Inhibition de la voie de signalisation PI3K dans des cellules cancéreuses par l’extrait éthanolique d’Agrimonia eupatoria L. : identification de la tricoumaroyl-spermidine comme inhibiteur potentiel de PI3K
Référence : BMC Complementary Medicine and Therapies 2026. — PMC12870893 / PMID 41495771 · DOI 10.1186/s12906-025-05231-z Type : etude in vitro · Plante : Aigremoine eupatoire · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Note du traducteur : le fichier source fourni ne contenait pas l’abstract structuré de l’article. Le résumé ci-dessous est une synthèse fidèle construite uniquement à partir des phrases de l’article (objectif, principaux résultats chiffrés, conclusion) ; aucune donnée absente du texte n’a été ajoutée.
Cette étude visait à explorer le potentiel anticancéreux de l’extrait éthanolique d’Agrimonia eupatoria L. (AE), en s’intéressant spécifiquement à sa capacité à moduler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR et ses cibles en aval, en combinant un profilage phytochimique avancé, des études mécanistiques in vitro et un amarrage moléculaire in silico. L’extrait, préparé par macération à l’éthanol à 96 %, présentait des teneurs en flavonoïdes et en composés phénoliques de 26,23 ± 0,85 mg (QE)/g et 358,9 ± 0,62 mg (GAE)/g. Il exerçait une cytotoxicité dépendante de la concentration et du temps sur un panel de lignées cancéreuses humaines (MCF-7, HT-29, A549, HeLa), les cellules HT-29 étant les plus sensibles, tout en étant significativement plus toxique pour la plupart des cellules cancéreuses que pour les fibroblastes coliques non cancéreux CCD 841 CoN. Sur les cellules A549, l’extrait réduisait la PI3K totale d’environ 30 % et la PI3K phosphorylée (activée) d’environ 50 %, et diminuait les niveaux de PI3K, Akt et mTOR stimulés par l’insuline, ainsi que ceux de HIF-1α, MMP-2 et COX-2. L’analyse LC-Q-Orbitrap HRMS a permis d’annoter 112 composés. L’amarrage moléculaire a identifié la tricoumaroyl-spermidine comme candidat remarquable : meilleure affinité de liaison que l’inhibiteur de référence tout en ne violant qu’une seule règle de Lipinski (masse moléculaire de 583,67 Da). En conclusion, l’extrait éthanolique d’A. eupatoria agit comme un agent modulateur de voie, malgré une cytotoxicité directe modérée, et la tricoumaroyl-spermidine constitue un inhibiteur potentiel prometteur de PI3K.
1. Introduction
Le cancer demeure l’un des défis de santé les plus importants, son incidence augmentant continuellement à l’échelle mondiale. Rien qu’en 2022, environ 20 millions de nouveaux cas de cancer et 9,7 millions de décès liés au cancer ont été enregistrés dans le monde. Malgré des progrès importants dans les traitements, la demande d’agents anticancéreux nouveaux et efficaces reste élevée. Une approche prometteuse réside dans l’ethnopharmacologie, qui s’appuie sur l’usage traditionnel de substances d’origine végétale pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Le passage de l’approche « une maladie, une cible » à l’utilisation de composés végétaux ciblant de multiples processus physiologiques représente un nouveau paradigme appelé polypharmacologie.
Agrimonia eupatoria L. (AE), ou aigremoine commune, est une plante herbacée vivace au riche passé dans la médecine populaire européenne et asiatique. Elle a été traditionnellement utilisée pour un large éventail d’affections, notamment les états inflammatoires, les infections et les troubles digestifs, y compris pour de potentielles propriétés anticancéreuses. Plusieurs études ont rapporté son activité cytotoxique contre différentes lignées de cellules cancéreuses in vitro. Certains auteurs ont également rapporté l’effet antitumoral de l’agrimonine – l’un des principaux constituants de l’extrait d’A. eupatoria. L’aigremoine commune a été traditionnellement utilisée en médecine populaire pour ses propriétés biologiques, notamment des effets anti-inflammatoires, immunomodulateurs, antioxydants, analgésiques, antidiabétiques, cicatrisants, diurétiques, hépatoprotecteurs, antiviraux, anticancéreux et antimicrobiens. Elle a été utilisée pour le traitement des migraines, des maux de gorge, des bronchites, de l’eczéma, des troubles hémorragiques, des ulcères variqueux, des conjonctivites, des cystites, des infections urinaires, des diarrhées, des plaies, des lésions et des affections impliquant un excès de mucosités ou de mucus, des hépatites, des néphrites, des stomatites et de la fièvre jaune. Le Comité des médicaments à base de plantes (HMPC) a reconnu l’aigremoine pour son usage traditionnel dans plusieurs applications sur la base de son utilisation de longue date, et il existe un document distinct décrivant cela. Selon ce document, le HMPC, sur la base des usages traditionnels de cette plante, a conclu qu’elle peut être utilisée par les adultes et les enfants de plus de 12 ans pour le soulagement des diarrhées légères, ou utilisée en gargarisme pour le traitement de la cavité buccale et pour le soulagement des inflammations cutanées mineures et des plaies. Il existe plusieurs formes pharmaceutiques de préparations médicinales d’A. eupatoria, telles que la substance végétale fragmentée sous forme de tisane pour usage oral, la substance végétale fragmentée pour préparation d’infusion ou de décoction pour usage oromuqueux, cutané ou comme additif de bain, et des préparations à base de plantes sous forme liquide pour usage oral ou oromuqueux. Actuellement, des recherches sont en cours pour explorer différentes propriétés bioactives des extraits d’AE, dans le but de proposer de nouveaux usages pour cette herbe et de réviser la monographie correspondante.
Les recherches ont révélé la présence de divers composés bioactifs au sein des extraits d’A. eupatoria, notamment des acides phénoliques, des flavonoïdes, des tanins, des polysaccharides, des huiles volatiles, des terpénoïdes, etc. Certaines données de la littérature indiquent que le principal composé polyphénolique des parties aériennes de l’aigremoine commune est l’agrimonine. Elle est également riche en glycosides de flavonoïdes, tels que l’apigénine, la lutéoline, la quercétine, etc. Ces constituants présentent un éventail d’activités pharmacologiques, notamment des effets cytotoxiques, apoptotiques et antiangiogéniques, qui peuvent être prometteurs pour lutter contre la progression du cancer. Ces résultats suggèrent un potentiel important pour le développement de nouvelles applications médicinales fondées sur les constituants bioactifs de l’AE.
Notre intérêt a été spécifiquement motivé par des résultats antérieurs sur des extraits d’AE provenant des hautes altitudes d’Arménie. Nos études antérieures ont démontré que l’écotype arménien d’AE possède des propriétés antiradicalaires et antivirales significatives. De plus, nous avons constaté qu’il contient des composés dotés d’une puissante activité antibactérienne, capables de renforcer l’efficacité des antibiotiques contre des souches bactériennes résistantes. Bien que ces résultats et les études d’autres groupes de recherche confirment le potentiel cytotoxique de l’AE in vitro, les mécanismes moléculaires précis à l’origine de son activité anticancéreuse n’ont pas été suffisamment explorés. Il existe un besoin manifeste d’identifier les composants bioactifs spécifiques responsables de ces effets et de comprendre comment ils modulent les voies cellulaires clés dans le cancer. En outre, un profilage phytochimique complet est indispensable pour identifier et caractériser les composants bioactifs responsables des effets anticancéreux observés. Compte tenu de cela, nous avons cherché à explorer davantage les mécanismes d’action de l’AE au niveau moléculaire et à définir les composés qui en sont responsables.
L’un des axes de signalisation les plus critiques dans le cancer est la voie de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), qui gouverne des processus tels que la prolifération cellulaire, la survie, les métastases et la résistance aux médicaments. Les anomalies de cette voie sont des moteurs fréquents de la tumorigenèse dans de nombreux cancers, ce qui en fait une cible stratégique pour la thérapie. Les anomalies de la voie PI3K, telles que des mutations ou des amplifications des sous-unités de la PI3K, sont couramment observées dans divers cancers, contribuant à la tumorigenèse et à la résistance aux thérapies conventionnelles. Par exemple, la survenue de mutations de PIK3CA est un événement initial dans le développement du cancer du sein comme du cancer du côlon. Une expression diminuée de PIK3CG a été associée à la promotion de la croissance et du développement du cancer du côlon. Par conséquent, cibler la signalisation PI3K représente une approche stratégique pour combattre le cancer. La voie PI3K/Akt est également étroitement régulée par le métabolisme redox cellulaire et le stress oxydatif. Ce lien fournit une justification convaincante pour rechercher si les propriétés antiradicalaires que nous avions précédemment observées dans l’extrait d’AE pourraient être liées à un effet modulateur sur la signalisation PI3K.
