Effet de l’extrait aqueux d’Achillea millefolium sur le développement de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez des souris C57BL/6
Référence : Indian Journal of Pharmacology 2014. — PMC4071708 / PMID 24987178 · DOI 10.4103/0253-7613.132168 Type : etude in vivo · Plante : Achillee millefeuille · Propriété → Immunomodulation Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Objectif : Achillea millefolium (A. millefolium) est largement utilisé comme remède anti-inflammatoire en médecine traditionnelle et phytothérapeutique. Dans cette étude, nous avons étudié l’effet d’un extrait aqueux d’A. millefolium sur l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et sur les taux sériques de cytokines chez des souris C57BL/6.
Matériels et méthodes : L’EAE a été induite chez 63 souris C57BL/6 pesant 20-25 g (âgées de 8 semaines). Après l’immunisation, le protocole de traitement a été initié en utilisant différentes doses d’un extrait aqueux d’A. millefolium (1, 5 et 10 mg/souris/jour). Les évaluations histopathologiques ont été réalisées par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H et E) et au bleu de luxol rapide (LFB). Les incapacités comportementales ont été enregistrées par une caméra. Les taux sériques d’interleukine (IL)-10, d’IL-12 et de facteur de croissance transformant (TGF)-β ont été mesurés par dosage immuno-enzymatique (ELISA).
Résultats : En moyenne, les souris ont développé des incapacités comportementales classiques de l’EAE 13,2 ± 1,9 jours après l’immunisation. Le traitement des souris par A. millefolium a entraîné un retard de l’apparition des incapacités comportementales ainsi qu’une réduction de leur gravité. Le traitement par A. millefolium a empêché la perte de poids et augmenté les taux sériques de TGF-β chez les souris immunisées avec MOG35-55. Les souris chez lesquelles l’EAE avait été induite et qui avaient été traitées par A. millefolium présentaient une infiltration cérébrale moindre de cellules inflammatoires.
Conclusion : Les résultats ont démontré que le traitement par extrait aqueux d’A. millefolium peut atténuer la gravité de la maladie, les réponses inflammatoires et les lésions démyélinisantes chez les souris chez lesquelles l’EAE a été induite. En outre, après le traitement par A. millefolium, les taux sériques de TGF-β étaient augmentés chez les souris chez lesquelles l’EAE avait été induite.
Introduction
La sclérose en plaques (SEP) est un trouble complexe et, malgré des années de recherche ciblée, les principaux facteurs étiologiques des processus pathologiques restent à identifier. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) a été utilisée comme modèle de la SEP chez les animaux dans le monde entier et a aidé à l’identification des auto-antigènes associés à sa pathologie et à sa progression. Il est maintenant bien établi que les réponses inflammatoires peuvent jouer un rôle dans la pathogenèse de l’EAE. Un large éventail de différents médiateurs pro-inflammatoires, incluant des cytokines telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, l’interleukine (IL)-6, l’IL-1β, l’interféron (INF)-g et l’IL-17, des enzymes comme la cyclooxygénase-2, des facteurs de transcription, le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et la protéine B de liaison à l’amplificateur CCAAT (C/EBB), sont considérés comme impliqués dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques, des macrophages et des cellules gliales, qui sont responsables de la réponse pro-inflammatoire dans l’EAE. Les réponses pro-inflammatoires entraînent la destruction des oligodendrocytes.
Achillea millefolium (A. millefolium), ou achillée millefeuille, une plante à fleurs de la famille des Asteraceae, est répandue et fréquemment utilisée comme plante médicinale dans le monde entier. A. millefolium a été utilisé comme traitement de plusieurs troubles allant de la cicatrisation des plaies, des maladies infectieuses, de la douleur et des plaintes gastro-intestinales à de nombreuses autres affections. Bien qu’A. millefolium ait été proposé comme remède populaire pour le traitement traditionnel des maladies du système nerveux central, peu de données ont été publiées à l’appui de cette allégation. Elmann et al., ont rapporté que l’extrait d’A. millefolium a des effets anti-inflammatoires sur des cultures primaires de cellules microgliales cérébrales activées par le lipopolysaccharide (LPS). Par conséquent, ils ont conclu qu’A. millefolium pourrait être bénéfique pour prévenir ou traiter les maladies neurodégénératives comme les maladies d’Alzheimer et de Parkinson. Dans une autre étude, Molina-Hernandez et al., ont rapporté des actions de type anticonflit de l’extrait aqueux des fleurs d’A. millefolium chez le rat. Également récemment, Baretta et al., ont rapporté que l’administration orale aiguë et chronique d’extrait hydroalcoolique d’A. millefolium exerçait des effets de type anxiolytique chez la souris.
