Analyse chimique et activité anthelminthique contre Teladorsagia circumcincta d’extraits d’écorces nordiques in vitro (Betula pubescens)
Référence : Frontiers in Veterinary Science 2021. — PMID 34150887 · DOI 10.3389/fvets.2021.666924 Type : etude in vitro · Plante : Bouleau pubescent · Propriété → Antiparasitaire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale, section par section ; figures/tableaux rendus « [ ] ». Appels [n] omis.
Résumé
Les infections parasitaires par helminthes sont fréquentes chez les petits ruminants en Norvège ; l’infection est habituellement traitée par des médicaments anthelminthiques, mais la résistance aux anthelminthiques est un problème croissant. Il est nécessaire d’identifier des stratégies pour réduire l’usage des anthelminthiques et atténuer l’impact de la résistance. Des fourrages riches en tanins condensés (TC) ont montré leur capacité à réduire la charge en helminthes chez les petits ruminants, mais ces fourrages ont un potentiel de culture limité en Scandinavie. Une bonne source de TC dans les régions au climat froid pourrait être l’écorce de plusieurs espèces d’arbres exploitées commercialement. Dans la présente étude, nous avons déterminé la teneur et caractérisé le type de TC dans des extraits d’écorce de pin (Pinus sylvestris L.), d’épicéa (Picea abies L.) et de bouleau (Betula pubescens). Des extraits de certains échantillons d’écorce ont été testés pour leur efficacité anthelminthique contre le nématode infectieux ovin Teladorsagia circumcincta. La teneur totale en TC était plus élevée dans l’écorce des arbres plus jeunes (10 à 40 ans) de pin et d’épicéa ; elle diminuait avec l’âge de l’arbre chez le pin, tandis qu’elle restait relativement stable dans l’écorce de l’épicéa et du bouleau. Le pin était composé à 100 % de procyanidines, tandis que des prodelphinidines étaient présentes dans la plupart des échantillons d’épicéa (4 à 17 %) et dans tous les échantillons de bouleau (5 à 34 %). Nos études ont clairement montré qu’il existe une variation de l’activité anthelminthique des extraits aqueux et acétoniques d’échantillons d’écorce collectés en divers sites de Norvège, telle que mesurée par deux tests in vitro indépendants, le test d’éclosion des œufs et le test de motilité larvaire. L’activité anthelminthique de certains extraits était cohérente entre les deux tests ; par exemple, les extraits des trois échantillons à plus forte teneur en TC ont montré une très forte activité dans les deux tests, tandis que l’extrait de l’échantillon à plus faible teneur en TC a montré la plus faible activité dans les deux tests. Pour d’autres extraits, l’activité n’était pas cohérente entre les tests, ce qui pourrait être attribué à la sensibilité des différents stades du cycle de vie parasitaire. Nous avons démontré que les extraits d’écorce d’arbres exploités commercialement en Scandinavie ont le potentiel d’être utilisés comme alternatives aux anthelminthiques. Les travaux ultérieurs devraient se concentrer sur l’affinement des associations entre extraits d’écorce et activité anthelminthique afin d’identifier les meilleures stratégies pour réduire l’apport d’anthelminthiques dans les systèmes de production animale.
Introduction
Des recherches récentes ont montré qu’il existe une fréquence de traitement élevée par des anthelminthiques chez les agneaux en Norvège, en particulier dans les zones côtières, ce qui pourrait être responsable du développement de la résistance aux anthelminthiques. Des stratégies pour prévenir les infections par helminthes sont nécessaires afin de réduire les traitements anthelminthiques. L’inclusion alimentaire de plantes ou de compléments contenant des tanins condensés (TC) pourrait être l’une de ces stratégies, car il a été montré que les TC ont une activité anthelminthique. Les TC sont des polymères flavonoïdes complexes largement répandus dans les plantes supérieures ainsi que dans l’écorce des bois durs et des bois tendres. De nombreux fourrages riches en TC couramment étudiés dans d’autres parties du monde, tels que le lotier corniculé (Lotus corniculatus), le sulla (Hedysarum coronarium), le lespedeza (Lespedeza cuneata) et le sainfoin (Onobrychis viciifolia), présentent des limitations de culture en Norvège. Cependant, les pays nordiques disposent d’une forte industrie forestière et de scieries, qui produisent une vaste quantité d’écorce comme sous-produit. En particulier l’écorce de bois tendre, riche en TC, est éliminée comme combustible ou utilisée en horticulture. Exploiter l’usage potentiel de l’écorce comme complément alimentaire pour les ruminants rendrait l’industrie du bois plus viable économiquement, tout en offrant une stratégie pour atténuer l’impact de la résistance aux anthelminthiques en vue d’un contrôle parasitaire durable.
