l’identifiant PDB 3BYV puisqu’il ne possède pas de ligand co-cristallisé.
La visualisation PyMol du complexe protéine BAME et identifiant PDB 3HZT montre que le BAME était situé dans une poche dans laquelle le ligand co-cristallisé (identifiant PDB J60) est également situé dans la structure originale 3HZT [ ]. Dans les 3 Å, l’outil d’analyse d’interaction a indiqué un contact polaire entre la cétone en position 3 et le résidu GLU-160. Dans les 3,5 Å, le méthyl ester en position 28 et le groupe isopropyle en position 19 du BAME semblent interagir fortement avec les résidus de la cavité ainsi que les groupes CH₂ et CH₃ du squelette lupane. Cela suggère de fortes interactions entre le BAME et la protéine. Ces observations renforcent les conclusions tirées des résultats présentés dans le tableau [ ] : il existe une forte affinité entre le BAME et la protéine à l’identifiant PDB 3HZT.
Le complexe bétulone-3HZT a montré la deuxième meilleure énergie libre de liaison égale à −11,52 kcal/mol et correspondait à une population de cluster de 149. La visualisation du complexe avec PyMol a montré que la bétulone était placée dans la même cavité que le BAME mais était inversée dans le sens de la longueur [ ]. Malgré cela, la bétulone montrait toujours de fortes interactions avec ce récepteur [ ]. Dans les 3 Å, des contacts polaires ont pu être déterminés entre la cétone en position C3 et GLN-367, et une zone polaire a été définie entre l’hydroxyle C18 et les résidus GLU-154/VAL-155/TYR-156. Un contact non polaire a été établi entre le groupe méthyle en position 27 et le résidu VAL-90. Enfin, de nombreux contacts supplémentaires ont été identifiés dans les 3,5 Å. Puisque le ligand peut se déplacer dans la cavité, ces contacts fournissent une forte interaction entre la bétulone et la protéine.
[ ]
Enfin, l’interaction entre la bétulone et l’identifiant PDB 2O50 a été étudiée puisqu’il s’agissait du premier résultat obtenu avec le processus de docking inverse [ ]. Dans les 3 Å, la visualisation PyMol du complexe bétulone-2O50 [ ] a mis en évidence des interactions électrostatiques entre le résidu ARG-184 et la cétone en C3 de la bétulone et entre les résidus PRO-187/GLY-188 et le CH₂–OH en position 28 de la bétulone. Dans les 3,5 Å, le squelette lupane semble interagir avec la protéine et un empilement pi est même supposé avec une tyrosine. Avec le squelette, la cétone et les fonctions CH₂–OH semblent stabiliser la bétulone dans la cavité.
4. Discussion
Dans une étude précédente, nous avons démontré que l’extrait à l’n-heptane de l’écorce de Alnus glutinosa avait une activité anti-Toxoplasma gondii. Un fractionnement bio-guidé réalisé par chromatographie de partage centrifuge et déréplication basée sur la RMN ¹³C a montré que les fractions actives étaient principalement composées de triterpènes de type lupane. En conséquence, six triterpènes ont été isolés de ces fractions riches en triterpènes (bétuline, bétulinaldéhyde, acide bétulinique, bétulone, lupéol et lupénone) mais seuls les cinq premiers composés ont été testés. La β-sitosténone a également été isolée puisqu’elle était un constituant majeur des fractions actives, mais elle n’a révélé aucune activité spécifique. Leur évaluation antiparasitaire contre T. gondii indique que la bétulone a montré la plus forte activité avec une IC50 de 2,7 μM, tandis que le lupéol (5) avait l’IC50 la plus élevée à 13,8 μM. Les indices de sélectivité étaient tous supérieurs à 5,8, mais comme les composés n’étaient pas solubles à une concentration supérieure à 80 μM dans le protocole, les IS n’ont pas pu être mesurés précisément. Néanmoins, la CC50 de la bétuline sur les cellules Vero a précédemment été déterminée à 164 μM. Ainsi, dans notre contexte, l’IS de la bétulone pourrait être supérieur à 29. Seuls quelques articles rapportent le potentiel anti-T. gondii des triterpènes et la plupart d’entre eux présentent une activité plus faible que celle obtenue dans cette étude. Par exemple, l’acide maslinique – un triterpène de type oléanane – montre une LD50 de 53,8 μM pour T. gondii et une LD50 de 236,6 μM pour les cellules Vero. Cela suggère que les triterpènes de type lupane ont un potentiel anti-T. gondii plus élevé que les autres types de triterpènes. Cela peut être rapproché des conclusions rapportées par Gachet et al. soulignant que la bétulone (2) possède des activités pharmacologiques intéressantes en particulier sur la souche Plasmodium falciparum K1, un autre apicomplexe, avec une IC50 de 3,0 μM et un IS de 7,4.