Ainsi, le but de cette étude était d’étudier les effets de l’extrait aqueux d’A. millefolium sur le développement de l’EAE chez des souris C57BL/6.
Matériels et méthodes
Animaux
Des souris C57BL/6 mâles adultes (âgées de 8-12 semaines) ont été achetées à l’Institut Pasteur (Téhéran, Iran) et ont été utilisées pour l’induction de l’EAE. Les souris ont été maintenues dans des conditions optimales fondées sur la température, l’hygiène, l’humidité et la lumière (cycles de 12 h obscurité/lumière). Elles avaient libre accès à la nourriture et à l’eau. La méthode de cette étude a été approuvée par le comité d’éthique local (Ethics and Animal Care Committee of Rafsanjan University of Medical Sciences) et toutes les expériences ont été menées conformément aux lignes directrices éthiques standard.
Réactifs
La glycoprotéine des oligodendrocytes de la myéline (MOG) a été achetée auprès de la société Alexis, États-Unis. L’adjuvant complet de Freund (CFA), le violet de crésyl rapide, la toxine pertussique, le bleu de luxol rapide (LFB) et le carbonate de lithium ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, États-Unis.
Préparation du matériel végétal
Le matériel végétal a été collecté en mars 2011 auprès de l’Herbier botanique d’Ispahan et a été identifié par le Dr Valiollah Mozaffarian à la Division de recherche botanique, Institut de recherche des forêts et pâturages, Téhéran, Iran. Un spécimen de référence a été conservé à l’Herbier botanique d’Ispahan sous le numéro de spécimen de référence 9757. Les parties aériennes séchées de la plante (200 g) ont été rincées avec de l’eau distillée, séchées, broyées en poudre et extraites dans un appareil de Soxhlet avec de l’eau distillée. Le solvant a été évaporé sous pression réduite à 40°C. L’extrait obtenu a ensuite été reconstitué en le dissolvant dans de l’eau distillée avant d’être utilisé chez les animaux. Trois des doses les plus courantes de l’extrait ont été sélectionnées pour être utilisées dans cette étude (40, 200 et 400 mg/kg). En raison du fait que la plupart des souris pesaient environ 24 g, nous avons converti les doses mentionnées par souris (1, 5 et 10 mg/souris).
Groupes expérimentaux
Dans cette étude, les souris ont été réparties aléatoirement en sept groupes égaux (sept souris par groupe) comme suit : (1) groupe témoin ; aucune intervention n’a été réalisée dans ce groupe, (2) groupe EAE ; l’EAE a été induite dans ce groupe en utilisant MOG35-55, CFA et la toxine pertussique, (3) groupe simulé ; les animaux ont reçu CFA et la toxine pertussique sans MOG, (4-6) : dans ces trois groupes, les animaux ont d’abord été soumis à l’induction de l’EAE, suivie 24 h plus tard par 1, 5 et 10 mg/souris/jour d’A. millefolium pendant 21 jours, et 7 : les souris saines ont reçu 10 mg/souris/jour d’A. millefolium pendant 21 jours. Le dernier groupe a été conçu pour étudier tout effet d’A. millefolium sur la santé générale des rats (voir pour le régime de traitement).