Il existe très peu de données sur les effets antiparasitaires de l’écorce et des TC extraits des arbres, mais une étude de Min et collaborateurs a montré que l’inclusion alimentaire d’écorce de Pinus taeda L., une espèce présente aux États-Unis d’Amérique, améliorait les performances animales et réduisait le comptage d’œufs fécaux et la concentration en ammoniac ruminal chez des chèvres mâles en croissance. De plus, Williams et al. ont observé des effets anthelminthiques directs des TC de l’écorce de Pinus sylvestris contre le nématode parasite Ascaris suum, prévalent chez le porc et l’humain. À notre connaissance, il n’existe pas de données publiées sur la concentration et le type de TC dans l’écorce des espèces d’arbres communes en Norvège, bien qu’une étude récente ait montré qu’il existe une variation de la production de tanins dans des cultures de cellules issues de plantes nordiques. Dans cette étude, nous avons cherché à (1) quantifier la concentration et déterminer le type de TC dans l’écorce fraîche provenant de sites d’abattage ainsi que dans des échantillons de scieries commerciales, et (2) tester l’activité anthelminthique in vitro d’extraits d’écorce sélectionnés contre Teladorsagia circumcincta, un nématode parasite de la caillette commun chez le mouton et la chèvre.
Matériel et méthodes
Échantillonnage de l’écorce
Vingt-neuf échantillons d’écorce ont été collectés pour l’étude. L’écorce de pin sylvestre (Pinus sylvestris L., n = 8), d’épicéa commun (Picea abies L., n = 8) et de bouleau pubescent (Betula pubescens Ehrh., n = 6) a été prélevée sur des arbres abattus de janvier à avril 2013 en différents lieux de la municipalité de Tingvoll. Les échantillons ont été prélevés dans les parties basse et haute du tronc, et l’âge de l’arbre a été estimé par datation des cernes. Des échantillons supplémentaires d’écorce de pin sylvestre (trois échantillons) et d’épicéa commun (quatre échantillons) ont été fournis par les scieries MøreTre AS (Surnadal) et Kjeldstad Sagbruk & Høvleri AS (Selbu), respectivement. Tous les échantillons d’écorce étaient composés à la fois d’écorce interne et externe (non séparées). Les échantillons ont été séchés à 65 °C pendant 48 h, coupés en petits morceaux et homogénéisés pour passer un tamis de 0,5 mm à l’aide d’un broyeur à rotor (Retsch Ultra Centrifugal Mill ZM 200) avant extraction.
Analyse des tanins condensés
Les TC existent à la fois sous forme libre et liée dans l’écorce. Les TC libres peuvent être extraits par de l’acétone aqueuse, du méthanol aqueux ou de l’eau chaude alcaline, tandis que les TC non extractibles (ou liés) nécessitent un prétraitement chimique ou enzymatique, par exemple une thiolyse, pour être libérés.
Détermination des TC totaux
Tous les échantillons d’écorce ont été analysés pour leur teneur totale en TC (TC libres plus liés) par chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à un détecteur à barrette de diodes (PDA) après thiolyse, c’est-à-dire une dépolymérisation des TC en présence d’un nucléophile (cystéamine), au laboratoire de recherche en biotechnologie et alimentation de l’Institut LUKE des ressources naturelles de Finlande. En bref, 10 mg d’échantillon d’écorce homogénéisé ont été pesés dans un tube Eppendorf et 1 ml de réactif de thiolyse [3 g de cystéamine + 56 ml de méthanol + 4 ml d’HCl aqueux (37 %)] a été ajouté. L’échantillon a été placé au bain-marie à 65 °C pendant 60 min, puis refroidi sur glace pendant 5 min. L’échantillon a été homogénéisé à l’aide d’un mélangeur Whirli et filtré (filtre-seringue en cellulose régénérée 0,45 μm) dans un flacon CLHP puis analysé immédiatement. Durant la réaction de thiolyse, les liaisons de type B des TC ont été rompues. Les unités d’extension ont été libérées sous forme de dérivés flavanol-cystéamine tandis que les unités terminales ont été libérées sous forme de monomères flavanols libres non dérivés. Ces unités ont été déterminées individuellement par CLHP-PDA et sommées en teneur totale en TC. Les liaisons de type A sont restées intactes et ont produit des dimères ou des oligomères supérieurs, distinguables des flavanols monomériques par des pics caractéristiques lors de la chromatographie. Chaque échantillon a été analysé en triplicat par CLHP-PDA sur une colonne en phase inverse Inertsil ODS-3 (GL Sciences Inc., Torrance, CA) (150 × 4,0 mm