Par conséquent, cette étude visait à explorer davantage le potentiel anticancéreux de l’extrait éthanolique d’AE, en se concentrant spécifiquement sur sa capacité à moduler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR et ses cibles en aval. En combinant un profilage phytochimique avancé avec des études mécanistiques in vitro et un amarrage moléculaire in silico, nous avons cherché à identifier les principaux composés bioactifs responsables de son action et à élucider leurs interactions moléculaires.
2. Matériels et méthodes
2.1. Produits chimiques et réactifs
Le réactif de Folin–Ciocalteu (FC), l’éthanol, l’acide gallique, la catéchine, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le milieu McCoy’s 5 A, le milieu essentiel minimal de Eagle (MEM), le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM), le tampon phosphate salin (PBS), l’éthanol, le 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol (Trizma-Base), le colorant Sybr Green I pour acides nucléiques, le Triton X100, l’agarose à bas et à point de fusion normal (agarose LMP et NMP), le sel diammonium de l’acide 2,2-azinobis-(éthyl-2,3-dihydrobenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) et d’autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich GmbH (Taufkirchen, Allemagne). Le kit OxiSelect™ Cellular Antioxidant Assay a été acheté auprès de Cell Biolabs, Inc. Le kit Universal Mycoplasma Detection a été acquis auprès de l’ATCC (États-Unis). Les anticorps du panel de la voie de signalisation PI3K/AKT (ab283852), HIF1a (ab179483), MMP-2 (ab92536), COX-2 (ab179800), l’IgG anti-lapin de chèvre H&L (Alexa Fluor488, ab150077), l’anti-bêta-actine (ab8227), l’anti-Caspase-3 (ab32351) et l’IgG anti-lapin H&L (HRP, ab6721) pour le WB et l’ICC/IF ont été achetés auprès d’Abcam.
2.2. Matériel végétal
Les parties aériennes d’Agrimonia eupatoria L. (AE) (famille des Rosaceae), plante vivace largement répandue en Arménie, ont été récoltées dans la région de Tavush, près du village de Navur en Arménie, à une altitude de 1400–1550 m au-dessus du niveau moyen de la mer, pendant la période de floraison de la plante en juin 2023. L’échantillonnage a été réalisé dans une prairie privée. Le propriétaire du terrain a donné l’autorisation de l’échantillonnage. L’identification du matériel végétal a été effectuée par la Dre Narine Zakaryan au Département de botanique et de mycologie de l’Université d’État d’Erevan (YSU), Arménie. Des échantillons de référence ont été déposés dans l’herbier de l’Université d’État d’Erevan (Erevan, Arménie) sous le numéro de série : Agrimonia eupatoria L. (ERCB 13207).
2.3. Préparation de l’extrait végétal
Les échantillons d’AE utilisés dans les expériences ont été préparés par macération avec de l’éthanol à 96 % dans un rapport 1:10 (p/v) entre le matériel végétal sec et le volume de solvant, selon la méthode décrite précédemment. La macération a été effectuée à 2–8 °C pendant 24 h, et le processus a été répété trois fois pour assurer une extraction exhaustive. Pour les tests CAA (activité antioxydante cellulaire), MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) et comète, un extrait éthanolique brut de 50 mg PS (poids sec)/mL a été préparé. Le rendement d’extraction a été déterminé en évaporant 500 µL de l’extrait à température ambiante dans des conditions ambiantes, puis en pesant le résidu sec. Ce processus a été répété au cours de trois expériences indépendantes, aboutissant à un rendement moyen de 15,4 ± 0,28 %.
2.4. Culture cellulaire
Les cultures cellulaires MCF-7 (ATCC HTB-22) (cancer du sein humain), HT-29 (ATCC HTB-38) (adénocarcinome colique humain), A549 (ATCC CCL-185) (adénocarcinome pulmonaire humain) et HeLa (ATCC CCL-2) (carcinome cervical humain), CCD 841 CoN (ATCC CRL-1790) (cellules fibroblastiques coliques humaines non cancéreuses) ont été obtenues auprès de l’ATCC. Les cellules MCF-7 et CCD 841 CoN ont été maintenues dans le milieu essentiel minimal de Eagle (EMEM), les HT-29 dans le milieu McCoy’s, tandis que les cellules A549 et HeLa l’ont été dans le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM). Tous les milieux utilisés ont été supplémentés avec 10 % de sérum de veau fœtal (100 mL/L), du pyruvate de sodium (200 mg/L), de la L-glutamine (2 mmol/L) et des antibiotiques (100 µg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline et 0,25 µg/mL d’amphotéricine B). Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 dans un incubateur Biosmart (Biosan, Lettonie) et/ou dans un Smart Cell Incubator (Heal Force), selon le protocole décrit précédemment. Les cellules cultivées ont été régulièrement examinées pour détecter une contamination par des mycoplasmes à l’aide du kit Universal Mycoplasma Detection de l’ATCC (États-Unis). Toutes les expériences sur lignées cellulaires ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour la recherche in vitro. Les numéros de passage des lignées cellulaires utilisées étaient compris entre 5 et 15.
2.5. Activité antioxydante par tests chimiques et quantification des teneurs totales en composés phénoliques et en flavonoïdes
L’activité antioxydante de l’extrait d’AE a été évaluée à l’aide de méthodes spectrophotométriques standard avec les radicaux ABTS (acide 2,2′-azino-bis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)) et DPPH (1-diphényl-2-picrylhydrazyle), selon des procédures décrites précédemment. Pour les mesures, des solutions mères des deux radicaux ont été préparées comme suit : la solution de DPPH à 0,1 mM a été diluée avec du méthanol pour atteindre une absorbance de 0,9 ± 0,02 à 515 nm, et la solution d’ABTS à 0,05 mM a été diluée avec de l’éthanol pour atteindre une absorbance de 0,7 ± 0,02 à 734 nm. Les réactifs dilués ont ensuite été mélangés à diverses dilutions des échantillons testés, et l’absorbance a été mesurée à 515 nm pour le DPPH et à 734 nm pour l’ABTS après une incubation de 10 minutes à température ambiante. Toutes les mesures ont été réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suisse). Les valeurs de stœchiométrie indiquant le nombre de molécules d’oxydant réduites par une molécule d’antioxydant après 10 min de réaction pour les tests ABTS ou DPPH (n10) ont été mesurées à température ambiante. Le coefficient de régression a été calculé comme la pente de la droite représentant la relation entre la quantité de DPPH/ABTS piégée (µg) par un piégeur de radicaux et la quantité de l’extrait antioxydant testé (µg) dans le mélange après 10 min de réaction (n10).
L’évaluation de la teneur totale en composés phénoliques des extraits végétaux a été réalisée à l’aide du réactif de Folin–Ciocalteu (FC), la quantification étant fondée sur une courbe d’étalonnage préparée pour l’acide gallique (GA), à des concentrations allant de 0 à 250 µg/mL. La teneur en composés phénoliques a été calculée en milligrammes d’équivalents d’acide gallique par gramme de poids sec de l’échantillon végétal (mg GAE/g). Pour les estimations de la teneur totale en flavonoïdes, le test colorimétrique à l’AlCl3 a été utilisé. Les niveaux de flavonoïdes ont été quantifiés à partir d’une courbe d’étalonnage établie pour la quercétine, à des concentrations allant de 0 à 250 µg/mL. Les résultats ont été présentés en milligrammes d’équivalents de quercétine par gramme de poids sec de l’échantillon végétal (mg QE/g).
2.6. Test d’activité antioxydante cellulaire
L’activité antioxydante cellulaire (CAA) de l’extrait de partie aérienne d’AE a été évaluée dans les cellules HT-29 à l’aide du kit OxiSelect Cellular Antioxidant Activity Assay (fluorescence verte), selon des méthodes décrites précédemment. Brièvement, les cellules ont été cultivées jusqu’à atteindre une confluence de 90 %. Elles ont ensuite été traitées avec 50 µL d’extraits végétaux pendant 1 heure. En outre, 50 µL de la sonde fluorescente diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA) ont été ajoutés. Après l’introduction d’un initiateur de radicaux, à savoir l’AAPH (dichlorhydrate de 2,2′-azobis(2-amidinopropane)), l’intensité de fluorescence résultante, qui reflète les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), a été mesurée. L’émission de fluorescence a été détectée à 538 nm après excitation à 485 nm, avec des mesures prises toutes les 5 min pendant 1 h, à l’aide d’un lecteur de plaques TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suisse).
2.7. Test de cytotoxicité MTT
Le test MTT a été réalisé pour évaluer l’effet inhibiteur de l’extrait d’AE sur la croissance des cellules MCF-7, HT-29, A549, HeLa et CCD 841 CoN après différents temps d’exposition à diverses concentrations d’extrait, comme décrit précédemment. De l’éthanol à 1 % a été utilisé comme témoin. Trois expériences indépendantes ont été menées avec trois ou quatre réplicats techniques chacune. La cytotoxicité a été quantifiée comme le pourcentage d’inhibition de la croissance des cellules traitées avec l’extrait végétal testé par rapport aux cellules témoins traitées uniquement avec le volume approprié de solvant (1 % d’éthanol dans le mélange final), dont la croissance a été considérée comme égale à 100 %. La concentration finale du véhicule utilisé a été déterminée comme non toxique pour les cellules. Les valeurs IC50 pour l’extrait, à travers les différents temps d’exposition, ont été déterminées à l’aide d’un ajustement de courbe par régression non linéaire à pente variable.
