Effets vasculaires des polyphénols d’Agrimonia eupatoria L. et rôle de l’isoquercitrine dans son potentiel vasorelaxant dans les artères humaines
Référence : Pharmaceuticals 2022. — PMC9143967/PMID 35631463 · DOI 10.3390/ph15050638 Type : etude ex vivo · Plante : Aigremoine eupatoire · Propriété → Circulation & coeur Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Agrimonia eupatoria L. a été traditionnellement utilisée pour le traitement des maladies inflammatoires, mais aussi comme hypotenseur. À notre connaissance, une seule étude a précédemment suggéré une amélioration de la fonction endothéliale vasculaire dans des conditions diabétiques, tandis que les mécanismes sous-jacents et les composés responsables sont inconnus. Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer les effets vasculaires directs d’Agrimonia eupatoria L. dans des artères humaines. L’infusion a provoqué une légère augmentation du tonus vasculaire basal et une potentialisation significative de la contraction adrénergique de 49,18 % à 0,02 mg/mL, suggérant la présence de composés dotés d’une légère activité vasoconstrictrice. À l’inverse, la fraction acétate d’éthyle a inhibé la contraction adrénergique de 80,65 % à 2 mg/mL et n’a exercé aucun effet sur le tonus vasculaire basal. Une vasorelaxation puissante dépendante de la concentration a été observée à la fois pour l’infusion et pour la fraction acétate d’éthyle (relaxation maximale supérieure à 76 % et 47 %, respectivement). L’inhibition de la synthase de l’oxyde nitrique et de la cyclo-oxygénase a provoqué des diminutions significatives de la vasorelaxation induite par l’infusion, tandis que, pour la fraction acétate d’éthyle, seule la voie de la cyclo-oxygénase semblait être impliquée. L’isoquercitrine a provoqué une vasoactivité cohérente avec celle de la fraction acétate d’éthyle, suggérant qu’il s’agit d’un composant majeur responsable des propriétés vasorelaxantes d’A. eupatoria. Des recherches supplémentaires sont justifiées afin d’évaluer pleinement ses propriétés vasoprotectrices avec un potentiel thérapeutique dans plusieurs affections, par exemple l’athérosclérose.
1. Introduction
Agrimonia eupatoria L. (A. eupatoria) est une plante appartenant à la famille des Rosaceae et largement distribuée en Europe, en Asie, en Amérique du Nord et en Afrique. En médecine populaire, cette plante a été principalement utilisée pour le traitement des maladies inflammatoires, en raison de sa teneur élevée en polyphénols, mais son usage ethnomédicinal comme hypotenseur a également été rapporté. De plus, le potentiel antidiabétique d’A. eupatoria a été montré, impliquant plusieurs mécanismes allant de la formation et de l’absorption du glucose à la sécrétion d’insuline.
Concernant ses effets vasculaires, une amélioration de la vasorelaxation induite par l’acétylcholine a été montrée dans des anneaux aortiques isolés d’animaux diabétiques traités par l’extrait aqueux d’A. eupatoria, comparativement à des animaux diabétiques non traités mais non à des témoins sains. Comme il a été suggéré que la teneur élevée en polyphénols jouait un rôle dans cette protection vasculaire, il reste à préciser si l’amélioration de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium était liée aux effets antidiabétiques de cet extrait ou à un effet direct sur le système vasculaire. À notre connaissance, aucune autre étude n’a rapporté les effets directs de cette plante sur le système vasculaire, et les mécanismes sous-jacents sont inconnus, de même que les composés responsables.
Dans ce contexte, nous avons cherché à évaluer les effets vasculaires directs d’A. eupatoria dans des artères thoraciques internes humaines (ATI). À cette fin, nous avons testé l’activité vasculaire d’une infusion, d’une fraction acétate d’éthyle (EtOAc) et des trois principaux constituants de ces extraits, c’est-à-dire l’isoquercitrine, le tiliroside et l’acide p-coumarique. En outre, nous avons évalué le rôle des deux principales voies endothéliales, c’est-à-dire l’oxyde nitrique (NO) et la cyclo-oxygénase (COX), dans sa bioactivité vasculaire. Ici, nous avons montré que les extraits d’A. eupatoria présentent une activité vasorelaxante puissante dans les artères humaines, médiée par les voies NO et COX pour l’infusion et spécifiquement par la COX pour la fraction EtOAc. Parmi les composés testés, l’isoquercitrine s’est révélée responsable des propriétés vasorelaxantes de la fraction EtOAc d’A. eupatoria. Des recherches supplémentaires sont justifiées afin d’évaluer pleinement ses propriétés vasoprotectrices avec un potentiel thérapeutique dans plusieurs affections, par exemple l’athérosclérose.