La bétuline et surtout ses oxo-dérivés (bétulone, aldéhydes bétulinique et bétulonique, et acides bétulinique et bétulonique) ont des propriétés biologiquement actives précieuses qui ont été précédemment rapportées. Par exemple, l’acide bétulinique et ses dérivés présentent des activités anticancéreuse, anti-VIH, antivirale, anti-inflammatoire, antiseptique, antimicrobienne, antipaludique, anti-leishmaniose, anthelminthique et fongicide, tandis que l’acide bétulonique montre des effets anti-inflammatoire, antimélanome et antiviral prononcés. Les 3-oxo dérivés de la bétuline – la bétulone et ses dérivés – présentent des propriétés antitumorale, anti-inflammatoire, antiparasitaire et anti-VIH. Domínguez-Carmona et al. ont montré que l’oxydation du groupe hydroxyle en C3 de la bétuline pour produire de l’acide bétulonique entraînait une augmentation significative de l’activité leishmanicide contre L. amazonensis. Dans notre étude, nous avons observé que la présence de fonctions cétone et hydroxyle en C3 et C28, respectivement, correspondant à la bétulone, renforçait l’activité anti-T. gondii. Deux composés commerciaux, l’acide bétulonique et l’ester méthylique de l’acide bétulonique, ont ensuite été testés pour valider cette hypothèse et ils ont montré des IC50 de 4,3 μM et 3,1 μM, respectivement, sans cytotoxicité à 80 μM sur les cellules Vero. Cela a confirmé que la cétone en C3 améliore la capacité des triterpènes de type lupane à inhiber la croissance de T. gondii. Da Cunha et al. ont montré qu’à la concentration de 50 μM, l’inhibition de L. donovani, qui était de 35,0 % et 39,8 % avec la bétuline et l’acide bétulinique, respectivement, atteignait 97,6 % avec l’acide bétulonique. Isah et al. ont également montré que la modification structurale, en particulier en C3 et C27 du squelette parent des triterpènes pentacycliques, améliorait l’activité antiparasitaire dans certains cas et entraînait une perte d’activité dans d’autres. Tous ces résultats confirment que la cétone en C3 et l’hydroxyle ou l’aldéhyde en C28 améliorent la capacité des triterpènes de type lupane à inhiber la croissance du parasite.
Pour étudier le mécanisme d’action de la bétulone sur T. gondii, une étude de docking inverse de la bétulone sur 87 protéines a été réalisée, mettant en évidence une forte interaction entre la bétulone et trois protéines de T. gondii identifiées comme CDPK3 (identifiant PDB 3HZT), ENR (identifiant PDB 2O50) et un domaine kinase de rhoptrie ROP8 (identifiant PDB 3BYV). Ces protéines ne se trouvent pas dans le corps humain, ce qui est intéressant en termes de sélectivité vers des cibles biologiques parasitaires plutôt qu’humaines. CDPK3 est une protéine kinase dépendante du calcium impliquée dans la voie de signalisation calcique spécifique chez les plantes et les apicomplexes. L’inhibition de cette protéine pourrait conduire à l’altération de la motilité, de l’invasion cellulaire et à la perturbation de la sortie (egress). Il n’existe que peu de publications décrivant l’activité des triterpènes pentacycliques sur la CDPK. Néanmoins, l’une d’elles mentionne que les dérivés de l’acide ursolique sont actifs contre T. gondii in vivo en inhibant la prolifération du parasite dans la cavité abdominale de la souris et, dans la même publication, Luan et al. ont identifié CDPK1 (identifiant PDB 6BFA) comme cible potentielle. Cette protéine est également impliquée dans la régulation de la sortie de T. gondii tout comme CDPK3. Ces deux résultats soutiennent l’hypothèse que CDPK3 est une cible potentielle des triterpènes de type lupane.