d.i., 3 μm). La phase mobile était composée de (A) acide phosphorique 50 mM (aqueux), pH 2,5, ajusté par NaOH, et (B) acétonitrile. L’élution a débuté de manière isocratique à un débit constant de 5 % de B dans A, 5 min, suivi de 5 à 20 % de B dans A, 5 à 35 min ; 20 à 50 % de B dans A, 35 à 45 min ; et 50 % de B dans A, 45 à 50 min. La séparation a été suivie par PDA à λ1 = 270 nm pour l’(épi)gallocatéchine et λ2 = 280 nm pour l’(épi)catéchine et leurs dérivés cystéaminyl. Des étalons de référence (gallocatéchine, épigallocatéchine, catéchine, épicatéchine, procyanidine B2, procyanidine A2) ont été achetés chez Extrasynthese (Lyon, France) et utilisés pour établir des courbes d’étalonnage externes pour la quantification. Les dérivés cystéaminyl des (épi)gallocatéchines ont été quantifiés à l’aide des courbes d’étalonnage de l’(épi)gallocatéchine. Les dérivés cystéaminyl des (épi)catéchines ont été quantifiés à l’aide de la courbe d’étalonnage de la cystéaminyl-épicatéchine générée à partir de la procyanidine B2 thiolysée. Les dimères de type A et leurs dérivés cystéaminyl ont été déterminés par rapport à la procyanidine A2. Un chromatogramme représentatif est présenté en [ ]. Comme les oligomères de TC de l’écorce ont été clivés en monomères pendant la thiolyse, la taille nominale des polymères de TC — ou degré de polymérisation (DP) — n’a pas pu être déterminée, mais le degré moyen de polymérisation a été calculé en divisant la quantité totale de TC par la quantité d’unités terminales.
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Détermination des TC libres
Les échantillons d’écorce sélectionnés pour le test anthelminthique in vitro ont été en outre analysés pour leur teneur en TC libres à l’aide d’une méthode gravimétrique de précipitation à l’ytterbium (Yb). Les TC extractibles ont été extraits avec de l’acétone à 70 %, selon une méthode précédemment décrite. Après élimination de l’acétone, la solution aqueuse a été lavée trois fois à l’éther de pétrole. Les traces de solvant dans la phase aqueuse ont été éliminées sous vide avant de la laver trois fois avec des quantités égales d’acétate d’éthyle. Les traces d’acétate d’éthyle dans la phase aqueuse ont été éliminées sous vide. La solution restante a été séparée en portions de 50 mL. De l’acétate d’ytterbium(III) (1 M, 2 ml) a été ajouté à la solution aqueuse et conservé une nuit à 5 °C. Le lendemain, la solution conservée a été centrifugée à 3 590 tr/min pendant 10 min à 5 °C. Le culot formé a été lavé et recentrifugé deux fois avec de l’acétone à 70 % et une fois avec de l’acétone pure, puis séché sous vide. La précipitation sèche TC-ytterbium a été pesée et calcinée à 800 °C au brûleur, au-dessus de la flamme oxydante, jusqu’à ce que la poudre noire se transforme en cendre grise. Avant de mesurer le poids de la cendre, la coupelle a été refroidie à température ambiante dans un dessiccateur et la quantité totale de TC libres a été corrigée pour la cendre de Yb(III).
Préparation des extraits d’écorce pour le test anthelminthique in vitro
À la suite de l’analyse chimique des 29 échantillons d’écorce initiaux collectés pour l’étude, 10 échantillons d’écorce ont été sélectionnés sur la base de la teneur et du type de TC pour le test anthelminthique in vitro. L’objectif était de couvrir les trois espèces d’arbres ; nous avons donc inclus des échantillons d’écorce de pin, d’épicéa et de bouleau à teneur faible et élevée en TC et à proportions variables de PC et de PD. Deux types d’extraits d’écorce ont été préparés à partir de ces 10 échantillons d’écorce pour tester l’activité anthelminthique des TC : des extraits acétoniques et aqueux. Une solution d’acétone aqueuse à 70 % est le solvant de choix pour l’extraction des TC ; de tels extraits de TC ont été précédemment utilisés dans des études parasitologiques. Pour les obtenir, 1 g d’échantillon d’écorce séchée a été ajouté à 20 ml d’acétone à 70 % et soniqué (sonicateur à sonde) dans de la glace pendant 20 s. Cette étape a été suivie d’une agitation de 4 min. Cette procédure a été répétée cinq fois, et l’homogénat a été filtré sur Miracloth (Millipore, Royaume-Uni). Le filtrat a ensuite été placé dans un évaporateur rotatif jusqu’à évaporation complète de l’acétone ; l’extrait a été remis en suspension dans 20 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1 %.