2. Résultats
2.1. Profil phytochimique de l’infusion et de la fraction EtOAc
Le profil phénolique de l’infusion et de la fraction EtOAc d’A. eupatoria a été déterminé par HPLC-PDA (Figure 1A,B, respectivement).
Concernant l’infusion, le spectre UV du pic 1 suggère la présence d’un dérivé de l’acide benzoïque (maximum de longueur d’onde proche de 313 nm). Le pic 2, avec des maxima de longueur d’onde à 310 nm, a été identifié comme l’acide p-coumarique au moyen du composé étalon commercial. Les pics 3, 4 et 5 étaient des dérivés 3-O-glycosylés de la quercétine, comme le suggère leur profil spectral UV, avec une bande I proche de 350 nm, avec une absorptivité plus faible que la bande II, avec des maxima de longueur d’onde proches de 250 nm et un épaulement à environ 265 et 295 nm. Le pic 4 a été identifié comme l’isoquercitrine (quercétine 3-O-glucoside) par comparaison du temps de rétention avec un étalon commercial. Les pics 3 et 5 avaient été précédemment identifiés au moyen de la HPLC-PDA-ESI/MSn, respectivement comme quercétine O-galloyl-hexoside et quercétine O-malonyl-hexoside. Dans le pic 6, les spectres UV, le temps de rétention et les maxima de longueur d’onde proches de 265 et 346 nm, avec un épaulement près de 314 nm, suggéraient la présence de kaempférol O-p-coumaroyl-glucoside (tiliroside), comme confirmé avec un étalon commercial. Le pic 7 présentait un profil spectral UV avec des maxima de longueur d’onde de 248 et 371 nm et un épaulement à 322 nm, caractéristique de l’acide ellagique, également confirmé avec le composé étalon. Les proanthocyanidines ont été détectées en raison de leurs profils spectraux caractéristiques et de leurs maxima UV (près de 246 et 278 nm). La caractérisation complète des composants du mélange avait été précédemment réalisée et publiée dans Santos et al.
Dans le chromatogramme EtOAc (Figure 1B), le pic 8 a été identifié comme l’acide p-coumarique. Les pics 9 et 11, avec des maxima de longueur d’onde à 272 et 335, étaient caractéristiques de dérivés de l’apigénine. Le pic 11 a été identifié comme l’isovitexine avec un étalon commercial. Les pics 10, 12, 13, 14 et 17 présentaient des spectres de profil UV caractéristiques des dérivés de la quercétine. Plus précisément, le pic 12 a été identifié comme l’isoquercitrine, également rapportée dans l’infusion (pic 4). Les pics 10 et 13 suggèrent la présence de quercétine O-galloyl-hexoside et de quercétine O-malonyl-hexoside, respectivement. Ces composés avaient été précédemment rapportés et identifiés par HPLC-PDA-ESI/MSn ; en outre, ces composés étaient également présents dans l’infusion (pics 3 et 5). Le pic 15 a été identifié comme l’acide ellagique, également identifié dans l’infusion (pic 7). Les pics 16, 21 et 25 montraient des spectres UV, un temps de rétention et des maxima de longueur d’onde proches de 265 et 346 nm, avec un épaulement à 314 nm. Ce comportement est caractéristique des dérivés du kaempférol. Le pic 16 a été identifié comme le tiliroside. Ce composé a également été identifié dans l’infusion (pic 6). Les pics 18, 19 et 20 ont également été identifiés comme des dérivés du kaempférol en raison du profil UV et des maxima de longueur d’onde à 264 nm, 346 nm et d’un épaulement à 296 nm. Enfin, le pic 19 a été identifié comme le kaempférol-O-malonyl-hexoside par HPLC-PDA-ESI/MSn.
Sur la base des chromatogrammes, l’acide p-coumarique, le tiliroside et les dérivés de la quercétine ont été identifiés comme les principaux constituants de l’infusion et de la fraction EtOAc et ont donc été quantifiés par HPLC (Tableau 1). Comme on peut le voir, les dérivés de la quercétine constituaient la principale classe de composés dans les deux extraits.
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2.2. Effets vasculaires
2.2.1. Infusion
L’infusion d’A. eupatoria a induit une légère augmentation du tonus vasculaire basal (E_max = 1,10 ± 0,67 mN ; pEC_50 = 2,72 ± 0,51, p < 0,05 vs véhicule). De plus, la concentration la plus faible d’infusion (0,02 mg/mL) a provoqué une potentialisation significative de la contraction induite par la noradrénaline (Figure 2A et Tableau 2), avec une augmentation de l’E_max de 49,18 % vs témoin (p < 0,001, Figure 2A). Cette réponse était également significativement plus élevée que celles observées avec les autres concentrations d’infusion (0,2 et 2 mg/mL), qui n’ont entraîné qu’une diminution significative de la puissance par comparaison au témoin : 0,2 mg/mL (p < 0,05) et 2 mg/mL (p < 0,001).
