Activité antioxydante et antiproliférative de l’Allium ursinum et de son microbiote associé au cours d’une digestion in vitro simulée en présence d’une matrice alimentaire
Référence : Frontiers in Microbiology 2020. — PMID 33335521 · DOI 10.3389/fmicb.2020.601616 Type : etude in vitro · Plante : Ail des ours · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Dans cette étude, pour la première fois, une analyse complète des activités antiproliférative et antioxydante de l’ail des ours a été réalisée, suivie de l’analyse de son microbiote associé et des effets bénéfiques pour la santé des bactéries lactiques (BL). L’ail des ours (Allium ursinum) est reconnu comme une plante médicinale disposant d’une longue histoire d’utilisation en médecine traditionnelle en raison de son activité antimicrobienne et antioxydante. Dans cette étude, l’influence de la digestion gastro-intestinale in vitro sur l’activité cytotoxique des extraits d’A. ursinum contre des lignées cellulaires malignes humaines a été démontrée. Sept composés soufrés, produits de dégradation des thiosulfinates, dont le disulfure de diallyle, se sont révélés capables d’inhiber la prolifération des cellules malignes en induisant une accumulation dans la phase G2/M ainsi que d’induire l’apoptose par l’activation de la caspase-3 et de la voie de signalisation mitochondriale. Par ailleurs, le microbiote de l’A. ursinum, en particulier les BL au potentiel probiotique, a été analysé par une méthode dépendante de la culture et par une méthode indépendante de la culture [électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE)]. Les résultats obtenus ont révélé que les genres les plus abondants étaient Streptococcus, Lactobacillus et Bacillus. Le genre Lactobacillus était principalement représenté par L. fermentum. L’analyse par électrophorèse en champ pulsé (PFGE) a révélé la présence de deux pulsotypes PFGE. Le potentiel probiotique de la souche L. fermentum BGSR163 appartenant au pulsotype PFGE 1 et de la souche L. fermentum BGSR227 appartenant au pulsotype PFGE 2 a été caractérisé. Les résultats ont révélé que les deux souches sont sûres pour l’usage humain, survivent avec succès aux conditions gastro-intestinales simulées, ont le potentiel de coloniser transitoirement le tractus gastro-intestinal (TGI) et exercent un effet immunomodulateur protecteur, en induisant la production de la cytokine pro-inflammatoire IL17 et de la cytokine régulatrice IL10, tout en diminuant la production de la cytokine pro-inflammatoire IFN-γ. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que la consommation d’A. ursinum pourrait avoir des propriétés bénéfiques pour la santé, y compris des effets anticancéreux, tandis que les souches de L. fermentum isolées des feuilles d’A. ursinum pourraient être utilisées comme probiotiques pour la consommation humaine.
Introduction
L’ail des ours ou ail sauvage (Allium ursinum) appartient aux espèces de plantes médicinales reconnues comme une source importante de composés biologiquement actifs, avec une longue histoire d’application en médecine traditionnelle comme remède naturel pour les troubles gastro-intestinaux, cardiovasculaires et respiratoires (Sobolewska et al., 2015). Cependant, sa composition chimique et ses activités biologiques ont rarement été étudiées jusqu’à présent. Les constituants chimiques les plus importants de l’ail des ours dotés d’une activité pharmacologique sont sans conteste les composés soufrés ; parmi les plus courants figurent les peptides glutamyle et les sulfoxydes, qui sont en même temps les substances chimiques les plus étudiées chez cette espèce végétale. Les espèces d’Allium se caractérisent par une teneur élevée en S-alk(én)yl-L-cystéine-sulfoxydes qui, après hydrolyse, donnent de nombreux composés volatils différents, dont les thiosulfinates et les polysulfures responsables de