L’extraction à l’eau chaude a été incluse dans cette étude comme la procédure d’extraction la plus simple et par conséquent celle qui pourrait être privilégiée par l’industrie. Bien que l’eau ne soit pas le solvant préféré pour l’extraction des TC, l’eau chaude peut extraire les TC libres. Pour obtenir les extraits aqueux, 1 g d’échantillon d’écorce sèche a été ajouté à 20 ml d’eau, chauffé à 80 °C et agité sur un agitateur magnétique pendant 30 min. L’homogénat a ensuite été filtré sur Miracloth (Millipore, Royaume-Uni) ; l’extrait a été remis en suspension dans 20 ml de DMSO à 1 %. Les extraits aqueux et acétoniques de chaque échantillon ont été testés avec les tests décrits ci-dessous. Les deux tests parasitologiques in vitro ont été sélectionnés car ils sont couramment utilisés pour évaluer l’efficacité anthelminthique des médicaments et des extraits végétaux.
Tests d’éclosion des œufs
Un test d’éclosion des œufs a été utilisé pour évaluer l’efficacité anthelminthique des extraits d’écorce sélectionnés. Des œufs de Teladorsagia circumcincta ont été isolés par une technique de flottation à partir de fèces fraîchement collectées provenant de moutons donneurs infectés de manière monospécifique par le nématode de la caillette. Après leur isolement, les œufs ont été lavés à l’eau distillée pour éliminer tout débris et quantifiés par ml de suspension. Cent à 150 œufs ont été ajoutés dans chaque puits de plaques à 24 puits, à des volumes n’excédant pas 500 μl ; selon la concentration d’œufs dans la suspension, de l’eau distillée a été ajoutée pour atteindre les volumes appropriés. Un volume égal d’extrait d’écorce a été ajouté à chaque puits. Dans les témoins négatifs, de l’eau distillée a été ajoutée au lieu d’un extrait d’écorce. Les plaques ont été cultivées à 20 °C pendant 48 h. L’éclosion a été stoppée par l’ajout d’iode helminthologique (10 g d’iode, 50 g d’iodure de potassium (KI), 100 ml d’eau désionisée en dilution au ¼) aux échantillons, et les nombres d’œufs et de larves de premier stade présents ont été comptés dans chaque puits. Chaque extrait végétal a été testé en triplicat à 2 % de concentration (1 g d’extrait dans 20 ml de DMSO à 1 %), et les expériences ont été répétées. Le pourcentage d’éclosion a été calculé comme nombre de larves de premier stade / (nombre de larves de premier stade + nombre d’œufs par puits).
Tests de motilité larvaire
Un test de motilité larvaire à haut débit a été utilisé pour évaluer l’efficacité anthelminthique des extraits d’écorce sélectionnés. L’analyseur cellulaire en temps réel DP xCELLigence, qui mesure des signaux basés sur l’impédance électrique à travers des microélectrodes interdigitées intégrées au fond de plaques E de culture tissulaire, avait précédemment été mis au point pour diagnostiquer la résistance aux anthelminthiques. Des larves de troisième stade (larves infectieuses) de T. circumcincta ont été récupérées à partir de cultures fécales de moutons donneurs infectés de manière monospécifique après une période d’incubation de 10 jours à 20 °C. Une suspension larvaire [3 000 L3 par 100 μl de tampon phosphate salin (PBS)] a été ajoutée aux puits des plaques E, et l’impédance a été suivie toutes les 15 s, pendant 24 h à 37 °C. Toutes les larves utilisées dans les expériences étaient fraîchement produites (dans les 3 mois suivant le développement au stade L3). À la fin de cette période, les extraits d’écorce ont été ajoutés dans tous les puits à la concentration de 2 % (1 g d’extrait dans 20 ml de DMSO à 1 %), sauf dans les puits témoins négatifs, où du DMSO à 1 % a été ajouté ; ces puits servaient de témoins négatifs, et l’attente était que ces larves seraient maintenues vivantes jusqu’à la fin de l’expérience. Outre les témoins négatifs, des témoins positifs (larves mortes, congelées et maintenues à −20 °C pendant un mois) ont également été inclus dans trois puits. Les puits contenant des larves mortes ont reçu des extraits d’écorce après 24 h, afin de permettre le test de notre hypothèse (voir ci-dessous). Des puits sans vers ont également été inclus comme témoins techniques. Tous les témoins étaient présents dans toutes les expériences. Les signaux d’impédance ont été suivis au total pendant 48 h (24 h avant et 24 h après l’ajout de l’extrait) avant l’arrêt des expériences. Chaque traitement a été réalisé en triplicat (réplicat technique). Les données d’impédance ont été analysées et un indice de motilité a été calculé comme décrit par Smout et al. Les données de l’indice de motilité ont été utilisées pour l’analyse statistique décrite ci-dessous.