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Induction de l’EAE chez les souris
L’EAE a été induite en utilisant un peptide correspondant à la séquence de la glycoprotéine des oligodendrocytes de la myéline des rongeurs MOG35-55. Les souris expérimentales ont reçu une injection sous-cutanée de 250 μg de MOG35-55/souris émulsionnés dans du CFA contenant 0,4 mg de Mycobacterium tuberculosis. Les animaux ont également reçu 500 ng/souris de toxines pertussiques immédiatement après l’immunisation et 48 h plus tard. Dans le groupe traité de façon simulée, les animaux ont reçu CFA et la toxine pertussique, mais n’ont pas reçu MOG. Les souris ont été surveillées quotidiennement pour la perte de poids et les signes neurologiques d’EAE. La gravité de la maladie chez les souris EAE a été notée (6 grades) selon la méthode rapportée par Onuki et al., comme suit : grade 0 = s’il n’y avait aucun signe de maladie, grade 1 = s’il y avait une perte partielle de tonicité de la queue, grade 2 = s’il y avait une perte de tonicité de la queue avec des incapacités de redressement de la queue, grade 3 = s’il y avait une démarche instable et une paralysie légère d’un membre postérieur, grade 4 = s’il y avait à la fois une paralysie des membres postérieurs et une incontinence, grade 5 = s’il y avait une quadriplégie, et grade 6 = décès. Les souris ont été sacrifiées humainement 21 jours après l’immunisation avec MOG35-55.
Évaluations histologiques et microscopiques
Au 21e jour de l’induction de l’EAE, les animaux ont été anesthésiés par injection d’une dose élevée de thiopental. Des échantillons sanguins ont été collectés avant la perfusion intracardiaque des animaux avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4) contenant une solution de paraformaldéhyde à 4% (p/v). Le cerveau entier a été disséqué chez chaque animal et les tissus disséqués ont été fixés et divisés en deux hémisphères : l’hémisphère droit a été utilisé pour la coloration histologique, tandis que l’hémisphère gauche a été utilisé pour la coloration de la myéline. Pour l’analyse histologique, des méthodes d’histologie de routine ont été réalisées afin d’obtenir des détails morphologiques du tissu cérébral chez les souris EAE. Les tissus fixés au paraformaldéhyde ont été inclus dans la paraffine, et des coupes sériées (8 μm) ont été préparées. Les coupes ont été colorées par une méthode conventionnelle de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H et E). Des images numériques ont été prises en utilisant un objectif ×40. Les lames ont été évaluées en aveugle pour l’inflammation par des experts formés du Département d’anatomie de la Rafsanjan University of Medical Sciences. L’inflammation a été notée en utilisant l’échelle suivante : 0 = aucune cellule infiltrante n’a été observée ; 1 = quelques cellules infiltrantes ont été observées ; 2 = de nombreuses cellules infiltrantes étaient visibles ; et 3 = une infiltration étendue a été observée. Six coupes sériées de l’hémisphère droit de chaque souris dans chaque groupe ont été notées. Les processus de comptage ont été réalisés dans des coupes similaires et dans des champs microscopiques similaires dans tous les groupes. Les coupes de l’hémisphère gauche ont été incubées dans 0,1% de LFB dissous dans 95% d’éthanol et 0,05% d’acide acétique à 60°C pendant 18 h. Les coupes colorées ont été différenciées dans 0,05% de carbonate de lithium et 70% d’éthanol. Les coupes ont ensuite été contre-colorées au violet de crésyl rapide, déshydratées et montées avec de l’enthelan. Six coupes de l’hémisphère gauche de chaque souris ont été colorées avec le LFB et ont été vérifiées pour la plaque démyélinisante.
Détermination des facteurs immunologiques
Les taux sériques d’IL-10, de facteur de croissance transformant (TGF)-β et d’IL-12 ont été mesurés en utilisant un dosage immuno-enzymatique (ELISA ; eBioscience, ESP). Brièvement, les anticorps monoclonaux dirigés contre l’IL-10, le TGF-β et l’IL-12 ont été pré-enduits dans des plaques ELISA en polyester et, après 24 h d’incubation et de lavage, ont été bloqués dans le tampon PBS contenant 3% d’albumine sérique bovine pendant 2 h. Les échantillons ont ensuite été ajoutés aux plaques à puits et ont été incubés pendant 2 h. Les plaques ont été lavées à nouveau et des anticorps conjugués à la biotine dirigés contre les cytokines ont été ajoutés aux plaques et ont été incubés à nouveau pendant 2 h. Après le lavage des plaques, de l’avidine-peroxydase de raifort (HRP) a été ajoutée et incubée encore pendant 30 min. Enfin, les plaques ont été lavées, le substrat (TMB + H2O2) a été ajouté et, après 15 min d’incubation, la réaction a été arrêtée par addition de H2SO4 2N. L’absorption a été mesurée en utilisant un lecteur de plaques ELISA. La sensibilité des kits était de 2 pg/ml et les évaluations inter- et intra-essai de la fiabilité des kits ont été évaluées et ont produit des scores de CV <14% et <0,03%, respectivement.