l’odeur et de la saveur caractéristiques (Sobolewska et al., 2015). Le profil quantitatif des cystéine-sulfoxydes que l’on peut trouver dans l’ail des ours est très variable en fonction de l’organe végétal et de la période de récolte. Les sulfoxydes les plus abondants sont : la méthiine [(+)-S-méthyl-L-cystéine-sulfoxyde], l’alliine [(+)-S-2-propényl-L-cystéine-sulfoxyde], l’isoalliine [(+)-S-(1-propényl)-L-cystéine-sulfoxyde], la propiine [(+)-S-propyl-L-cystéine-sulfoxyde], ainsi que l’éthiine (S-éthyl-cystéine-sulfoxyde). Les lésions tissulaires induites par la transformation ou l’attaque d’un pathogène conduisent au clivage hydrolytique des sulfoxydes par les C,S-lyases et à la formation de thiosulfinates responsables de l’odeur caractéristique, ainsi que d’acide pyruvique et d’ammoniac. Les thiosulfinates les plus abondants présents dans les extraits d’ail des ours sont l’allicine (diallylthiosulfinate) et les méthyl-allyl- ou diméthyl-thiosulfinates, considérés comme instables et réactifs, susceptibles de se décomposer facilement en dithiines, sulfures, polysulfures, ajoènes et de nombreux autres composés volatils ou non volatils, même à température ambiante. Bien que la composition, la stabilité ainsi que la biodisponibilité des thiosulfinates de l’ail frais et de plusieurs produits à base d’ail aient déjà été examinées (Lawson et Gardner, 2005 ; Rahman, 2007 ; Lawson et Hunsaker, 2018), ce type d’étude n’a jamais été entrepris sur les feuilles fraîches d’A. ursinum. À cette fin, un modèle standardisé de digestion in vitro statique décrit par Minekus et al. (2014) a été appliqué dans cette étude pour simuler la digestion des feuilles d’ail des ours en présence d’une matrice alimentaire complexe. Ensuite, la fraction bioaccessible a été examinée par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle afin d’évaluer la décomposition des thiosulfinates. En outre, les activités antiproliférative et antioxydante ont été déterminées dans les mêmes fractions.
Malgré l’intérêt mondial croissant pour les métabolites bioactifs des plantes médicinales, on sait très peu de choses sur les effets bénéfiques pour la santé du microbiote associé aux plantes. Une gamme d’espèces bactériennes colonise la rhizosphère, les surfaces des plantes et les tissus internes (épiphytes ou endophytes) de diverses plantes alimentaires et médicinales (Danhorn et Fuqua, 2007 ; Borozan et Raba, 2016 ; Presta et al., 2017). La composition du microbiote des feuilles, des racines et du sol rhizosphérique a été suivie chez les plantes aromatiques Thymus vulgaris et Thymus citriodorus et corrélée à la composition des huiles essentielles (Checcucci et al., 2017). Par ailleurs, les activités antimicrobiennes de bactéries isolées de la racine, de la feuille et du fruit des plantes médicinales Echinacea purpurea et Peganum harmala ont été testées (Presta et al., 2017 ; Bibi, 2017). Les activités antimicrobiennes contre diverses bactéries pathogènes ont été évaluées, telles que Escherichia coli, Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM), Enterococcus faecium, E. faecalis et Pseudomonas aeruginosa, indiquant que les plantes médicinales pourraient constituer une source précieuse de bactéries dotées d’une activité antimicrobienne contre des pathogènes cliniquement pertinents (Bibi, 2017). En outre, les rôles de souches bactériennes endophytes de Bacillus sp., Enterobacter sp., Pantoea sp., Erwinia sp. et Stenotrophomonas sp. dans la biosynthèse de divers métabolites et le potentiel thérapeutique de Fagonia indica ont été rapportés (Rahman, 2007). Le microbiote associé à l’A. ursinum n’a pas été étudié jusqu’à présent.
La composition des bactéries lactiques (BL) des feuilles fraîches d’A. ursinum a été étudiée. De plus, la gamme d’espèces de lactobacilles a été isolée, et leur potentiel probiotique a été caractérisé.