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Ensuite, nous avons évalué l’activité vasorelaxante de l’infusion et le rôle des deux principales voies endothéliales de vasorelaxation, c’est-à-dire COX et NO. Comme on peut le voir, l’infusion a induit une vasorelaxation marquée dépendante de la concentration (R_max de 88,99 ± 18,89 % et 76,88 ± 6,98 %, respectivement dans la Figure 2B,C). L’incubation avec l’indométacine (inhibiteur de la COX) a produit une diminution significative de la vasorelaxation maximale induite par l’infusion (p < 0,01 10 µM vs témoin et p < 0,05 100 µM vs témoin, Figure 2B). L’incubation avec L-NMMA (inhibiteur de la synthase du NO) a provoqué des diminutions significatives de la vasorelaxation maximale à toutes les concentrations testées (Figure 2C).
2.2.2. Fraction EtOAc
La fraction EtOAc n’a induit aucun changement du tonus vasculaire basal (E_max = 0,12 ± 0,32 mN ; pEC_50 = 2,67 ± 3,69, p < 0,05 vs infusion). En outre, la concentration la plus faible (0,02 mg/mL) n’a modifié la contraction induite par la noradrénaline qu’aux concentrations intermédiaires de noradrénaline (diminutions statistiquement significatives de 27,13 % et 27,72 %, p < 0,05 dans la Figure 2D), même si aucune différence significative n’a été détectée en efficacité ou en puissance vs témoin (Tableau 3). De plus, la concentration la plus élevée de la fraction EtOAc (2 mg/mL) a provoqué une diminution significative de 80,65 % de l’E_max dans les courbes concentration-réponse cumulatives (CCRC) à la noradrénaline (Figure 2D), suggérant ainsi une diminution de l’efficacité.
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La fraction EtOAc a provoqué un effet vasorelaxant (R_max = 47,97 ± 6,55 %, Figure 2E), qui a été complètement aboli par la dénudation endothéliale (R_max = −25,37 ± 39,05 % ; données non montrées dans le graphique), suggérant ainsi que cet effet dépend de l’endothélium. De même, le rôle des voies NO et COX a également été évalué. L’incubation avec 10 μM de L-NMMA a produit une diminution non significative de la vasorelaxation induite par la fraction EtOAc (R_max = 25,14 ± 17,80 %, Figure 2E). À l’inverse, l’incubation avec 10 μM d’indométacine a diminué significativement la vasorelaxation (R_max = 12,45 ± 3,78 %, p < 0,001 vs témoin, Figure 2E).
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Compte tenu de cette diminution significative de la relaxation lors de l’incubation avec l’indométacine, nous avons émis l’hypothèse que le prostanoïde dérivé de la COX, la prostacycline, pourrait être responsable de cet effet vasorelaxant. Cependant, l’incubation avec l’antagoniste sélectif du récepteur IP (Ro 1138452) a produit une diminution non significative de la relaxation maximale induite par la fraction EtOAc (R_max = 24,33 ± 12,75 %, Figure 2E).
2.2.3. Isoquercitrine, tiliroside et acide p-coumarique
L’effet vasorelaxant marqué observé précédemment a conduit à rechercher les composés qui pourraient être responsables de cette action. Ainsi, la quantification des principaux composés identifiés dans l’infusion et la fraction EtOAc a été réalisée (Tableau 1). Sur la base de cette quantification, nous avons extrapolé la quantité de composé présente dans la concentration la plus élevée de la fraction EtOAc utilisée dans les études vasculaires décrites ci-dessus (c’est-à-dire 2 mg/mL). Par la suite, nous avons utilisé les concentrations suivantes : isoquercitrine (28 µg/mL), tiliroside (3 µg/mL) et acide p-coumarique (1,5 µg/mL). Compte tenu de la composition prédominante en dérivés de la quercétine (Tableau 1), nous avons également inclus la quercétine comme composé de référence pour la comparaison des effets vasculaires.