Analyse statistique
Les analyses statistiques sur la concentration totale en TC de l’écorce et le degré de polymérisation ont été réalisées à l’aide d’une procédure de modèle mixte dans SAS (version 9.4 ; SAS Institute Inc., Cary, NC). La variable catégorielle Espèce d’arbre (bouleau, pin et épicéa) et la variable continue âge de l’arbre ainsi que leur interaction ont été incluses comme effets fixes, et l’effet du Lieu a été traité comme effet aléatoire. Les moyennes des moindres carrés (LSmeans) ont été utilisées pour comparer les moyennes par « Espèce », et le test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisé pour déterminer la différence significative (P < 0,05) entre traitements. L’instruction « estimate » de la procédure de modèle mixte de SAS a été utilisée pour obtenir les ordonnées à l’origine et les pentes spécifiques à chaque espèce d’arbre, et l’approximation de Satterthwaite a été utilisée pour déterminer les degrés de liberté du dénominateur pour le test des effets.
Toutes les expériences d’éclosion des œufs ont été dupliquées, et les expériences ont été incluses dans le modèle comme bloc. Les données d’éclosion des œufs ont été analysées par ANOVA à un facteur, avec le traitement comme facteur. Les données de motilité larvaire ont été moyennées avant (24 h) et après l’ajout de l’extrait d’écorce (24 h). Les données de motilité après l’ajout de l’extrait d’écorce ont été analysées par ANOVA à un facteur, avec les données de motilité avant l’ajout des extraits d’écorce utilisées comme covariable. Le type d’extrait d’écorce (aqueux ou acétonique) a été inclus dans le modèle comme facteur fixe. Chaque expérience avait la configuration suivante : larves vivantes traitées avec l’extrait aqueux ou acétonique du même échantillon, larves témoins mortes également traitées avec les deux extraits du même échantillon, témoins vivants, laissés non traités tout au long, et puits témoins sans vers (n = 3). Les lectures du traitement témoin sans vers n’ont pas été incluses dans le modèle statistique car elles n’étaient incluses dans l’expérience que comme témoins techniques. Notre hypothèse nulle était que la motilité des larves exposées aux extraits d’écorce était significativement différente (P < 0,05) de celle des larves témoins mortes. C’était la comparaison la plus appropriée car l’environnement était le même dans ces traitements (larves vivantes traitées avec des extraits d’écorce et larves mortes traitées avec des extraits d’écorce).
Résultats
Tanins condensés dans les échantillons d’écorce
Les échantillons d’écorce de pin et d’épicéa étaient composés à la fois d’écorce interne et externe, et l’écorce homogénéisée des arbres plus âgés (> 60 ans) présentait un rapport écorce externe/interne plus élevé et une apparence brun foncé, comparée à l’écorce homogénéisée des arbres plus jeunes, qui avait une apparence jaune. L’âge de l’arbre n’a pas affecté la variation de couleur des échantillons d’écorce de bouleau homogénéisée.
Les LSmeans de la teneur totale en TC de l’écorce, c’est-à-dire les TC libres et liés déterminés par la méthode chromatographique, étaient de 72,2 (ET 8,7), 47,2 (ET 13,6) et 46,8 (ET 5,7) mg/g d’écorce chez le pin, le bouleau et l’épicéa, respectivement. Le test de Tukey a révélé que la teneur était significativement plus élevée chez le pin que chez l’épicéa, tandis qu’il n’y avait pas de différences significatives entre pin et bouleau ni entre épicéa et bouleau. Il y avait une interaction significative entre l’âge des arbres et l’espèce sur la teneur en TC (P = 0,047) ; la teneur totale en TC diminuait [−0,92 (ET 0,328) mg/g d’écorce par an] avec l’âge de l’arbre chez le pin [ ]. Pour les deux autres espèces, il n’y avait pas d’effets significatifs de l’âge sur la teneur totale en TC de l’écorce.
[ ] Seules des procyanidines (PC ; catéchine et épicatéchine) — et non des prodelphinidines (PD ; gallocatéchine et épigallocatéchine) — ont été détectées dans les échantillons d’écorce de pin. Les procyanidines étaient également les plus prédominantes chez l’épicéa, mais des prodelphinidines ont été détectées à hauteur de 4 à 17 % des TC totaux dans 8 échantillons d’épicéa sur 12. Des prodelphinidines ont été détectées dans tous les échantillons d’écorce de bouleau, constituant 5 à 34 % de la teneur totale en TC. L’épicatéchine était la procyanidine prédominante chez toutes les espèces. Le rapport épicatéchine:catéchine a été mesuré à 4:1 et 5:1 chez le pin et l’épicéa, respectivement, et à 2:1 chez le bouleau. Le degré moyen de polymérisation des TC était significativement plus élevé chez l’épicéa (8,2 ET 0,38) que chez le bouleau (5,7 ET 0,44) et le pin (6,6 ET 0,38).