Matériels et méthodes
Isolement et dénombrement des BL
Les 10 g de feuilles fraîches ont été immergés dans 90 ml de sérum physiologique à 0,85 % et incubés pendant 3 h à 37 °C sous agitation. Un volume de 1 ml du mélange de feuilles et de sérum physiologique a été additionné de 15 % (p/v) de glycérol et utilisé ensuite pour l’analyse microbiologique et du microbiote. Après 3 h, 5 ml du mélange ont été ajoutés à 45 ml de 3 milieux différents les plus adaptés à l’isolement des BL (MRS [Oxoid], GM17 [Oxoid] et bouillon nutritif [Oxoid]) et incubés pendant 72 h en aérobiose à 22 °C et 30 °C, et en anaérobiose (système de conteneur BD GasPak™ EZ CO2, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, États-Unis) à 45 °C. Après incubation, des dilutions en série (10¹–10⁷) ont été préparées et étalées sur gélose MRS, GM17 et gélose nutritive avec de la cycloheximide (1 µl/ml) pour le comptage des colonies. Après l’incubation, environ 30 colonies de chaque boîte ont été sélectionnées au hasard, striées sur de nouvelles boîtes de gélose MRS, GM17 et nutritive, respectivement, et examinées au microscope. Les cultures pures ont été conservées à −80 °C dans du bouillon GM17, MRS ou nutritif additionné de 15 % (p/v) de glycérol.
En parallèle, 500 µl de chaque culture (cultivée dans MRS, GM17 et nutritif et à chaque température) ont été ajoutés à 10 ml de lait écrémé reconstitué (Merck GmbH, Darmstadt, Allemagne) et incubés pendant 48 h à trois températures différentes comme mentionné précédemment. Après 48 h, les dilutions en série (10¹–10⁷) des isolats ayant caillé le lait écrémé ont été préparées. Le reste de la procédure expérimentale était identique à la procédure mentionnée ci-dessus.
Les 217 cultures pures ont été isolées et caractérisées selon leur morphologie par coloration de Gram et formation cellulaire, test de la catalase et production de gélatinase. Sur 217 isolats, 50 isolats à Gram positif cultivés en aérobiose ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Ils ont été répartis en 3 sous-groupes selon leur croissance sur différents milieux et à différentes températures (23 isolats choisis parmi les boîtes MRS incubées à 30 °C, ainsi que 16 isolats choisis parmi les boîtes GM17 et 11 isolats choisis parmi les boîtes nutritives incubées à 22 °C).
Isolement de l’ADN
L’ADN total des cultures pures et de la première dilution en série du mélange de feuilles et de sérum physiologique a été extrait comme décrit par Hopwood et al. (1985).
Séquençage de l’ADNr 16S des isolats de BL
L’amplification par PCR de l’ADNr 16S a été réalisée avec les amorces UNI16SF (5′-GAGAGTTTGATCCTGGC-3′) et UNI16SR (5′-AGGAGGTGATCCAGCCG-3′), complémentaires du gène de l’ARNr 16S, comme décrit par Jovcic et al. (2009). Les amplicons de PCR obtenus ont été purifiés (Qiagen, GmbH, Hilden, Allemagne) et séquencés (Macrogen, Amsterdam, Pays-Bas). Pour déterminer les similarités de séquences, l’algorithme BLAST a été utilisé dans la base de données de séquences nucléotidiques du NCBI.
Analyse par électrophorèse sur gel en gradient dénaturant et séquençage des fragments
Pour étudier les communautés bactériennes dominantes par analyse d’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE), le kit Quick-DNA Fecal/Soil Microbe (Zymo Research, Irvine, CA, États-Unis) a été utilisé pour l’extraction de l’ADN bactérien de la première dilution en série du mélange de feuilles et de sérum physiologique. L’amplification par PCR de l’ADN obtenu a été réalisée en utilisant les amorces spécifiques des lactobacilles Lab-0159f et Uni-0515-GCr (Invitrogen, Paisley, Royaume-Uni), comme décrit par Lukic et al. (2013). Les échantillons ont été amplifiés à l’aide de l’ADN polymérase KAPA Taq (KAPA Biosystems, Le Cap, Afrique du Sud) dans un système GeneAmp PCR 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, États-Unis). L’analyse DGGE et la manipulation du gel après électrophorèse ont été réalisées selon Lukic et al. (2013). La DGGE a été réalisée sur un DGGE-2001 (C.B.S. Scientific, San Diego, CA, États-Unis). Le clonage des fragments de PCR d’intérêt, la transformation des cellules compétentes DH5α et l’analyse des transformants sélectionnés ont été réalisés comme décrit précédemment par Kulas et al. (2019). L’annotation des séquences et les recherches de similarités de séquences dans les bases de données ont été effectuées avec l’outil BLAST disponible en ligne.