2.8. Test des comètes
La génotoxicité de l’extrait d’AE a été évaluée dans la lignée cellulaire HT-29 à l’aide de l’électrophorèse sur cellule unique, ou test des comètes, selon des procédures préalablement établies. Environ 10^5 cellules par puits ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits, puis traitées avec diverses concentrations de l’extrait végétal pendant une période de 24 heures. À la suite de l’incubation, les cellules ont été récoltées et incorporées dans une couche d’agarose à bas point de fusion sur des lames de microscope. Les cellules ont ensuite été lysées à l’aide d’une solution détergente à forte teneur en sel afin d’éliminer les membranes cellulaires, le cytoplasme et les protéines, ne laissant que l’ADN nucléaire. Pour détecter les cassures des brins d’ADN, les lames ont été immergées dans un tampon alcalin afin de dérouler l’ADN. Une électrophorèse a ensuite été réalisée dans ces conditions alcalines, provoquant la migration de l’ADN fragmenté, chargé négativement, du nucléoïde (la tête de la comète) vers l’anode, formant une queue. La quantité d’ADN migrant dans la queue est directement proportionnelle à l’étendue des dommages à l’ADN. Après l’électrophorèse, les lames ont été neutralisées et l’ADN a été coloré avec un colorant fluorescent. Les comètes résultantes ont été visualisées par microscopie à fluorescence. Le potentiel génotoxique de l’extrait a été quantifié en analysant les images afin de déterminer le pourcentage moyen d’ADN présent dans la queue de la comète. L’ensemble de cette évaluation a été menée au cours de deux expériences indépendantes, chacune comprenant trois réplicats techniques afin d’assurer la fiabilité des résultats.
2.9. Analyse LC-Q-Orbitrap HRMS et dérivatisation post-colonne à l’ABTS
Les constituants phytochimiques de l’extrait éthanolique d’AE ont été caractérisés à l’aide d’un système UHPLC Dionex Ultimate 3000 (ThermoScientific™, Dionex, San Jose, CA, États-Unis) équipé d’une colonne Luna Omega Polar C18, 100 Å (150 × 2,1 mm, 1,6 μm, Phenomenex), selon la méthodologie décrite par Kusznierewicz et al. L’élution a été réalisée avec de l’eau (A) et de l’acétonitrile (B) comme phase mobile, chacun contenant 0,1 % v/v d’acide formique, à un débit de 0,3 mL/min et un volume d’injection de 2 µL pour tous les échantillons. Le programme d’élution en gradient a été réglé comme suit : départ à 15 % B, augmentation à 40 % B sur 15 min, puis à 100 % B à 16 min, maintien à 100 % B jusqu’à 24 min, suivi d’un retour aux conditions initiales pendant 7 min pour rééquilibrer. Ce dispositif chromatographique était couplé à un spectromètre de masse quadripôle-Orbitrap Q Exactive™ Focus (Thermo Fisher Scientific, Brême, Allemagne) équipé d’une source d’ionisation par électronébulisation chauffée (HESI II). La détection a été réalisée à l’aide du spectromètre de masse Q-Exactive dans les conditions suivantes pour le mode d’ions négatifs : débit du gaz gaine à 35 arb, débit du gaz auxiliaire à 15 arb, débit du gaz de balayage à 3 arb, tension de pulvérisation à 2,5 kV, température du capillaire à 350 °C, niveau RF de la lentille S à 50 et température du chauffage à 300 °C. Les paramètres d’analyse en balayage complet comprenaient une résolution de 70 000, une cible AGC de 1e6, un temps d’injection maximal automatique et une plage de balayage de 120–1200 m/z. Pour l’analyse MS2 dépendante des données, les réglages étaient : résolution de 17 500, fenêtre d’isolement de 3,0 m/z, énergie de collision normalisée de 30, cible AGC de 1e6 et temps d’injection maximal automatique. Les données brutes de spectrométrie de masse haute résolution ont été traitées à l’aide du logiciel Compound Discoverer (v. 2.1, Thermo, Waltham, États-Unis).
L’identification des principaux métabolites à partir des données brutes de spectrométrie de masse haute résolution a été réalisée à l’aide de Compound Discoverer (v. 2.1, Thermo, Waltham, États-Unis). Les métabolites ont été identifiés en fonction de leur masse précise (avec une tolérance de 5 ppm), de leur comportement en temps de rétention (tolérance de 0,1 min) et de leur schéma de fragmentation. Le flux de travail comprenait des recherches dans des bases de données à l’aide de ChemSpider, mzCloud, mzVault (février 2017) et de listes de masses localement constituées à partir de la littérature sur les plantes étudiées. Toutes les annotations produites par Compound Discoverer ont été rigoureusement évaluées en comparant les spectres MS/MS à des bases de données de référence (telles que HMDB) et en évaluant la probabilité de présence de chaque métabolite dans la matrice végétale spécifique sur la base des connaissances phytochimiques établies.
Les profils antioxydants de l’extrait d’AE ont été déterminés à l’aide d’un système HPLC-DAD (Agilent Technologies, Wilmington, DE, États-Unis), intégré à un instrument de dérivatisation Pinnacle PCX (Pickering Laboratories Inc., Mountain View, CA, États-Unis) et à un détecteur UV–Vis (Agilent Technologies, Wilmington, DE, États-Unis). Les conditions de séparation chromatographique reproduisaient celles utilisées dans l’analyse LC-HRMS. Les chromatogrammes initiaux ont été capturés à 270 nm à l’aide d’un détecteur DAD avant que l’éluat ne soit acheminé vers l’équipement de dérivatisation post-colonne. Le processus de dérivatisation a employé le réactif ABTS, adapté de méthodes rapportées dans la littérature avec des modifications mineures. Une solution méthanolique d’ABTS (1 mM) a été fusionnée avec l’éluat à un débit de 0,1 mL/min, puis envoyée à travers une boucle de réaction (1 mL, 130 °C). Les profils antioxydants résultants ont été détectés avec un détecteur UV-Vis à 734 nm.
2.10. Analyse morphologique de l’apoptose par coloration au Hoechst 33258
La coloration au Hoechst 33258 permet la détermination des cellules apoptotiques par analyse morphologique à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement x400, Cytation C10, Agilent, États-Unis). Brièvement, des cellules A549 (2 × 10^5 cellules/mL) ont été incubées avec le véhicule (1 % d’éthanol dans le PBS) et les échantillons testés : AE (0,25 mg/mL), AE (0,5 mg/mL) pendant 24 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS pendant 10 min, lavées deux fois avec du PBS pendant 5 min, et colorées avec du Hoechst 33258 (10 µg/mL) pendant 10 min à l’obscurité. Les cellules présentant des modifications nucléaires morphologiques typiques, telles que la condensation de la chromatine, des bords irréguliers, une fragmentation nucléaire et des corps apoptotiques, ont été comptées comme apoptotiques. Les témoins et les variantes de traitement ont été examinés en triple. Pour chaque variante, 8 champs ont été examinés, et le nombre total de cellules et de cellules apoptotiques a été calculé à l’aide du logiciel Gen5. L’analyse statistique a été réalisée par une ANOVA à deux facteurs à l’aide du test de comparaisons multiples de Sidak.
2.11. Test ELISA en cellule pour la phospho-PI3 kinase p85 + total
Les cellules A549 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (1,5 × 10^4 cellules par puits). Après 24 h d’incubation, le milieu cellulaire (180 µL) a été remplacé par un milieu frais et les cellules ont été traitées avec 20 µL de témoin négatif ou d’extraits testés aux concentrations finales suivantes : PBS contenant 1 % d’éthanol (témoin, A549), extrait d’A. eupatoria (0,25 mg PS/mL). Les calculs lors de l’ensemencement des cellules ont été effectués pour garantir que les cellules atteignaient une confluence d’environ 80 % au moment de la fixation. Après 24 h d’exposition aux extraits testés ou aux témoins, le milieu a été retiré et les cellules ont été fixées avec 100 µL de formaldéhyde à 4 % dans le PBS. Une coloration au cristal violet a ensuite été appliquée aux cellules pour normaliser les lectures à 450 nm pour la phospho-PI3 kinase p85 et la PI3K totale. Les lectures DO450 mesurées ont été corrigées en fonction du nombre de cellules en divisant la lecture DO450 d’un puits donné par la lecture DO595 de ce puits. Ce nombre relatif de cellules a ensuite été utilisé pour normaliser chaque lecture. La PI3 kinase p85 totale et phosphorylée ont chacune été dosées en triple à l’aide des anticorps phospho- et total de la PI3 kinase p85 inclus dans le kit PI3 Kinase. Les niveaux de phospho-PI3 kinase p85 et de PI3K totale ont été mesurés à l’aide d’un kit ELISA en cellule (ab207484, Abcam), selon les instructions du fabricant.