L’isoquercitrine a provoqué une diminution statistiquement significative de 42,86 % (p < 0,001 vs véhicule) de la contraction maximale à la noradrénaline (E_max = 56,94 ± 8,28 %, Figure 3A) et une activité vasorelaxante puissante avec un R_max de 53,29 ± 7,42 (p < 0,01 vs véhicule, Figure 3B). Comme on le voit, l’incubation avec l’indométacine a diminué significativement la vasorelaxation provoquée par l’isoquercitrine (R_max = 15,94 ± 5,10 %, p < 0,05 vs isoquercitrine, Figure 3B), tandis que l’incubation avec L-NMMA a conduit à une réduction non significative (R_max = 25,16 ± 6,45 %, Figure 3B). À la même concentration, la quercétine a pu provoquer une inhibition plus prononcée de la contraction induite par la noradrénaline (E_max = 35,94 ± 6,25 %, p < 0,0001 vs véhicule, Figure 3A). De plus, la quercétine a provoqué un effet vasorelaxant marqué (R_max = 40,21 ± 6,49, p < 0,05 vs véhicule, Figure 3C), qui n’était pas significativement différent de celui de l’isoquercitrine (p > 0,05). Contrairement à l’isoquercitrine, l’effet vasorelaxant de la quercétine n’a pas été affecté par une préincubation avec l’indométacine (R_max = 27,74 ± 4,18 %) ou L-NMMA (R_max = 34,12 ± 8,64 %).
L’acide p-coumarique et le tiliroside ont tous deux provoqué une potentialisation de la contraction à la noradrénaline (E_max de 152,80 ± 28,23 % et 139,40 ± 33,10 %, respectivement, Figure 3D), même si seul l’acide p-coumarique a produit des changements statistiquement significatifs aux concentrations intermédiaires (p < 0,05 vs véhicule). Aux concentrations testées, ces composés n’ont provoqué aucune vasorelaxation dans l’ATI (R_max de −11,43 ± 10,69 % et −13,69 % ± 3,93 %, respectivement, Figure 3E).
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3. Discussion
À notre connaissance, un seul rapport a porté sur l’activité vasculaire d’A. eupatoria, montrant que le traitement par l’extrait aqueux améliorait la vasorelaxation induite par l’acétylcholine dans des anneaux aortiques isolés d’animaux diabétiques. Fait important, cette amélioration n’a été observée qu’en comparaison avec des animaux diabétiques non traités, mais pas avec des témoins sains. Il restait à préciser si cet effet résultait des propriétés antidiabétiques de cet extrait ou d’une activité vasculaire directe.
Ici, nous avons testé l’activité vasculaire directe d’A. eupatoria et montré que son infusion présente une activité vasorelaxante puissante dans des artères humaines (Figure 2). Comme une faible concentration (0,02 mg/mL) a provoqué une potentialisation de la réponse maximale à la noradrénaline, l’infusion a présenté un effet vasculaire mixte, suggérant ainsi que certains composés peuvent provoquer une augmentation du tonus vasculaire et d’autres une diminution. Les deux voies endothéliales (c’est-à-dire NO et COX) semblent être impliquées (Figure 2). Il est intéressant de noter que l’ampleur de la vasorelaxation (supérieure à 76 %) pourrait également suggérer une relaxation directe du muscle lisse vasculaire (c’est-à-dire indépendante de l’endothélium), ce qui reste à confirmer.
Un effet vasorelaxant puissant a également été observé avec la fraction EtOAc (Figure 2), bien qu’il ait été plus faible que celui de l’infusion (supérieur à 47 % et 76 %, respectivement). Contrairement à ce qui a été observé avec l’infusion, la fraction EtOAc a provoqué une diminution de la contraction induite par la noradrénaline à la concentration la plus élevée (2 mg/mL). De plus, la voie endothéliale COX s’est révélée être le mécanisme sous-jacent de la vasorelaxation de la fraction EtOAc. Cette différence d’activité vasorelaxante, particulièrement médiée par le NO, doit être soulignée, car elle peut résulter du processus d’extraction, avec une perte de composés tels que la procyanidine B2. En effet, une vasorelaxation dépendante de l’endothélium en réponse à la procyanidine B2 a été décrite dans l’ATI, impliquant la synthèse et la sécrétion de NO par les cellules endothéliales, partiellement la prostacycline, ainsi que l’activation des canaux BK_Ca et K_ATP, de même que K_V et IK_Ca. De plus, il a également été rapporté que les procyanidines stimulent la production de prostacycline dans l’ATI. Bien que nous n’ayons pas identifié la procyanidine B2 dans les extraits testés dans notre travail, la fraction EtOAc s’est révélée riche en dimères de procyanidine dans un rapport précédent. En fait, ce composé a été identifié dans la fraction EtOAc du même lot de cette espèce végétale.