Électrophorèse en champ pulsé
Les isolats de Lactobacillus sp. ont été analysés par électrophorèse en champ pulsé (PFGE) afin de déterminer les différences entre les souches. La PFGE a été réalisée comme décrit précédemment (Tenover et al., 1995). Brièvement, la PFGE avec de l’ADN génomique digéré par Not I a été réalisée pendant 18 h à 300 V à 9 °C en utilisant un appareil Pulsafor unit 2015 (LKB Instruments, Bromma, Suède). Le regroupement des isolats sur la base des résultats de la PFGE a été effectué à l’aide du logiciel SPSS, version 20 (IBM Inc., Chicago, IL, États-Unis).
Digestion in vitro
Les feuilles fraîches d’A. ursinum ont été rapidement homogénéisées dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon. (Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni), ont été récoltées par centrifugation (4500 × g, 10 min) et lavées dans du sérum physiologique à 0,85 %. Des aliquotes de poudre d’A. ursinum (2 g) ou des culots bactériens, obtenus à partir de 10 ml de cultures d’une nuit de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 dans du MRS, ont été placés dans des tubes coniques de 50 ml et mélangés avec 3 g de préparation pour nourrissons (Juvitana, Swisslion Product d.o.o. Indjija, Serbie) qui contenait 3 % de protéines, 10 % de glucides et 1 % de lipides selon les spécifications du fabricant. La préparation était constituée de viande de dinde bouillie, de pomme de terre bouillie et de pâte de maïs, de farine de riz et d’eau. Le témoin a été préparé en mélangeant 2 ml d’eau distillée avec 3 g de préparation pour nourrissons. Les mélanges obtenus ont été soumis à une digestion in vitro statique standardisée selon la méthode de Minekus et al. (2014). La phase orale de la digestion simulée a été initiée par l’ajout de 5 g du mélange précédemment obtenu à 3,5 ml de fluide salivaire simulé (SSF), 0,5 ml de solution d’α-amylase salivaire (1500 U/ml), 25 µl de CaCl2 0,3 M et 975 µl d’eau, agité vigoureusement et incubé 2 min à 37 °C. Lors de la phase gastrique suivante, 10 ml du bol oral préalablement traité ont été mélangés avec 7,5 ml de fluide gastrique simulé (SGF), 1,6 ml de solution de pepsine (25000 U/ml) préparée dans le SGF, 5 µl de CaCl2 0,3 M et le pH a été ajusté à 3,0 à l’aide de HCl 1 M. Le mélange a été complété avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 20 ml. Le mélange obtenu a été incubé à 37 °C pendant 2 h, à l’aide d’un agitateur orbital à 300 tr/min. Pour la phase intestinale finale, 20 ml du chyme gastrique obtenu ont été mélangés avec 11 ml de fluide intestinal simulé (SIF), 5 ml de solution de pancréatine 800 U/ml (activité trypsique) préparée dans le SIF, 2,5 ml de solution de sels biliaires 160 mM et 40 µl de CaCl2 0,3 M. La valeur de pH de 7,0 a été ajustée à l’aide de NaOH 1 M et le mélange a été complété avec de l’eau distillée pour atteindre un volume final de 40 ml. Une incubation supplémentaire a été réalisée sous agitation constante à 300 tr/min pendant 2 h à 37 °C. Une fois la digestion terminée, les échantillons ont été centrifugés à 4500 × g pendant 10 min à 4 °C, les surnageants ont été conservés et leur volume a été mesuré avec précision, puis immédiatement congelés dans de l’azote liquide et conservés pour des expériences ultérieures à −80 °C. La composition des solutions électrolytiques SSF, SGF et SIF a été présentée dans le Tableau 1. Les résultats de survie de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 après digestion in vitro ont été exprimés en Log UFC (unités formant colonies)/ml et le taux de survie a été calculé à partir du comptage des cellules viables par rapport aux comptages cellulaires initiaux. Les aliquotes ont été prélevées à 0, 10, 120 et 220 min de la digestion simulée. Les dilutions au dixième en série ont été préparées dans du sérum physiologique à 0,85 % et étalées sur boîtes de gélose MRS et incubées en anaérobiose à 37 °C pendant 48 h. Les expériences ont été réalisées en triplicats.