Les caractéristiques des TC d’une sélection d’échantillons d’écorce (correspondant aux 10 échantillons testés pour les effets anthelminthiques) sont présentées dans [ ]. Les monomères de TC de l’écorce étaient principalement liés par des liaisons interflavaniques de type B (c’est-à-dire des liaisons carbone-carbone simples), mais quelques liaisons de type A (liaison éther interflavonoïde supplémentaire associée à une liaison de type B commune, < 1,3 %) ont été détectées dans les échantillons de pin (données non présentées dans [ ]). Le nombre moyen de monomères dans les oligomères de TC, donné par le degré moyen de polymérisation (DP), était d’environ 7 à 10 dans l’écorce d’épicéa, de cinq à sept dans l’écorce de pin, et de cinq à six chez le bouleau. L’écorce d’épicéa de Selbu (identifiant d’échantillon 61) avait l’une des plus grandes tailles moyennes de polymères et une teneur plus élevée en prodelphinidines (16,7 % des TC) que les autres échantillons d’écorce d’épicéa.
[ ] La proportion de TC extractible à l’acétone aqueuse, c’est-à-dire les TC libres déterminés par la méthode gravimétrique, variait entre 9 et 18 mg/g et constituait environ 17 à 29 % des TC totaux chez le pin (n = 3). Les TC libres semblaient plus élevés chez les arbres plus jeunes que chez les arbres plus âgés (15,6 mg de TC libres/g d’écorce chez les arbres de 40 ans contre 11,7 mg de TC libres/g d’écorce chez un arbre de 70 ans). La concentration en TC libres chez l’épicéa variait entre 6 et 18 mg/g, constituant 11 à 35 % de la quantité totale de TC (n = 2). La concentration en TC libres a été mesurée dans un seul échantillon de bouleau provenant d’un arbre de 40 ans et a été estimée à 25 mg de TC libres/g d’écorce.
Tests d’éclosion des œufs
Le pourcentage d’éclosion des œufs en conditions témoins était systématiquement compris entre 95 et 99 %. Globalement, l’incubation dans les extraits acétoniques a entraîné une éclosion moyenne de 11 % et dans les extraits aqueux de 20 %, bien que cette différence ne fût pas significative (P = 0,199). L’incubation dans les extraits aqueux ou acétoniques d’écorce a entraîné dans la plupart des cas une réduction significative de l’éclosion par rapport aux témoins [ ]. Les extraits des échantillons de pin ont montré une efficacité systématiquement élevée, les extraits acétoniques de la plupart des échantillons inhibant l’éclosion jusqu’à 100 % [ ]. L’incubation dans les extraits aqueux et acétoniques de bouleau 52 n’a pas affecté l’éclosion, tandis que les extraits de bouleau 3 ont significativement réduit l’éclosion par rapport aux témoins (P < 0,01), bien que l’ampleur de l’effet n’ait pas été la même que dans les extraits des échantillons de pin ou d’épicéa.
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Tests de motilité larvaire
Tout au long de la durée de toutes les expériences, la motilité des larves témoins vivantes était significativement plus élevée que celle des larves mortes (motilité : 0,012 contre 0,002, respectivement ; sed : 0,0002 ; P < 0,001). Nos données montrent que l’activité biologique des extraits était variable entre échantillons et entre extraits d’un même échantillon [ ]. Dans toutes les expériences, la motilité des larves vivantes traitées (après l’ajout de l’extrait d’écorce) était significativement différente de celle des larves témoins vivantes. Le [ ] présente l’ensemble complet des données et tous les traitements permettant de rejeter notre hypothèse. Notre hypothèse a été rejetée après l’incubation dans quatre extraits acétoniques et cinq extraits aqueux. La motilité des larves traitées avec des extraits acétoniques de deux échantillons de pin (2 et 12) et de deux échantillons d’épicéa (15 et 611) a été réduite au niveau des larves mortes. De même, l’incubation des larves dans les extraits aqueux de trois échantillons de pin (2, 12 et 41) et de deux échantillons d’épicéa (7 et 611) a entraîné une réduction de leur motilité au niveau des larves mortes. Aucun des extraits restants n’a entraîné de réduction de la motilité des L3 au niveau des larves mortes, bien que dans certains cas la motilité des L3 après l’ajout de l’extrait ait été bien inférieure à celle des témoins vivants [ ].