Sur la base des résultats, nous avons émis l’hypothèse que la prostacycline, qui est un facteur relaxant fondamental dérivé de l’endothélium augmentant l’AMPc et conduisant à la vasorelaxation, pourrait être le médiateur de cette réponse. Cependant, les expériences avec l’antagoniste du récepteur IP Ro 1138452 n’ont pas confirmé notre hypothèse (Figure 2E). Au-delà de la prostacycline, d’autres métabolites vasodilatateurs ont été décrits, tels que les acides époxyeicosatriénoïques ou EET (notamment 14,15-EET et 11,12-EET), les métabolites du cytochrome P450 et les prostaglandines D2 et E2 également via la COX. Des preuves antérieures suggèrent que le 11,12-EET provoque une relaxation dans l’ATI par l’activation des canaux BK_Ca et du canal potentiel de récepteur transitoire vanilloïde 4 et du canal potentiel de récepteur transitoire canonique 1 dans les cellules musculaires lisses. Quant aux prostaglandines D2 et E2, des rapports antérieurs n’ont montré aucune vasorelaxation dans l’ATI, mais plutôt une vasoconstriction médiée par le récepteur EP en réponse à la prostaglandine E2. Globalement, le mécanisme précis par lequel A. eupatoria provoque la vasorelaxation reste à être pleinement caractérisé.
En termes de composition, les deux extraits présentaient une teneur phénolique élevée et les dérivés de la quercétine se sont révélés être les composés prédominants, à savoir l’isoquercitrine, avec le tiliroside et l’acide p-coumarique (Tableau 1). Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que ces composés pourraient être responsables de l’activité vasorelaxante observée. Sur la base de nos résultats (Figure 3), l’isoquercitrine a montré des propriétés vasoactives cohérentes avec celles de la fraction EtOAc (c’est-à-dire capacité à réduire la contraction induite par la noradrénaline et activité vasorelaxante puissante médiée par la COX), suggérant ainsi qu’il s’agit du composé responsable de cette activité. Il s’agit d’un composé connu pour de multiples activités, telles que des effets antiviraux contre les virus de l’herpès humains, antioxydants, anti-inflammatoires et anticancéreux, entre autres.
En ce qui concerne son activité cardiovasculaire, des études antérieures ont mis en évidence le potentiel antihypertenseur de l’isoquercitrine par un effet inhibiteur sur l’enzyme de conversion de l’angiotensine. Il a également été montré qu’elle provoque une vasodilatation médiée par les canaux K^+ et par le NO endothélial dans des artères mésentériques perfusées de rat. De plus, l’isoquercitrine présente une activité antiapoptotique dans les cellules endothéliales vasculaires, ce qui peut être pertinent dans l’athérogenèse. Des propriétés athéroprotectrices ont également été attribuées à l’isoquercitrine modifiée enzymatiquement ou EMIQ (c’est-à-dire l’isoquercitrine avec des malto-oligosaccharides) chez des souris athérogènes déficientes en ApoE. Dans des études cliniques, Bondonno et al. ont montré l’absence de changements aigus de la pression artérielle ou de la relaxation brachiale dépendante de l’endothélium médiée par le NO chez des individus sains. Plus récemment, il a été montré que l’EMIQ améliore de façon aiguë la dilatation brachiale médiée par le flux chez des patients à risque de maladie cardiovasculaire.
Comme notre extrait et la fraction EtOAc contenaient une teneur élevée en dérivés de la quercétine, à savoir l’isoquercitrine, nous avons cherché à évaluer l’activité vasculaire de la quercétine comme composé de référence dans des artères humaines. Dans notre étude, la quercétine a diminué significativement la réponse contractile maximale à la noradrénaline (Figure 3A) et a provoqué une vasorelaxation puissante (Figure 3C). À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur la vasoactivité de la quercétine dans des artères humaines, les effets observés étant globalement cohérents avec des rapports antérieurs sur l’aorte de rat, l’artère basilaire de rat et l’artère caudale principale de rat. De plus, l’indométacine et L-NMMA n’ont pas modifié significativement la vasorelaxation induite par la quercétine, ce qui suggère que l’endothélium n’est pas impliqué dans cet effet vasorelaxant dans l’ATI. Dans l’aorte de rat, une étude antérieure a montré que l’effet vasorelaxant de la quercétine dépend partiellement de la synthase de l’oxyde nitrique endothéliale et du facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium. Plus récemment, cette vasorelaxation partiellement médiée par le NO a été confirmée, bien que le blocage de la synthase de l’oxyde nitrique endothéliale par L-NAME n’ait diminué que la puissance et non la relaxation maximale. Un résultat similaire a été décrit pour le blocage de la COX par l’indométacine. D’autres études ont suggéré une relaxation indépendante de l’endothélium avec implication des canaux calciques et potassiques. Globalement, nos résultats sont cohérents avec ces preuves suggérant l’implication de mécanismes indépendants de l’endothélium.