Les énoyl-acyl carrier protein réductases (ENR) sont fortement impliquées dans la synthèse des acides gras de type II et sont considérées comme essentielles à la survie des bactéries et des protozoaires. C’est une cible trouvée dans les médicaments antibactériens à spectre étroit. La voie de biosynthèse des acides gras de type II de type procaryote chez T. gondii est une cible moléculaire validée chez les tachyzoïtes, elle est essentielle à la survie du parasite in vitro et in vivo. En particulier, l’enzyme énoyl-réductase (ENR), qui catalyse la dernière étape réductrice de la voie de synthèse des acides gras de type II, est présente à tous les stades du cycle de vie de T. gondii sauf les microgamètes, et les ENR d’autres organismes peuvent être la cible d’un large éventail d’inhibiteurs puissants. Fait important, les composés qui inhibent la synthèse des acides gras de type II (y compris le triclosan et plusieurs composés nouvellement conçus et synthétisés) non seulement inhibent la croissance des tachyzoïtes de T. gondii, mais sont également efficaces contre d’autres parasites apicomplexes, tels que Plasmodium. L’ENR est inhibée par le composé antibactérien triclosan qui inhibe la croissance in vitro de T. gondii avec une IC50 de 3,0 μM. Le triclosan s’est avéré inhiber la croissance de P. falciparum avec une IC50 de 1 μM. La co-localisation de la bétulone et du triclosan dans le site de liaison de l’ENR est cohérente avec la forte affinité probable entre la bétulone et l’ENR.
L’identifiant PDB 3BYV se réfère au domaine kinase de l’antigène de rhoptrie ROP8. Les rhoptries peuvent être libérées dans la cellule hôte lors du processus d’internalisation. Même si le mécanisme n’est pas bien connu, ces protéines pourraient participer à une brèche momentanée dans la membrane cytoplasmique de la cellule hôte. Selon Qiu et al., cette structure cristalline aux rayons X était catalytiquement inactive mais reste un modèle pour l’étude de la kinase majeure ROP18. L’interaction entre les triterpènes pentacycliques et ROP8 n’avait jamais été rapportée auparavant.
Pour les trois protéines, il existe de nombreux arguments qui prouvent que le niveau d’oxydation en C3 de la bétulone joue un rôle majeur dans les interactions protéine-ligand, ce qui peut expliquer les résultats in vitro obtenus dans le cadre de ce travail. L’hydroxyle en C28 de la bétulone interagit également avec les acides aminés de CDPK3 et ENR, mais à ce jour il n’existe aucune preuve pour soutenir une interaction avec ROP8.
En conclusion, cet article a mis en évidence l’activité anti-T. gondii des triterpènes de type lupane isolés de l’écorce d’aulne noir et la forte activité de la bétulone. La chimiosensibilité de T. gondii aux triterpènes isolés a mis en évidence l’importance de la cétone en position C3 et de l’hydroxyle en C28. Le docking inverse suggère que CDPK3, ENR et ROP8 sont des cibles potentielles pour la bétulone, et l’analyse des interactions a confirmé le rôle des fonctions en C3 et C28 déduit des études préliminaires de relation structure-activité. D’autres études de docking pourraient être menées sur les trois protéines avec des dérivés de triterpènes de type lupane qui présentent une cétone en C3 et diverses fonctions en C28 pour approfondir l’étude du potentiel anti-toxoplasmose des triterpènes de type lupane. De plus, puisque ces composés ne peuvent pas être correctement absorbés par le tractus gastro-intestinal ni traverser la barrière hémato-encéphalique, les candidats devraient être pharmacomodulés pour améliorer ces paramètres avant les études in vivo. En parallèle, des études complémentaires devraient être menées pour développer des formulations galéniques incluant par exemple des triterpènes micro-encapsulés afin de surmonter les problèmes de solubilité.
5. Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts associé à cette publication.