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Discussion
Concentration en tanins condensés dans les échantillons d’écorce
Dans la présente étude, nous avons déterminé la variation de la teneur en TC totaux et libres et caractérisé le type de TC dans les extraits d’écorce d’arbres nordiques, à savoir Pinus sylvestris L., Picea abies L. et Betula pubescens. Nous avons montré que l’âge de l’arbre est associé à la teneur en TC chez le pin, mais pas chez l’épicéa ni le bouleau. Nous avons quantifié l’efficacité anthelminthique des extraits d’écorce contre le nématode ovin Teladorsagia circumcincta et montré que certains extraits ont la capacité de réduire l’éclosion des œufs et la motilité larvaire à presque 100 %, ce qui confirme le potentiel de l’utilisation d’extraits d’écorce pour le contrôle parasitaire chez les ruminants.
Parmi les trois espèces d’arbres testées, les échantillons de pin ont montré un déclin de la teneur en TC totaux de l’écorce avec l’âge de l’arbre. Étant donné que les arbres plus âgés ont plus d’écorce externe que les arbres plus jeunes, on s’attend à ce que le rapport écorce externe:interne augmente avec l’âge. Des données antérieures ont montré que l’écorce externe contient des niveaux de TC plus faibles que l’écorce interne. Matthews et al. ont observé un déclin des TC libres dans l’écorce de pin avec l’augmentation de l’âge de l’arbre, dû à la liaison des TC de l’écorce externe morte à la lignocellulose. Une légère diminution de la teneur en TC libres avec l’âge a également été observée dans nos échantillons (de 16 à 11 mg de TC libres/g d’écorce), bien qu’il ne soit pas clair si la diminution des TC totaux avec l’âge était uniquement attribuable à la diminution des TC libres.
Communément, la plupart des TC des écorces d’arbres sont des oligomères de procyanidines, avec l’épicatéchine et la catéchine comme unités monomériques, suivies des prodelphinidines, constituées d’unités gallocatéchine et épigallocatéchine. Nos échantillons d’écorce de pin ne contenaient que des procyanidines, ce qui est corroboré par la littérature actuelle. Cependant, presque tous les échantillons d’écorce d’épicéa et de bouleau contenaient aussi à la fois des procyanidines et des prodelphinidines. Les procyanidines ont déjà été rapportées dans l’écorce de bouleau, tandis que les prodelphinidines ne l’avaient pas été, bien que les feuilles de Betula soient connues pour avoir un niveau élevé de prodelphinidines. L’épicatéchine était la procyanidine la plus prédominante dans nos échantillons ; l’écorce de pin et d’épicéa contenait quatre à cinq fois plus d’épicatéchine que de catéchine, tandis que l’écorce de bouleau contenait deux fois plus d’épicatéchine que de catéchine. Cela concorde avec les données de la littérature. Les échantillons d’écorce de pin contenaient les niveaux de TC les plus élevés (valeur moyenne de 5 % de TC totaux) comparés à l’épicéa et au bouleau, et les niveaux concordent avec les niveaux de 5 à 8 % de TC rapportés dans l’écorce interne de pin sylvestre et de 5 % dans l’écorce externe de pin.
Activité anthelminthique des extraits sélectionnés
Nos études ont clairement montré qu’il existe une variation de l’activité anthelminthique des extraits aqueux et acétoniques d’échantillons d’écorce collectés en divers sites de Norvège, telle que mesurée par deux tests indépendants. Nos données soutiennent une opinion précédemment exprimée selon laquelle l’activité anthelminthique des extraits acétoniques peut ne pas toujours être liée à la seule teneur en TC de ces extraits, ce qui nécessitera une investigation plus poussée. En outre, nous avons montré que différents stades des nématodes parasites peuvent varier dans leur sensibilité aux composés actifs contenus dans les extraits d’échantillons d’écorce.
L’éclosion des œufs a été significativement affectée par l’incubation dans la plupart des extraits acétoniques d’écorce. Bien que cette activité puisse être attribuée aux TC, d’autres composés peuvent aussi être en partie responsables de l’activité observée, en particulier car tous les échantillons testés ici n’avaient pas une teneur élevée en TC. Les résultats concordent ici avec des données antérieures où l’incubation dans des extraits purifiés d’écorce de pin (Pinus radiata) originaire de Nouvelle-Zélande a entraîné une réduction significative de l’éclosion des œufs et de la capacité de migration de T. circumcincta. Dans cette étude, des concentrations de TC totaux d’environ 2 mg/g ont entraîné une réduction de l’éclosion des œufs de 80 %. À l’exception de deux extraits, les concentrations de TC contenues dans nos extraits acétoniques dépassaient celles précédemment rapportées et pourraient être la raison de la forte ampleur de l’activité observée dans nos expériences d’éclosion des œufs.