Analyse des données
Les données ont été analysées en utilisant Excel et le Statistical Package for Social Sciences (SPSS). Toutes les données ont été rapportées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) et une valeur de P inférieure à 0,05 a été considérée comme une différence significative. Les différences entre les groupes ont été mesurées en utilisant une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test post hoc de Dunnett. Une ANOVA à mesures répétées (RMA) a également été utilisée pour comparer les variations de poids dans les jours suivant l’induction de l’EAE.
Résultats
Scores comportementaux
Dans le groupe 2 (le groupe EAE), les premiers scores comportementaux de l’EAE sont apparus après 13,2 ± 1,9 jours d’immunisation. Dans ce groupe, les scores comportementaux ont augmenté jusqu’à un niveau maximal de 3,4 ± 0,8 à 17 jours après l’immunisation (RMA, P = 0,049). Le traitement par A. millefolium a retardé l’apparition des changements comportementaux par rapport au groupe EAE. Dans les groupes 4 et 6 (ayant reçu respectivement 1 et 10 mg/souris d’A. millefolium), des scores comportementaux d’EAE ont été observés à partir de 18 et 17 jours après l’immunisation, respectivement. Dans le groupe 5 (ayant reçu 5 mg/souris d’A. millefolium), nous n’avons observé aucun score comportemental d’EAE pendant toute la période de l’étude. La moyenne du score comportemental dans le groupe 4 (P = 0,014) et le groupe 6 (P = 0,021) était significativement plus basse que dans le groupe 2.
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Changements de poids
Les résultats ont montré que le poids moyen des souris du groupe 2 au 21e jour était significativement inférieur à leur poids moyen au 1er jour après l’immunisation avec MOG (P = 0,003). Le poids moyen des souris dans les groupes 4-6 n’avait pas changé au 21e jour suivant l’immunisation comparativement au 1er jour de l’immunisation dans chaque groupe (tous P > 0,3). Dans le groupe 7 (traité seulement avec 10 mg/souris/jour d’A. millefolium), nous n’avons observé ni incapacités comportementales ni perte de poids tout au long de l’étude, ce qui suggère que le médicament n’a pas d’effet délétère sur la santé générale.
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Histologie
La coloration H et E des coupes coronales du cerveau dans le groupe 2 a montré une infiltration massive de cellules inflammatoires dans le tissu cérébral. En revanche, dans les groupes 4-6, l’infiltration de cellules inflammatoires dans le tissu cérébral était diminuée. Le nombre de cellules inflammatoires a diminué dans les groupes 5 (P = 0,013) et 6 (P = 0,010) comparativement au groupe 2.
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Les coupes coronales du cerveau gauche ont été colorées avec le LFB. Les lésions démyélinisantes étaient plus évidentes dans le groupe 2. Dans les groupes 4-6, des lésions moins démyélinisées dans le cerveau ont été observées. Cependant, nous n’avons pas effectué d’analyse statistique du nombre de zones de lésions dans les groupes expérimentaux.
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Taux sériques d’IL-10, d’IL-12 et de TGF-β
Nos résultats ont montré que les taux sériques moyens d’IL-10 et d’IL-12 n’étaient pas significativement différents entre les groupes expérimentaux. Les taux sériques de TGF-β étaient plus élevés dans les groupes 4-6, comparativement au groupe 2 ; toutefois, la différence n’était significative que dans le groupe 6 (P = 0,026).
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Discussion
Les résultats démontrent que le traitement du modèle de souris EAE par extrait aqueux d’A. millefolium a inhibé le développement des symptômes et complications de l’EAE (à la fois les présentations comportementales et l’inflammation). Nos résultats ont également révélé que les taux sériques d’IL-10 et d’IL-12 n’étaient pas significativement modifiés dans les différents groupes expérimentaux ; toutefois, les taux circulants de TGF-β étaient significativement augmentés chez les souris avec EAE induite traitées par 10 mg/souris d’A. millefolium, ce qui suggère que les effets de l’extrait sur le TGF-β pourraient être dose-dépendants, mais cela devrait être évalué dans de futurs programmes de recherche.