2.12. Western blots
Des cellules A549 (5 × 10^5 cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques à 6 puits et incubées pendant 24 h. Ensuite, le milieu cellulaire (900 µL) a été renouvelé et les cellules ont été traitées avec 100 µL de solution PBS + 1 % d’éthanol, 1 % d’éthanol (témoin), ou des composés testés aux concentrations finales suivantes dans ces groupes : (1) cellules témoins (éthanol), (2) cellules témoins + insuline 200 nM, (3) cellules + insuline 200 nM + AE (0,5 mg/mL). Après 24 h, les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du tampon RIPA supplémenté avec un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Abcam). Les concentrations totales de protéines dans la fraction ont été déterminées à l’aide de l’acide bicinchoninique (BCA) (Bio-Rad Laboratories). Les protéines totales (20 µg) ont été séparées sur des gels précoulés à gradient linéaire de 4 à 20 % (Bio-Rad Laboratories), transférées sur des membranes de nitrocellulose et bloquées avec 5 % (p/v) de lait écrémé dans du TBST pendant 1 h. Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire (PI3K 1:1000, Akt 1:5000, mTOR 1:2500, β-actine 1:2500) dilué dans 1 % de lait écrémé (p/v) dans du TBST et détectées à l’aide d’un anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase (IgG anti-lapin H et L (HRP) 1:10000). Les produits ont été visualisés par chimiluminescence ECL (Millipore). Les intensités des bandes ont été mesurées à l’aide du Chemidoc (Bio-Rad Laboratories). Le logiciel ImageJ a été utilisé pour mesurer les intensités des bandes protéiques.
2.13. Immunocytochimie (ICC)
Des cellules A549 (15000) ont été ensemencées dans une microplaque de culture cellulaire noire à 96 puits et incubées pendant 24 h. Pour l’analyse ICC, les groupes étaient : (1) cellules témoins (éthanol), (2) cellules + insuline 200 nM, (3) cellules + insuline 200 nM + AE (0,5 mg/mL). L’insuline a été appliquée pendant 8 h, après quoi le milieu a été remplacé par un milieu frais et l’extrait végétal testé a été ajouté. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 16 h, suivies d’une fixation. Après le traitement indiqué, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA), perméabilisées avec 1 % de Triton X-100, bloquées avec 1 % de BSA et incubées avec l’anticorps primaire (PI3K 1:500, Akt 1:250, mTOR 1:250, Caspase-3 1:500, HIF1a 1:250, MMP-2 1:250, COX-2 1:250) à 4 °C toute la nuit. Ensuite, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire marqué à la fluorescence verte (IgG anti-lapin H&L (Alexa Fluor488) 1:500) et les noyaux colorés en bleu au Hoechst (Sigma). Les images ont été visualisées sur un microscope confocal Cytation C10 à l’aide d’un objectif 20× à température ambiante et acquises par le logiciel Gen5. Le logiciel Gen5 a été utilisé pour analyser l’intensité moyenne de fluorescence.
2.14. Préparation informatique de la structure cristallographique de la protéine
La structure cristallographique de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) a été obtenue à partir de la Protein Data Bank (PDB) (ID : 6C1S). La structure de la PI3K a été analysée et visualisée à l’aide du système PyMOL Molecular Graphics System (Schrödinger, LLC). Le prétraitement initial comprenait le retrait des composants superflus tels que les molécules d’eau, les ions et les entités non protéiques. De plus, tous les ligands liés ont été retirés afin d’isoler les coordonnées de la protéine. La structure protéique affinée a ensuite été préparée pour les études ultérieures d’amarrage moléculaire, tandis que le ligand extrait a été réservé pour un ré-amarrage ultérieur.
2.15. Amarrage moléculaire avec AutoDock Vina
AutoDock Vina, logiciel d’amarrage moléculaire largement utilisé, emploie l’« optimiseur global de recherche locale itérée » pour générer des poses d’amarrage, à l’instar des optimiseurs utilisés dans ICM et de la méthode quasi-newtonienne de Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS) pour l’affinement local. Ce programme intègre une fonction de score empirique et fondée sur les connaissances pour évaluer les affinités de liaison. Pour les simulations d’amarrage, le paramètre d’« exhaustivité » a été fixé à 16, et les réglages par défaut recommandés par les développeurs ont été utilisés pour garantir l’exactitude des résultats. Par la suite, AutoDock Vina a été utilisé pour évaluer les affinités de liaison des composés clés issus de l’AE contre la protéine cible, facilitant le classement de ces composés en fonction de leurs forces de liaison prédites.
2.16. Calcul des propriétés ADME
Les propriétés d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) des ligands sélectionnés ont été calculées à l’aide du serveur web SwissADME (http://www.swissadme.ch/). Cet outil fournit une analyse complète des caractéristiques ADME fondée sur des descripteurs moléculaires et des modèles prédictifs.
2.17. Analyse des interactions 2D
Le logiciel Discovery Studio de Biovia a été employé pour calculer les interactions 2D au sein de la poche de liaison de la PI3K et de la tricoumaroyl-spermidine. Cette analyse a permis une visualisation détaillée des interactions moléculaires, mettant en évidence les résidus clés impliqués dans la liaison du ligand.
2.18. Analyse statistique
Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type. L’évaluation de l’efficacité antioxydante dans les tests chimiques (ABTS, DPPH) et cellulaire (CAA) a été réalisée à l’aide d’un test t de Student non apparié avec un seuil de significativité de p ≤ 0,05. La différence significative pour les autres tests a été déterminée par une ANOVA à un facteur avec le post-test de Dunnett ou de Tukey. L’analyse statistique a été menée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, États-Unis), considérant une valeur de p < 0,05 comme indicative d’une significativité statistique.
3. Résultats
3.1. Le potentiel antioxydant de l’extrait d’AE
Les teneurs totales en flavonoïdes et en composés phénoliques des extraits d’Agrimonia eupatoria L. ont été quantifiées à l’aide de méthodes colorimétriques standard. Selon les données obtenues, les teneurs en flavonoïdes et en composés phénoliques étaient respectivement de 26,23 ± 0,85 mg (QE)/g et de 358,9 ± 0,62 mg (GAE)/g.
Le potentiel antioxydant de l’extrait d’AE a été évalué à l’aide de méthodes spectrophotométriques standard – DPPH et ABTS [ ]. Le coefficient de régression, reflétant les valeurs stœchiométriques, a été calculé à partir de la pente dérivée de la relation entre la concentration de l’extrait et le nombre de radicaux piégés dans ces tests chimiques. Les valeurs stœchiométriques calculées étaient de 1,049 pour le DPPH et de 1,986 pour l’ABTS, indiquant que 1 µg d’extrait brut d’AE neutralise 1,049 ng de radicaux DPPH ou 1,986 ng de radicaux ABTS [ ].
L’extrait d’AE affichait des propriétés antioxydantes moyennes dans les tests chimiques et une teneur significative en composés phénoliques et en flavonoïdes, mais l’activité antioxydante cellulaire déterminée en culture cellulaire à l’aide du test CAA a révélé des résultats contrastés. Les résultats du test ont démontré que l’extrait d’AE présente principalement des propriétés pro-oxydantes dans les cellules HT-29, en fonction de l’état physiologique, de l’homéostasie redox et du statut métabolique de la cellule [ ]. Le test CAA est conçu pour reproduire les conditions biologiques avec un pH de 7,4 et une température de 37 °C, et il tient compte de la biodisponibilité, de la distribution et du métabolisme cellulaire des antioxydants, ce qui le rend plus pertinent sur le plan biologique que les tests chimiques. Ainsi, l’extrait éthanolique d’AE a présenté un effet pro-oxydant dans le modèle cellulaire malgré son profil antioxydant chimique.
3.2. Propriétés cytotoxiques de l’extrait d’A. eupatoria testées par le test MTT
Le potentiel d’inhibition de la croissance de l’extrait d’AE a été évalué contre un panel de lignées de cellules cancéreuses humaines (MCF-7, HT-29, A549 et HeLa), révélant une cytotoxicité statistiquement significative dépendante de la concentration et du temps sur toutes les lignées [ ], bien que les temps d’exposition plus courts (≤ 4 h) se soient avérés inefficaces. Une analyse par carte de chaleur des valeurs IC50 a révélé que les cellules HT-29 étaient les plus sensibles à l’extrait d’AE, suivies par les cellules MCF-7, HeLa et A549 [ ]. Lorsque les valeurs IC50 n’ont pas pu être déterminées à partir des courbes dose-réponse, elles ont été omises [ ].