Les deux extraits à plus faible teneur en TC testés ici avaient un schéma d’activité très différent. L’incubation des œufs dans les extraits d’épicéa 27 a significativement réduit l’éclosion par rapport aux témoins, tandis que l’incubation dans les extraits de bouleau 52 n’a pas affecté l’éclosion des œufs. Cette différence d’activité pourrait être attribuée au degré de polymérisation des TC dans les deux échantillons. Les TC présents dans l’échantillon d’épicéa 27 avaient le degré de polymérisation le plus élevé, ce qui n’était pas le cas des échantillons de bouleau 52. Nos données soutiennent des données antérieures où la taille des polymères semblait avoir une corrélation positive avec l’activité anthelminthique. Les deux échantillons diffèrent aussi par leur profil de TC, l’épicéa 27 ayant 100 % de PC, tandis que la teneur en PC du bouleau 52 est plus faible. Les données relatives à l’efficacité des PC par rapport aux PD sont rares et plutôt contradictoires. Les extraits de pin riches en PC étaient plus efficaces contre le développement des parasites que ceux riches en PD. D’autre part, des études antérieures ont montré que les PD pourraient être plus efficaces pour réduire l’exsheathment (dégainement) larvaire, l’alimentation et la motilité adulte in vitro. Il apparaît que la question de l’efficacité des monomères peut être plus complexe qu’on ne le pensait auparavant et peut aussi être affectée par d’autres facteurs, tels que la teneur totale en TC et le degré de polymérisation. La possibilité que d’autres composés soient responsables de l’activité de l’échantillon d’épicéa 27 ne peut être écartée.
Les résultats des tests de motilité larvaire ont montré que l’incubation des larves dans les extraits aqueux et acétoniques a entraîné une réduction de la motilité, d’intensité variable. Dans certains cas, les extraits aqueux ont montré une activité plus faible que les extraits acétoniques, comme les extraits de l’échantillon de pin 611. Dans d’autres cas, les extraits acétoniques ont montré une activité plus faible, comme les extraits de pin 41 et d’épicéa 27. Les trois échantillons contenant le plus de TC dans les extraits acétoniques étaient pin 2, pin 12 et épicéa 15. Fait intéressant, les larves incubées à la fois dans les extraits acétoniques et aqueux de ces échantillons ont réduit leur motilité au niveau des larves mortes. Bien que les TC n’aient pas été déterminés dans les extraits aqueux dans la présente étude, des données antérieures ont montré que les TC peuvent être extraits à l’eau chaude. Ces échantillons avaient la plus forte concentration de TC (73 à 85 mg TC/g d’écorce), de TC libres (14 à 18 mg de TC libres/g d’écorce), le degré moyen de polymérisation, et aucune PD. Par conséquent, il est possible que l’extraction à l’eau ait entraîné l’extraction de TC libres, responsable de l’activité.
L’activité anthelminthique de nombreux extraits était cohérente entre les deux tests. Les extraits des trois échantillons à plus forte teneur en TC ont montré une activité très cohérente dans les deux tests. De même, les échantillons de bouleau 59, à plus faible teneur en TC, n’ont montré aucune activité biologique contre aucun des stades parasitaires. Pour d’autres, l’activité n’était pas cohérente entre les tests. Par exemple, les extraits des échantillons de pin 9 et d’épicéa 7 ont montré une très forte activité contre les œufs, mais ce n’était pas le cas pour le test de motilité larvaire. Cette variation de l’ampleur des activités dans les deux tests pourrait être attribuée au stade du cycle de vie parasitaire. Sans surprise, les L3 sont apparues comme le stade le moins affecté, car les larves infectieuses sont la forme la plus résistante du parasite durant leur cycle de vie.
Ces résultats ont clairement montré que certains extraits d’échantillons d’écorce d’arbres originaires de Norvège ont une activité anthelminthique d’intensité variable in vitro. Certains extraits avaient une activité biologique substantielle in vitro qui, si elle était validée in vivo, pourrait être utilisée pour réduire l’apport d’anthelminthiques dans les systèmes de production animale afin de réduire le développement et d’atténuer l’impact de la résistance aux anthelminthiques. Les travaux ultérieurs devraient se concentrer sur l’identification du meilleur type d’arbre et de l’âge d’abattage pour atteindre une activité biologique maximale à partir de l’écorce. Affiner les associations entre extraits d’écorce et activité anthelminthique in vivo est essentiel pour identifier les meilleures stratégies pour réduire l’apport d’anthelminthiques dans les systèmes de production animale.
Déclaration de disponibilité des données
Les contributions originales présentées dans l’étude sont incluses dans l’article/le matériel supplémentaire ; toute demande supplémentaire peut être adressée à l’auteur/aux auteurs correspondant(s).
Contributions des auteurs
HS a initié l’étude. HS, SA, NS et MA ont conçu l’étude. HS a réalisé l’échantillonnage et la préparation de l’écorce. MA, NS, EM et JH ont réalisé l’analyse des tanins condensés de l’écorce. SA a réalisé les tests parasitologiques et analysé les résultats. SA, MA et HS ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.