Concernant les autres composés testés, l’acide p-coumarique et le tiliroside, ceux-ci n’ont provoqué aucune vasorelaxation et aucun effet statistiquement significatif sur la contraction maximale induite par la noradrénaline aux concentrations testées. Dans la littérature, il a été montré que l’acide p-coumarique protège contre le stress oxydatif induit par la doxorubicine dans le coeur de rat par des propriétés de piégeage des radicaux libres, ainsi qu’il présente une activité antiplaquettaire, mais aucun rapport n’a émergé concernant son activité vasculaire.
Quant au tiliroside, ses effets antihypertenseurs et vasorelaxants ont été rapportés. Dans cette étude, les auteurs ont rapporté une diminution dose-dépendante de la pression artérielle chez des rats hypertendus, une vasodilatation concentration-dépendante des artères mésentériques de rat, ainsi qu’un blocage de l’augmentation de la concentration intracellulaire de Ca^2+ induite par la dépolarisation membranaire et une diminution de l’amplitude maximale activée par le voltage du courant du canal Ca^2+ de type L dans les CMLV. Ce potentiel antihypertenseur a été récemment confirmé, car le tiliroside a antagonisé l’hypertension transitoire provoquée par l’administration d’angiotensine II de manière dose-dépendante.
L’absence d’effet vasorelaxant dans nos essais, particulièrement pour le tiliroside, pourrait être expliquée par les faibles concentrations utilisées. Cependant, notre objectif était d’évaluer les composés responsables de la vasorelaxation induite par A. eupatoria ; ainsi, nous avons extrapolé les concentrations des composés présents dans la concentration la plus élevée de la fraction EtOAc qui a été utilisée (2 mg/mL), plutôt que d’utiliser une gamme de concentrations ou des concentrations plus élevées comme décrit dans ces rapports antérieurs.
Certaines limites doivent être prises en considération. Premièrement, la variabilité des données obtenues peut provenir de l’utilisation de tissu artériel humain prélevé chez des patients présentant des affections cardiovasculaires sous-jacentes et donc un contexte biologique diversifié. Cependant, cela peut aussi constituer un avantage, car cela fournit une meilleure translation des résultats à l’humain, en particulier lorsque l’on considère des patients atteints de maladie vasculaire. Deuxièmement, nous n’avons pas testé si une relaxation directe du muscle lisse est impliquée dans les effets vasorelaxants observés. Cependant, il est peu probable qu’il s’agisse d’un mécanisme majeur, compte tenu des résultats obtenus après retrait de l’endothélium ou en présence d’inhibiteurs des voies endothéliales.
À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur les effets vasculaires directs d’extraits et de composés d’A. eupatoria. Collectivement, les données démontrent le potentiel vasorelaxant de son infusion et de sa fraction EtOAc. Les voies COX et NO semblent toutes deux impliquées dans l’activité de l’infusion d’A. eupatoria, tandis que la voie COX s’est révélée être la principale voie impliquée dans les effets provoqués par la fraction EtOAc et spécifiquement par l’isoquercitrine, même si les médiateurs spécifiques restent incertains.
4. Matériels et méthodes
4.1. Matériel végétal
Les parties aériennes d’A. eupatoria ont été fournies par Segredo da Planta, Portugal (numéro de lot 5870 et données de contrôle qualité n’identifiant aucun défaut), et un spécimen témoin (T. Batista 02009) a été déposé à l’Herbier des plantes médicinales et aromatiques, Faculté de pharmacie, Université de Coimbra. La méthode utilisée pour obtenir l’infusion d’A. eupatoria à partir des parties aériennes a été publiée précédemment. Brièvement, 20 g de plante pulvérisée ont été infusés dans 600 mL d’eau pendant 15 min. Après cette procédure, l’infusion a été filtrée sous vide et lavée avec du n-hexane (1:1) afin d’éliminer les composés liposolubles.
La fraction EtOAc a été obtenue à partir de la moitié de l’extrait brut, qui a été fractionnée par extraction répétée avec de l’acétate d’éthyle (3 × 225 mL), également selon des données publiées précédemment. Après l’extraction, l’échantillon a été concentré avec de l’eau dans un rotavapor à 30 °C puis lyophilisé.