Fait important, pour évaluer la sélectivité de l’extrait, ses effets ont également été étudiés sur la lignée de fibroblastes coliques humains non cancéreux, CCD841. Les résultats ont démontré que l’extrait d’AE était significativement plus cytotoxique pour la quasi-totalité des cellules cancéreuses testées que pour les fibroblastes normaux CCD 841 CoN, indiquant une fenêtre thérapeutique favorable [ ]. Cette sélectivité a été davantage soulignée par la nature dépendante du temps de l’effet sur les cellules normales : une cytotoxicité significative n’a été observée qu’après 72 h d’incubation, sans impact notable sur la croissance aux temps antérieurs (3, 6 et 24 h). Pris ensemble, ces résultats mettent en évidence les propriétés sélectives d’inhibition de la croissance de l’extrait d’AE, en faisant un candidat solide pour un développement ultérieur comme agent anticancéreux.
3.3. Évaluation des propriétés génotoxiques de l’extrait d’AE par le test des comètes
L’effet génotoxique de l’extrait d’A. eupatoria a été évalué à l’aide du test des comètes dans les cellules HT-29 afin de déterminer l’étendue des dommages à l’ADN. L’augmentation du pourcentage d’ADN dans la queue de la comète par rapport au groupe témoin a été utilisée comme marqueur de génotoxicité. Nos résultats ont révélé qu’à la plus forte concentration testée de l’extrait d’AE (0,5 mg PS/mL), celui-ci présentait des propriétés génotoxiques modestes mais statistiquement significatives, avec une moyenne d’environ 12 % d’ADN dans la queue de la comète, contre une moyenne d’environ 7,9 % pour le groupe témoin (p < 0,006) [ ]. Cela indique une augmentation marquée des dommages à l’ADN dans les cellules traitées avec l’extrait végétal. Les concentrations plus faibles d’extrait testées n’ont pas présenté d’effets génotoxiques statistiquement significatifs par rapport au témoin négatif [ ].
3.4. Identification des composés phénoliques de l’extrait d’AE et profilage antioxydant par HPLC couplée à la dérivatisation post-colonne
L’identification des constituants phénoliques de l’extrait éthanolique de la partie aérienne d’AE a été réalisée à l’aide de la technique chromatographique avancée LC-Q-Orbitrap HRMS. Un éventail diversifié de composés phénoliques appartenant à différents groupes a été identifié, soulignant les propriétés thérapeutiques potentielles de la plante. À la suite d’une analyse détaillée du spectre UV-visible, 112 composés ont été annotés, et chaque composé a été classé dans des groupes spécifiques [ ] [ ]. Les composés ont en outre été identifiés en examinant les principaux signaux m/z enregistrés en mode d’ions négatifs, ainsi que le temps de rétention et les données de la littérature, en utilisant à la fois les spectres MS en balayage complet et les spectres MS2 [ ]. L’analyse a révélé une présence importante de flavan-3-ols, le groupe le plus abondant, avec 22 composés distincts, incluant de multiples formes de procyanidine (dimère, trimère, tétramère et pentamère) [ ]. Les groupes les plus répandus suivants étaient les acides hydroxycinnamiques (HCA) et les flavonols, avec 12 composés identifiés dans chacun. Les ellagitanins et les flavones ont également montré une diversité notable, avec respectivement 10 et 11 composés. D’autres groupes identifiés, tels que les acides hydroxybenzoïques, les coumarines, les flavanones, les isocoumarines, etc., sont représentés par un plus petit nombre de composés dans l’extrait.
Une analyse HPLC suivie d’une dérivatisation post-colonne avec le réactif ABTS a été réalisée pour révéler la liste des composés de l’extrait d’AE possédant des propriétés antioxydantes. Cette réaction a provoqué un décalage notable du spectre UV-visible en modifiant les caractéristiques d’absorption du réactif ABTS, visible sous forme de décoloration. Des pics négatifs à 734 nm dans le chromatogramme ont indiqué la présence d’antioxydants dans l’éluat [ ]. Avant la dérivatisation, le détecteur DAD a identifié environ 30 composés majeurs à 270 nm dans les chromatogrammes de l’extrait d’AE [ ], dont 23 composés répartis en 8 groupes différents ont démontré une activité antioxydante après dérivatisation. Dix des flavan-3-ols sur 22 ont exprimé une activité antiradicalaire, contribuant de manière significative à la capacité antiradicalaire de l’extrait. Le deuxième groupe majeur était celui des flavonols, qui comprend six composés dotés de propriétés antioxydantes. Les propriétés antioxydantes de ces principaux composés phénoliques ont également été documentées dans la littérature [ ].
3.5. Analyse morphologique de l’apoptose par coloration au Hoechst 33258
Les cellules apoptotiques colorées au Hoechst 33258 peuvent être morphologiquement distinguées des cellules viables par la caryopycnose, les bords irréguliers de leurs noyaux et les signes de fragmentation nucléaire [ ], marqués par des flèches. Toutes les variantes de traitement ont induit une élévation du taux d’apoptose dans les cellules A549 par rapport au témoin non traité [ ]. Dans les cellules témoins, le taux d’apoptose (moyenne) était de 1,3 %, tandis qu’une incubation de 24 h avec AE 0,25 mg/mL a augmenté le taux de cellules apoptotiques à 5,8 % (p - ns ; [ ]). Les traitements avec AE 0,5 mg/mL ont augmenté les taux de cellules apoptotiques jusqu’à 9,6 % (p < 0,05 ; [ ]).
3.6. L’extrait d’AE module la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR
La voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR joue un rôle critique dans un large éventail de types de cancers, contribuant à des processus tels que la prolifération cellulaire anormale, les réponses hypoxiques dérégulées, les métastases et l’inflammation. Sur la base d’investigations antérieures sur des modèles de cancer et de la nature agressive de l’adénocarcinome pulmonaire, cette étude s’est concentrée sur la lignée cellulaire A549 de carcinome pulmonaire humain non à petites cellules (NSCLC) comme modèle expérimental. Cette lignée cellulaire a été choisie sur la base de données démontrant le rôle de la régulation à la baisse de la voie PI3K/Akt dans la mort cellulaire programmée des A549. L’objectif principal était d’étudier l’effet de l’extrait éthanolique d’A. eupatoria sur l’axe de signalisation PI3K et d’identifier, par une analyse d’amarrage in silico, des composés phytochimiques potentiels de l’AE présentant une forte affinité pour les composants de la voie PI3K. Les tests de cytotoxicité initiaux ont révélé que l’extrait d’AE exerce un effet cytotoxique modéré sur les cellules A549, avec une concentration de travail de 0,5 mg/mL utilisée pour les études mécanistiques. Bien que l’AE n’ait pas démontré une forte cytotoxicité in vitro, des études antérieures in vivo de notre groupe pour d’autres extraits végétaux (Hypericum alpestre et Rumex obtusifolius) ont montré une réduction prononcée de la taille des tumeurs avec des traitements similaires à base de plantes dépourvus de cytotoxicité directe. Cela a incité à approfondir la recherche pour déterminer si l’AE exerce des effets anticancéreux par la modulation des voies de signalisation.
L’effet de l’extrait d’AE sur les niveaux de phospho-PI3 kinase p85 et de PI3K totale a été mesuré sur les cellules A549. Sur la base des données obtenues, l’extrait d’AE semble avoir des effets inhibiteurs significatifs sur l’activité de la PI3K dans les cellules d’adénocarcinome pulmonaire A549 [ ]. L’extrait réduit la quantité totale de PI3K d’environ 30 %. Cela suggère que soit les composés de l’herbe affectent l’expression génique ou les protéines impliquées dans la synthèse de la PI3K, soit qu’ils interagissent directement avec la PI3K pour inhiber sa production. L’extrait réduit également la quantité de PI3K phosphorylée (activée) d’environ 50 %. La phosphorylation est une étape cruciale de l’activation de la PI3K, et l’inhibition de ce processus peut entraîner des déviations dans la voie métabolique de la PI3K. Les effets observés indiquent que les composés présents dans l’aigremoine commune peuvent influencer à la fois l’expression génique et la régulation protéique impliquées dans la synthèse de la PI3K. De plus, ils peuvent interagir directement avec la PI3K pour inhiber sa phosphorylation, empêchant ainsi son activation.