Les effets anti-inflammatoires d’A. millefolium ont été documentés dans des études antérieures. Il a été démontré que l’une des principales conséquences de l’EAE et de la SEP est l’infiltration de lymphocytes T activés et de cellules mononucléées associées, telles que les macrophages, dans le système nerveux central (SNC). Ceci est à son tour facilité par un large spectre de conséquences inflammatoires. Par conséquent, conformément aux rapports précédents, nous avons étudié si le traitement par A. millefolium pouvait atténuer l’infiltration de cellules inflammatoires d’A. millefolium chez les souris EAE. Nos résultats ont démontré qu’A. millefolium diminuait l’infiltration de cellules inflammatoires dans le cerveau des animaux EAE traités. En accord avec nos résultats, il existe plusieurs rapports concernant les propriétés anti-inflammatoires d’A. millefolium. Benedek et al., en 2007, ont rapporté qu’A. millefolium inhibe in vitro les protéases liées à l’inflammation, notamment l’élastase des neutrophiles humains (HNE) et les métalloprotéinases matricielles (MMP). Dans un autre rapport, Maswadeh et al., ont montré qu’un gel contenant 6% d’extrait d’A. millefolium réduisait l’œdème de la patte (environ 50%) chez le rat. Les effets inhibiteurs d’A. millefolium sur certains médiateurs de l’inflammation tels que les MMP peuvent jouer un rôle important dans les effets préventifs de cet extrait sur l’EAE ; cela est confirmé par certaines études qui rapportent que MMP 2 et 9 étaient toutes deux augmentées dans la SEP. Il a également été rapporté que le stress oxydatif influence la gravité de la SEP. En outre, des rapports démontrent les propriétés antioxydantes d’A. millefolium. Konyalioglu et Karamenderes ont criblé 15 espèces différentes d’Achillea pour leurs activités antioxydantes en utilisant plusieurs essais in vitro sur des érythrocytes et des leucocytes humains. Par conséquent, il est intéressant de spéculer que l’un des mécanismes possibles par lesquels A. millefolium inhibe le développement de l’EAE pourrait passer par ses propriétés antioxydantes. Toutefois, des investigations supplémentaires sont nécessaires pour éclairer ce point.
Eu égard au fait que le TGF-β contribue aux processus de synthèse de la matrice, il peut être raisonnable de conclure qu’A. millefolium peut induire la remyélinisation des neurones lésés par régulation positive du TGF-β dans le modèle d’EAE. Fait intéressant, il a été montré que le TGF-β induit l’expression, par la microglie, de facteurs chimiotactiques qui sont spécifiques du recrutement des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) chez les souris C57BL/6. La chimioattraction des OPC vers les lésions démyélinisantes du SNC est l’un des principaux facteurs déterminants de la remyélinisation. De plus, des données convaincantes démontrent que le TGF-β a des effets anti-inflammatoires sur les cellules immunitaires (telles que les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques). Ainsi, il semble que le traitement par A. millefolium puisse réguler négativement l’inflammation dans l’EAE au moins partiellement via l’induction du TGF-β. D’autre part, le TGF-b joue des rôles doubles lorsqu’il est associé à d’autres cytokines ; par conséquent, les études futures devraient viser à examiner un éventail plus large de cytokines inflammatoires (telles que l’IL-17, l’interféron gamma (IFNg), l’IL-23 et l’IL-6) afin d’évaluer les effets d’A. millefolium sur ce système.
Globalement, les résultats ont montré que les taux sériques d’IL-12 et d’IL-10 n’étaient pas modifiés parmi les groupes étudiés. Il a été montré que l’IL-17A a un effet antagoniste sur les cellules sécrétant l’IL-12 et l’IL-10. De plus, des études récentes ont démontré que l’IL-17A est l’une des principales cytokines impliquées dans l’induction de l’EAE ; ainsi, il est difficile de concilier l’influence rapportée de l’IL-17A sur l’EAE avec nos données qui n’ont montré aucune modification des cytokines en aval, IL-12 et IL-10. Des études supplémentaires doivent clarifier l’interaction possible entre ces cytokines chez les souris chez lesquelles l’EAE a été induite.
Pour conclure, A. millefolium peut inhiber le développement de l’EAE chez les souris. De futures études cliniques sur l’effet d’A. millefolium chez les patients atteints de SEP peuvent être planifiées sur la base des résultats de cette étude.