4.2. HPLC-PDA
La caractérisation phytochimique de l’infusion et de la fraction EtOAc a été réalisée au moyen d’une HPLC couplée à un détecteur à réseau de photodiodes (PDA) (Gilson Electronics SA, Villiers-le-Bel, France). Les données ont été traitées avec Unipoint^® 2.10 (Gilson, Middleton, WI, États-Unis). Les échantillons (100 μL) ont été injectés dans une colonne Waters^® Spherisorb S5 ODS-2 (250 × 4,6 mm i.d., 5 μm), protégée par une cartouche de garde C18 (30 × 4 mm i.d., 5 μm) (Nucleosil, Macherey-Nagel, Düren, Allemagne), et élués à un débit de 1 mL/min et à 35 °C. La phase mobile était constituée de 5 % d’acide formique (v/v) (éluant A) et de méthanol (éluant B). Le gradient suivant a été utilisé : 0-60 min (5-50 % B), 60-70 min (50-100 % B) et 70-75 min (100-100 % B). La concentration pour l’injection était de 1 mg/mL pour les deux échantillons. Les profils chromatographiques ont été enregistrés à 280 nm.
La quantification a été effectuée en utilisant l’aire des pics dans les chromatogrammes obtenus par HPLC-PDA par rapport à des étalons externes aux longueurs d’onde appropriées : 315 nm pour l’acide p-coumarique et le tiliroside et 256 nm pour les dérivés de la quercétine. Trois injections indépendantes ont été réalisées pour chaque échantillon, en injectant 100 μL d’extrait et d’étalons dissous dans l’eau, sauf la quercétine, qui a été dissoute dans du méthanol:eau 1:1. L’identification des composés a été effectuée en comparant le temps de rétention et leurs spectres UV avec une analyse précédente et des composés de référence commerciaux. Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été déterminées à partir des paramètres des courbes d’étalonnage représentées dans le Tableau 4.
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L’identification des composés de l’infusion et de la fraction EtOAc a été effectuée en comparant les temps de rétention et leurs spectres UV avec l’acide p-coumarique, l’isovitexine, l’isoquercitrine (quercétine-3-O-glucoside), l’acide ellagique et le tiliroside, ainsi qu’avec des données précédemment publiées par d’autres auteurs.
4.3. Études d’activité vasculaire
Les expériences ont été réalisées sur des segments distaux d’ATI prélevés chez des patients soumis à une revascularisation coronarienne, avec l’approbation du Comité d’éthique de la Faculté de médecine de l’Université de Coimbra (CE-118/2018) et des Hôpitaux universitaires de Coimbra (référence PC-388/08), et après consentement éclairé. La préparation du tissu vasculaire a été réalisée comme décrit dans.
L’effet sur le tonus vasculaire basal a été évalué par des CCRC à l’infusion ou à la fraction EtOAc (0,002-0,2 mg/mL) ou au véhicule, et les résultats ont été exprimés en contraction absolue (en millinewton, mN).
L’effet vasorelaxant a été testé avec des CCRC (0,02-0,2 mg/mL) à l’infusion, à la fraction EtOAc ou au véhicule, après précontraction soutenue avec la noradrénaline (20 µM), les résultats étant exprimés en pourcentage de la contraction maximale à la NA (%).
L’effet modulateur sur la contraction induite par la noradrénaline a été évalué avec des CCRC à la noradrénaline (0,1-48 µM) avant et après des préincubations de 30 min avec l’infusion ou la fraction EtOAc (0,02, 0,2 et 2 mg/mL) ou le véhicule, les résultats étant exprimés en pourcentage de la contraction maximale dans la courbe témoin, c’est-à-dire en absence d’infusion (% E_max).
L’influence des voies NO et COX a été évaluée avec la N^G-monométhyl-L-arginine (L-NMMA) et l’indométacine (1, 10 et 100 µM), respectivement. Pour l’infusion, des concentrations de 1, 10 et 100 µM ont été utilisées, tandis que seule la concentration de 10 µM a été utilisée dans les expériences avec la fraction EtOAc. Le rôle de l’endothélium dans l’effet vasorelaxant a également été évalué par retrait mécanique de l’endothélium (confirmé par l’absence de réponse relaxante à l’acétylcholine). En outre, l’influence du récepteur de la prostacycline (récepteur IP) a été évaluée avec l’antagoniste sélectif Ro 1138452 (10 µM).
Dans ces dispositifs expérimentaux, le véhicule (eau distillée) n’a provoqué aucun changement (données non montrées).