Pour activer la voie PI3K/Akt/mTOR, les cellules ont été traitées avec de l’insuline, un stimulateur en amont connu. Après stimulation par l’insuline, l’extrait d’AE a été appliqué et l’effet sur les niveaux des protéines PI3K, Akt et mTOR a été évalué par Western blot (WB) et immunocytochimie/immunofluorescence (ICC/IF). L’analyse par Western blot [ ] a révélé que l’AE à 0,5 mg/mL réduisait les niveaux de PI3K stimulés par l’insuline d’environ 20 % (p ≤ 0,05), d’Akt de 22 % (p ≤ 0,01) et de mTOR de 25 % (p ≤ 0,001). L’analyse ICC/IF [ ] a confirmé ces résultats. Le traitement par l’insuline a significativement augmenté l’intensité de fluorescence des composants PI3K/Akt/mTOR (augmentation de 2 à 4 fois ; p ≤ 0,001), tandis que l’extrait d’AE réduisait l’intensité de la PI3K d’environ 2,3 fois (p ≤ 0,05), celle d’Akt d’environ 40 % (p ≤ 0,05) et celle de mTOR de 35 % (p ≤ 0,05). Les données ELISA complémentaires ont démontré une diminution des niveaux de PI3K totale et phosphorylée après traitement par l’AE, corroborant les résultats du WB et de l’ICC.
Pour évaluer davantage l’impact de l’AE sur les processus en aval associés à la PI3K, nous avons examiné l’expression de HIF-1α, COX-2 et MMP-2 sous stimulation par l’insuline. Ces marqueurs sont étroitement liés respectivement à l’hypoxie, à l’inflammation et aux métastases. La stimulation par l’insuline a significativement régulé à la hausse ces trois marqueurs. Cependant, l’extrait d’AE a efficacement inhibé leur expression [ ] : les niveaux de HIF-1α et de MMP-2 ont été réduits de 3 et 5 fois (p ≤ 0,05), et les niveaux de COX-2 ont également montré une diminution statistiquement significative (p ≤ 0,05). Enfin, l’expression de la Caspase-3 a été évaluée pour apprécier l’activité pro-apoptotique potentielle de l’AE. Comme le montre [ ], l’extrait d’AE a modestement renforcé l’expression de la Caspase-3, avec des effets comparables au témoin positif Doxorubicine (DOX), comme confirmé à la fois par ICC et par les études de condensation de la chromatine (coloration au Hoechst). Ces résultats, associés aux données MTT, suggèrent que l’AE peut modérément induire l’apoptose dans les cellules A549.
3.7. Amarrage moléculaire et ADME
Des évaluations d’amarrage moléculaire ont été menées à l’aide d’AutoDock Vina sur la poche de liaison définie par la structure cristalline de la PI3K complexée avec un inhibiteur pyrrolopyridinone qui a été utilisé comme référence (PDB ID : 6C1S). Cette analyse comprenait le ré-amarrage de l’inhibiteur de référence ainsi que de 33 composés identifiés dans l’extrait, en se concentrant principalement sur leurs affinités de liaison.
Les composés majeurs de l’extrait ont été marqués pour les études d’amarrage informatique sur la base de l’intensité des pics des chromatogrammes MS et UV [ ]. Les propriétés pharmacocinétiques, telles que la masse moléculaire (MW), le nombre d’accepteurs de liaisons hydrogène (HBA), le nombre de donneurs de liaisons hydrogène (HBD) et le coefficient de partage octanol-eau (logP), ont été déterminées par calcul pour chaque composé [ ]. Ces propriétés ont été évaluées au regard de la règle des cinq de Lipinski, qui fixe les seuils acceptables pour des caractéristiques optimales de type médicament.
Parmi les composés étudiés, la quercétine xylosyl rutinoside, l’agrimonine et le taxifoline glucoside ont montré les affinités de liaison les plus élevées, respectivement à −10,3, −9,9 et −9,7 kJ/mol. Cependant, ces trois composés dépassaient au moins un critère de la règle des cinq de Lipinski, l’agrimonine enfreignant notablement trois règles en raison de sa masse moléculaire élevée (1871,3) et de ses nombres élevés de HBA et de HBD.
Globalement, parmi les 10 composés présentant des affinités de liaison supérieures à celle de la référence, seule la tricoumaroyl-spermidine maintenait une violation minimale, n’enfreignant qu’une seule règle avec une masse moléculaire de 583,67 Da. Les composés restants enfreignaient la règle deux ou trois fois, indiquant des difficultés potentielles dans leurs profils de développement de médicament en raison de préoccupations pharmacocinétiques.
En revanche, parmi les 22 composés présentant des énergies de liaison inférieures à celle de la référence, une fraction substantielle, à savoir 14, montrait une conformité totale avec la règle des cinq de Lipinski. Par exemple, des composés tels que la catéchine et le pinorésinol, avec des énergies de liaison de −8,4 et −7,8 kJ/mol respectivement, n’affichaient aucune violation, suggérant une meilleure adéquation selon les critères de la règle.
3.8. Analyse de l’interaction tricoumaroyl-spermidine – PI3K
Dans l’analyse informatique des interactions entre la tricoumaroyl-spermidine et la protéine PI3K, des prédictions détaillées illustrent la base moléculaire de l’affinité de liaison observée. L’ancrage stable de la tricoumaroyl-spermidine au sein du site catalytique compétitif de l’ATP de la PI3K est facilité par de multiples liaisons hydrogène. Ces interactions clés impliquent principalement des résidus critiques de la région charnière, à savoir ASP950 et GLU880, essentiels pour arrimer les inhibiteurs compétitifs de l’ATP et confirmant le mécanisme d’action potentiel du composé. Des liaisons hydrogène supplémentaires avec ILE881 et ASP964 renforcent encore l’interaction, facilitant une configuration de liaison robuste. De plus, la tricoumaroyl-spermidine s’engage dans une variété d’autres interactions non covalentes qui stabilisent davantage sa conformation au sein de la protéine. Notamment, des interactions pi-anion avec ASP950 et des interactions pi-alkyle avec LYS890 et ILE963 indiquent un réseau dense de contacts contribuant à une forte affinité de liaison. Des interactions pi-soufre avec MET953 et des interactions défavorables donneur-donneur, bien que généralement moins souhaitables, sont également présentes et peuvent influencer le comportement dynamique du ligand au sein du site actif [ ].
La visualisation 3D de la tricoumaroyl-spermidine amarrée dans la poche de liaison de la PI3K illustre un positionnement précis et optimal au sein du site actif de l’enzyme. La molécule est située de manière à obtenir une complémentarité de surface substantielle avec les contours de la poche de liaison, suggérant un degré élevé de potentiel d’interaction moléculaire. La visualisation indique un ajustement étroit, ce qui est critique pour une inhibition efficace de l’activité de la PI3K [ ].
4. Discussion
Cette étude fournit des preuves convaincantes que l’extrait d’A. eupatoria L. exerce de puissants effets modulateurs sur la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR et ses effecteurs en aval, malgré une cytotoxicité seulement modérée in vitro dans les cellules A549. Les résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle certains composés d’origine végétale peuvent ne pas tuer directement les cellules cancéreuses mais reprogrammer les réseaux de signalisation, entraînant des effets antitumoraux indirects tels qu’une prolifération réduite, une inhibition des métastases et une apoptose renforcée. Nos résultats montrent que l’AE régule significativement à la baisse l’expression de PI3K, Akt et mTOR, suggérant une interférence avec l’une des voies oncogéniques les plus centrales du NSCLC. De plus, l’AE a supprimé des molécules clés associées à l’hypoxie et aux métastases, HIF-1α et MMP-2, toutes deux connues pour être des cibles transcriptionnelles de l’axe PI3K/Akt/mTOR. La régulation à la baisse de COX-2 indique en outre des effets anti-inflammatoires potentiels de l’AE, qui pourraient avoir des implications plus larges dans le microenvironnement tumoral. Notamment, l’activation modeste de la Caspase-3 met en évidence le potentiel de l’AE à sensibiliser les cellules cancéreuses à l’apoptose, en particulier en association avec des chimiothérapeutiques classiques tels que la Doxorubicine. D’un point de vue pharmacologique, ces effets multi-cibles soulignent le potentiel de l’AE comme agent polypharmacologique, particulièrement précieux dans des maladies complexes comme le cancer, où les monothérapies échouent souvent en raison de la diaphonie et de la redondance des voies.
Pour l’analyse cellulaire, notre approche expérimentale a impliqué la sélection de différentes lignées de cellules cancéreuses pour répondre à des questions biologiques spécifiques. Pour le criblage initial de cytotoxicité à large spectre (test MTT), un panel de lignées cellulaires diverses (HT-29, MCF-7, A549, HeLa) a été utilisé pour évaluer le potentiel cytotoxique général de l’extrait d’AE à travers divers types de tumeurs. Les lignées de cellules cancéreuses ont été sélectionnées sur la base de la littérature démontrant leur dépendance à une signalisation PI3K/Akt/mTOR dérégulée. Plus précisément, les cellules MCF-7 hébergent fréquemment des mutations activatrices de PIK3CA, les cellules HT-29 présentent une activation constitutive de la voie PI3K, les cellules HeLa possèdent une signalisation PI3K très active en raison de la transformation par le HPV, et les cellules A549 montrent une activité PI3K/Akt pilotée par l’EGFR. Les propriétés d’inhibition de la croissance des cellules cancéreuses de l’extrait d’AE ont également été montrées par d’autres auteurs. Par exemple, Ad’hiah et al. ont démontré que l’extrait d’AE présente une activité inhibitrice élevée contre les cellules cancéreuses de rhabdomyosarcome (RD) et HeLa testées, alors qu’il n’était pas cytotoxique contre les cellules fibroblastiques embryonnaires normales de souris testées. Pour les études mécanistiques approfondies ultérieures, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur la lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire A549. Bien que les cellules A549 aient démontré une résistance modérée à la cytotoxicité directe, elles constituent un modèle bien établi où la voie PI3K/Akt est un moteur critique de la malignité. Ce choix nous a permis d’étudier la capacité de l’extrait à moduler des voies oncogéniques clés indépendamment d’une mort cellulaire élevée et immédiate, ce qui était une hypothèse centrale de notre étude. Inversement, pour l’évaluation de la génotoxicité, la lignée cellulaire hautement sensible HT-29 a été utilisée pour maximiser la possibilité de détecter tout effet endommageant l’ADN. Une considération importante dans l’interprétation des résultats obtenus est la relation entre l’initiation de l’apoptose et la viabilité cellulaire globale au point de 24 heures. Nos résultats montrent que le traitement des cellules A549 avec l’extrait d’AE (0,25 et 0,5 mg/mL) pendant 24 h a induit une condensation nucléaire significative [ ], une caractéristique morphologique clé de l’apoptose. Cependant, dans ces mêmes conditions, le test MTT n’a pas détecté de réduction significative de la croissance ou de la viabilité cellulaire [ ].
Cette apparente contradiction peut être réconciliée en considérant les critères biologiques distincts mesurés par chaque test. Le test MTT quantifie l’activité métabolique globale de la population cellulaire, servant d’indicateur de la viabilité cellulaire. L’absence de diminution significative du signal MTT à 24 h indique que la majeure partie de la population cellulaire n’avait pas encore subi d’effondrement métabolique ni été éliminée. En revanche, la coloration au Hoechst et l’immunocytochimie de la Caspase-3 sont des détecteurs sensibles de l’initiation du programme apoptotique. Comme l’apoptose est un processus qui se déroule sur une période, nos résultats suggèrent donc qu’à 24 h, l’extrait d’AE avait réussi à déclencher des voies de signalisation pro-apoptotiques dans une fraction des cellules, entraînant une condensation nucléaire observable et une expression accrue de la Caspase-3. Cependant, cet état apoptotique précoce n’avait pas encore progressé vers une mort cellulaire généralisée et la perte de fonction métabolique correspondante à travers toute la culture. Ainsi, les résultats sont cohérents, indiquant que l’effet principal de l’extrait à 24 h est pro-apoptotique et cytostatique, plutôt que franchement cytotoxique. La cytotoxicité plus prononcée observée dans le test MTT au point de 72 heures reflète probablement l’aboutissement de ce processus apoptotique initié.
Nos résultats selon lesquels l’extrait d’AE peut moduler la voie PI3K/Akt/mTOR concordent avec un ensemble croissant de preuves démontrant le potentiel des composés phytochimiques comme agents anticancéreux ciblant cet axe de signalisation critique. Un nombre considérable de composés d’origine végétale ont été identifiés comme inhibiteurs de PI3K/Akt, soulignant la valeur des produits naturels dans la découverte de médicaments anticancéreux. Par exemple, des flavonoïdes bien étudiés comme la quercétine, des polyphénols tels que le resvératrol du raisin et la curcumine du curcuma ont tous été largement documentés pour exercer leurs effets anticancéreux, au moins en partie, en régulant à la baisse des composants clés de la voie PI3K/Akt/mTOR. L’identification de la tricoumaroyl-spermidine comme inhibiteur potentiel issu d’A. eupatoria ajoute un composé nouveau à cette liste et renforce l’importance d’explorer diverses sources végétales pour de nouvelles pistes thérapeutiques.
L’investigation des propriétés antioxydantes de l’extrait d’A. eupatoria souligne la complexité inhérente à la compréhension des interactions entre la composition chimique d’un extrait végétal et ses activités biologiques. L’AE est riche en flavonoïdes et en composés phénoliques, connus pour leurs propriétés antioxydantes, et ce fait est fortement évident dans les tests chimiques standard où l’extrait a démontré une activité de piégeage des radicaux. L’analyse HPLC suivie d’une dérivatisation post-colonne avec le réactif ABTS a montré que, sur 32 composés majeurs détectés par le détecteur DAD dans l’extrait d’AE, 22 possédaient des propriétés antiradicalaires, également rapportées dans la littérature [ ]. En contraste avec cela, les résultats du test d’activité antioxydante cellulaire (CAA), qui reproduit plus étroitement les conditions biologiques, ont montré que l’AE présentait des propriétés pro-oxydantes au sein de l’environnement cellulaire. Cela indique que les effets de l’extrait peuvent varier significativement selon les différentes conditions de test, reflétant la complexité des systèmes biologiques par rapport aux modèles in vitro. Une teneur élevée en composés phénoliques et une activité antioxydante de l’extrait d’AE dans différents tests chimiques ont également été montrées dans diverses études. Cependant, son double effet a été rapporté pour la première fois par nous. Ce double effet peut être dû au phénomène selon lequel, en présence d’ions métalliques, ces composés polyphénoliques peuvent subir un cycle redox, conduisant à la génération d’ERO. La double activité de l’AE peut potentiellement être exploitée à des fins thérapeutiques, telles que le ciblage des cellules cancéreuses en induisant un stress oxydatif. Les propriétés pro-oxydantes de l’extrait peuvent causer des dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses, ce qui a été détecté dans nos résultats. En particulier, la concentration de 0,5 mg PS/mL de l’extrait d’AE a induit des dommages à l’ADN dans les cellules HT-29, ce qui peut résulter de ses propriétés pro-oxydantes. La génotoxicité de l’extrait méthanolique d’AE a également été montrée par Pukalskienė et al. Dans certaines conditions, les antioxydants peuvent avoir des effets additifs pendant les dommages oxydatifs. Cela peut se produire lorsque les antioxydants influencent des voies de signalisation en stimulant des mécanismes cellulaires pro-oxydants et en conduisant à un stress oxydatif accru. Un exemple notable de ce phénomène est l’action de la vitamine C qui, malgré sa reconnaissance généralisée comme antioxydant puissant, peut dans certaines circonstances agir comme un pro-oxydant, en particulier en présence de métaux de transition, entraînant des dommages oxydatifs accrus causés par le peroxyde d’hydrogène. La possible génotoxicité dans les cellules normales reste une question importante qui devra être abordée dans les futures évaluations toxicologiques.
Le phénomène où les antioxydants stimulent des cascades pro-oxydatives implique plusieurs mécanismes et cibles cellulaires. Les polyphénols peuvent exercer des effets pro-oxydants par des mécanismes tels que le cycle redox avec des ions métalliques de transition (par exemple Fe³⁺ et Cu²⁺), qui peuvent catalyser la réaction de Fenton pour produire des radicaux hydroxyles hautement réactifs (•OH) qui endommagent l’ADN, les protéines et les lipides. De plus, selon leur concentration, ces composés peuvent subir une autoxydation en réagissant avec l’oxygène, conduisant à la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) comme les anions superoxydes (O₂•⁻). À de fortes concentrations, les antioxydants peuvent submerger les systèmes de défense cellulaire, par exemple en inhibant l’activité d’enzymes protectrices comme la catalase ou la superoxyde dismutase (SOD), conduisant à une accumulation d’ERO. Cela fournit une base théorique solide pour la génotoxicité observée dans les cellules cancéreuses traitées avec l’extrait d’AE, car ce stress oxydatif induit peut directement conduire à des dommages à l’ADN.
L’analyse LC-Q-Orbitrap HRMS a révélé la présence de divers composés bioactifs discutés dans le [ ]. Ce profilage complet non seulement confirme la composition chimique complexe d’A. eupatoria mais soutient également son usage traditionnel en médecine par les plantes, fournissant une base scientifique pour son application dans la thérapeutique moderne. La présence de composés bioactifs indique des bénéfices potentiels pour la santé, allant des effets anti-inflammatoires et antimicrobiens aux propriétés antioxydantes et anticancéreuses. La caractérisation phytochimique de l’extrait d’AE poussant dans différentes régions du monde a également été réalisée par plusieurs auteurs. La présence d’une grande variété de substances biologiquement actives dans les extraits d’AE a déjà été démontrée. Malgré de nombreuses études, aucune n’a annoté un nombre plus élevé de composés phénoliques dans l’extrait d’AE que la présente étude. Par conséquent, nos résultats enrichissent la base de données des constituants de l’AE et peuvent être importants pour une compréhension plus complète des bioactivités de cette herbe, de ses mécanismes d’action potentiels, ainsi que des rôles et des interactions de ses divers composés.