Par la suite, les effets des composés ont été évalués dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus pour la contraction induite par la noradrénaline et l’influence du NO et de la COX avec L-NMMA et l’indométacine (10 µM, respectivement) dans l’effet vasorelaxant. Les concentrations qui ont été testées étaient fondées sur la quantification des composés telle que décrite ci-dessus : acide p-coumarique (1,5 µg/mL), quercétine et isoquercitrine (28 µg/mL), et tiliroside (3 µg/mL). Pour ces expériences, le véhicule désigne l’eau distillée (pour le tiliroside et l’acide p-coumarique) ou le DMSO dans l’eau (pour l’isoquercitrine et la quercétine).
La viabilité tissulaire a été testée avec du chlorure de potassium (KCl, 60 mM) au début et à la fin de toutes les expériences.
4.4. Analyse des résultats
Les données des études d’activité vasculaire ont généralement été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM), sauf indication contraire, et n indique le nombre d’expériences. Dans les essais où l’effet modulateur sur la contraction induite par la noradrénaline a été testé, la puissance a été exprimée comme le logarithme négatif de la concentration efficace (en mol/L ou M) de noradrénaline capable d’induire la moitié de la contraction maximale (pEC_50, -log [M]). Dans les essais de vasorelaxation, la puissance a été exprimée comme le logarithme négatif de la concentration efficace (mg/mL) de l’infusion ou de la fraction EtOAc capable de réduire la précontraction à la noradrénaline à la moitié de son maximum, c’est-à-dire une relaxation de 50 % (pIC_50, -log[mg/mL]). L’efficacité a été exprimée soit en %E_max (contraction maximale, %), soit en %R_max (relaxation maximale, %), respectivement, pour ces essais.
L’analyse statistique a été effectuée avec GraphPad Prism 7^® (GraphPad Inc., La Jolla, CA, États-Unis). Tout d’abord, la normalité des données a été vérifiée par un test de Shapiro-Wilk. Les données des CCRC ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey afin d’identifier les différences à des concentrations spécifiques tout au long des courbes. Les paramètres de puissance des CCRC et les données sur les effets vasculaires des composés ont été analysés par ANOVA unidirectionnelle non appariée avec comparaisons multiples de Tukey. p < 0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.
4.5. Réactifs
Les produits chimiques utilisés pour la préparation du tampon de Krebs-Henseleit et les tests de viabilité des anneaux artériels dans les études pharmacologiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich^® (St. Louis, MO, États-Unis). Les étalons commerciaux suivants ont été utilisés dans les essais sur ATI : quercétine 3-O-glucoside (Sigma, 17793-10MG-F), quercétine (G Buchs SG. K148-/49/2), acide p-coumarique (Sigma, C9008) et tiliroside (Extrasynthese, 1001 S, 20316-62-5). L’antagoniste sélectif du récepteur IP de la prostacycline Ro 1138452 hydrochloride (4268) a été acheté auprès de Tocris (Bristol, Royaume-Uni).
Les produits chimiques utilisés pour la caractérisation phytochimique ont été achetés auprès de Merck^® (Darmstadt, Allemagne) et correspondent au grade le plus élevé disponible commercialement. Les composés de référence utilisés étaient : acide ellagique (Sigma, E2250-5G), acide p-coumarique (Sigma, C-9008, Lot : 22H0312), quercétine (G Buchs SG., Buchs, Suisse, K148-/49/2), quercétine-3-O-glucoside (Sigma, 17793-10MG-F), tiliroside (Extrasynthese, Genay, France, 1001 S, Lot : 12080209), vitexine (Extrasynthese, 1232 S) et isovitexine (Extrasynthese, 1235 S).
5. Conclusions
À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur les effets vasculaires directs d’extraits et de composés d’A. eupatoria. Dans notre étude, nous avons démontré qu’une infusion d’A. eupatoria peut présenter une activité vasculaire mixte, dans laquelle certains composés peuvent favoriser une légère vasoconstriction tandis que d’autres provoquent une vasorelaxation prononcée. Il est intéressant de noter que la fraction EtOAc a provoqué une diminution de la contraction à la noradrénaline, tout en conservant un effet vasorelaxant marqué. Dans notre étude, nous avons également montré que cette vasorelaxation remarquable implique les voies endothéliales COX et NO, tandis que la voie COX présente un rôle central dans l’effet vasorelaxant de la fraction EtOAc. L’isoquercitrine a montré une vasorelaxation marquée médiée par la COX, et ce résultat corrobore l’activité observée pour la fraction EtOAc. Globalement, ces résultats suggèrent qu’A. eupatoria présente des propriétés vasoprotectrices et justifient des recherches supplémentaires afin de clarifier la base mécanistique de cette activité vasculaire (c’est-à-dire identifier les cibles et médiateurs spécifiques) et de valider le potentiel thérapeutique dans plusieurs affections, par exemple l’athérosclérose.