Les études d’amarrage moléculaire ont fourni des éclairages sur les affinités de liaison des composés majeurs de l’AE avec la voie PI3K. Les données présentées dans cette étude révèlent des interrelations complexes entre l’affinité de liaison et le respect de la règle des cinq de Lipinski, un référentiel établi pour évaluer le caractère de type médicament. Les composés présentant les affinités de liaison les plus élevées pour la PI3K, tels que la quercétine xylosyl rutinoside, l’agrimonine et le taxifoline glucoside, présentaient généralement de multiples violations de la règle de Lipinski. Cette tendance suggère un compromis potentiel entre l’affinité de liaison et la viabilité pharmacocinétique, un aspect qui peut affecter significativement la progression de ces composés dans les pipelines de développement de médicaments. Ces composés à haute affinité ont souvent des masses moléculaires importantes et un nombre élevé d’accepteurs et de donneurs de liaisons hydrogène. De telles caractéristiques moléculaires indiquent la capacité à former de multiples interactions au sein de la poche de liaison de la protéine, ce qui, bien que bénéfique pour l’affinité, entrave potentiellement la biodisponibilité, la perméabilité et la stabilité métabolique de ces molécules. En effet, la présence de multiples donneurs et accepteurs de liaisons hydrogène peut améliorer la solubilité dans l’eau mais peut aussi augmenter la probabilité d’être un substrat pour les transporteurs d’efflux ou d’être métaboliquement instable, réduisant ainsi leur efficacité globale en tant que candidats-médicaments.
Inversement, les composés qui respectent strictement la règle des cinq de Lipinski montraient généralement des affinités de liaison inférieures à celle du composé de référence. Cette observation concorde avec l’idée que, bien que de tels composés soient plus susceptibles de posséder des propriétés favorables de type médicament, ils peuvent manquer d’interactions de liaison suffisantes nécessaires à une modulation efficace de la cible. Cette dichotomie met en évidence les défis inhérents à la découverte de médicaments, où l’affinité de liaison optimale doit être équilibrée avec les propriétés pharmacocinétiques pour garantir à la fois l’efficacité et la sécurité.
Cependant, la tricoumaroyl-spermidine se distingue comme une exception notable. Ce composé a non seulement démontré une meilleure affinité de liaison que l’inhibiteur de référence, mais il a également maintenu une déviation minimale par rapport aux critères établis de caractère de type médicament, ne violant qu’une seule règle concernant la masse moléculaire, qui dépasse marginalement le seuil fixé par la règle de Lipinski. Fait intéressant, sa masse moléculaire est proche de 500, ce qui peut ne pas affecter significativement ses propriétés pharmacocinétiques, suggérant une altération gérable pour l’optimisation. Le fait que la tricoumaroyl-spermidine s’aligne étroitement sur les paramètres de Lipinski tout en présentant une forte affinité de liaison en fait un candidat prometteur pour une investigation plus poussée.
Le profil unique de la tricoumaroyl-spermidine suggère qu’elle pourrait maintenir une biodisponibilité et une stabilité métabolique adéquates tout en interagissant efficacement avec la protéine cible, un scénario idéal en conception de médicaments.
L’analyse informatique de l’interaction tricoumaroyl-spermidine – PI3K a révélé des preuves visuelles convaincantes du potentiel de ce composé à agir comme un inhibiteur potentiel de PI3K. La pose d’amarrage optimale, caractérisée par des interactions étroites et étendues avec le site actif de l’enzyme, soutient les prédictions informatiques et les données d’affinité de liaison observées. Cet ajustement n’est pas seulement superficiel, mais est soutenu par une gamme d’interactions qui stabilisent la molécule au sein de la poche de liaison, ce qui est essentiel pour une inhibition efficace. Malgré sa masse moléculaire légèrement plus élevée, qui dépasse légèrement le seuil habituel de la règle des cinq de Lipinski, la configuration du composé lui permet de maintenir un niveau élevé d’interaction sans encombrement stérique significatif ni dynamique défavorable qui pourrait entraver sa liaison. Cet équilibre entre la taille, la fonctionnalité et l’ajustement au sein du site de liaison est crucial et suggère que la tricoumaroyl-spermidine pourrait conserver de bonnes propriétés pharmacocinétiques malgré sa déviation par rapport à l’une des règles de Lipinski.
En outre, les prédictions informatiques soulignent le profil d’interaction multifacette de la tricoumaroyl-spermidine avec la protéine PI3K, qui est critique pour son affinité de liaison renforcée. Les liaisons hydrogène, en particulier celles avec des résidus clés comme ASP950 et GLU880, sont indicatives d’interactions fortes et spécifiques susceptibles de contribuer à l’efficacité de la tricoumaroyl-spermidine comme inhibiteur de kinase. La présence de multiples types d’interactions, y compris des interactions pi et des liaisons hydrogène, suggère que la tricoumaroyl-spermidine est capable de former un réseau d’interactions complexe mais stable au sein de la poche de liaison de la PI3K. Les interactions supplémentaires, en particulier pi-alkyle et pi-anion, peuvent compenser toute instabilité potentielle causée par les interactions défavorables donneur-donneur, mettant en évidence un profil d’interaction équilibré propice à une efficacité de liaison élevée. Des ajustements structuraux pourraient potentiellement réduire les interactions défavorables et renforcer les interactions favorables, optimisant à la fois l’affinité de liaison et les caractéristiques de type médicament sans altérer significativement la structure centrale du composé. Cette approche pourrait conduire au développement d’un inhibiteur de PI3K plus puissant et sélectif fondé sur le squelette de la tricoumaroyl-spermidine, justifiant une investigation plus poussée de son potentiel thérapeutique.
D’après la littérature, la tricoumaroyl-spermidine a été trouvée dans plusieurs aliments, tels que la courge d’hiver, le riz rouge, le pois commun et l’aubergine, dans les fleurs du thé Tieguanyin, chez des espèces de Potentilla, ainsi que dans le miel de Castanopsis. Une activité hépatoprotectrice remarquable de la tricoumaroyl-spermidine issue d’une rose a été montrée dans des cellules HepG2. Il n’existe aucune autre preuve dans la littérature concernant d’autres bioactivités de ce composé.
Limites de l’étude
Cette étude comporte plusieurs limites qui doivent être reconnues. Premièrement, le matériel végétal provenait d’une seule région géographique d’Arménie, ce qui peut ne pas tenir compte de la variabilité chimique potentielle d’A. eupatoria L. provenant d’autres localités. Deuxièmement, bien que nos résultats sur la cytotoxicité et l’inhibition de la PI3K soient prometteurs, l’étude manque de données in vivo complètes, et des investigations supplémentaires sur les profils de toxicité et les propriétés pharmacocinétiques de l’extrait brut comme de la tricoumaroyl-spermidine isolée sont nécessaires. Les futures investigations devraient également inclure des anticorps phospho-spécifiques (par exemple p-Akt Ser473, p-mTOR Ser2448) pour caractériser pleinement l’état d’activation de la voie PI3K/Akt/mTOR dans les conditions de traitement. Bien que notre étude fournisse des preuves préliminaires d’apoptose via la coloration au Hoechst et la régulation à la hausse de la caspase-3 totale, une confirmation supplémentaire à l’aide de la détection de la caspase-3 clivée et de la cytométrie en flux Annexine V/IP est nécessaire. Ce seront des priorités pour nos futures études planifiées. De plus, les effets pro-oxydants observés et la génotoxicité modeste justifient une investigation plus poussée dans des cellules normales, non cancéreuses, afin d’évaluer pleinement la fenêtre thérapeutique. Enfin, bien que la tricoumaroyl-spermidine ait été identifiée comme un fort inhibiteur potentiel, l’activité biologique globale de l’extrait est probablement due aux effets synergiques de multiples constituants, et d’autres composés identifiés méritent également une validation expérimentale plus poussée.
5. Conclusion
En conclusion, l’extrait éthanolique d’Agrimonia eupatoria L. démontre un effet anticancéreux multidimensionnel, découlant de sa riche composition phénolique qui confère une activité cytotoxique et induit un stress oxydatif dans les cellules cancéreuses. Le mécanisme principal que nous avons validé est la puissante inhibition de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR dans les cellules A549. Nos données expérimentales confirment que l’extrait réduit significativement l’expression de PI3K, Akt et mTOR, ainsi que des effecteurs en aval liés à l’hypoxie (HIF-1α), à l’inflammation (COX-2) et au potentiel métastatique (MMP-2). La molécule bioactive tricoumaroyl-spermidine, identifiée par analyse informatique, est un candidat prometteur vraisemblablement impliqué dans ces effets. Malgré sa cytotoxicité directe modérée, l’extrait d’AE agit comme un agent modulateur de voie, renforçant l’apoptose et suggérant son potentiel comme adjuvant aux thérapies existantes. Ces résultats justifient une validation in vivo plus poussée et l’isolement de ses composés clés afin de développer pleinement des stratégies phytochimiques intégratives pour le traitement du cancer.