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Chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle complète/spectrométrie de masse (GC × GC-MS)
Pour l’analyse GC × GC-MS, les échantillons obtenus après digestion in vitro d’A. ursinum ont été extraits à l’aide de dichlorométhane (CH2Cl2) pendant 1 h par extraction liquide/liquide. Les extraits préparés ont été filtrés à l’aide d’un filtre à membrane (0,45 µm, Agilent) et, après concentration, directement analysés par GC × GC-MS GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu, Kyoto, Japon) équipé d’un système de modulation thermique ZX2 (Zoex Corp.) sous forme de chromatogrammes d’ions totaux (TIC). Une colonne Rtx®-1 (première colonne : RESTEK, Crossbond® 100 % diméthylpolysiloxane, 30 m, 0,25 mm DI, df = 0,25 µm) et une colonne BPX50 (SGE Analytical Science, 1 m, 0,1 mm DI, df = 0,1 µm) ont été connectées à l’aide du modulateur GC × GC en tant que première et deuxième colonnes capillaires, respectivement. Le four a été programmé à une température initiale de 40 °C pendant 4 min, puis avec une montée de 10 °C/min jusqu’à 310 °C. Une étape isotherme à 310 °C pendant 5 min était prévue en fin de programme. La période de modulation était de 6 s avec une impulsion de jet chaud de 300 ms. Les données de MS ont été collectées à l’aide du logiciel Shimadzu GC/MS Real-Time Analysis et les données GC × GC-MS ont été analysées à l’aide de GC Image R2.6 (GC Image LLC). Les spectres de MS obtenus ont été comparés aux bibliothèques de MS NIST 11, NIST 11s et Wiley 8.
Teneur en phénols totaux (TPC)
La teneur en phénols totaux a été déterminée selon la méthode précédemment décrite par Julkunen-Tiitto (1985) avec de légères modifications. Des aliquotes de surnageants obtenus après digestion in vitro (20 µl) ont été mélangées avec 1580 µl d’eau distillée et 100 µl de réactif de Folin–Ciocâlteu et agitées vigoureusement. Après 15 min d’incubation à température ambiante, 300 µl de solution de carbonate de sodium à 20 % ont été ajoutés au mélange, qui a ensuite été incubé pendant 2 h supplémentaires. Après l’incubation, l’absorbance du mélange a été enregistrée à 765 nm. La teneur en phénols totaux a été calculée à l’aide d’une courbe étalon d’acide gallique et exprimée en mg d’équivalents d’acide gallique par ml de surnageant (mg GAE/ml).
Teneur en flavonoïdes totaux (TFC)
Les surnageants recueillis après les digestions in vitro ont été concentrés cinq fois par évaporation sous vide à 60 °C. Les concentrés obtenus ont ensuite été centrifugés à 5000 × g pendant 15 min pour précipiter les particules insolubles. La teneur en flavonoïdes totaux dans les surnageants concentrés a ensuite été déterminée par dosage au chlorure d’aluminium selon la méthode précédemment décrite par Ribeiro et al. (2015) avec des modifications. Les surnageants (125 µl) ont été mélangés avec 625 µl d’eau distillée et 37,5 µl de NaNO2 à 5 %. Après 6 min d’incubation à température ambiante, 75 µl de solution d’AlCl3 à 10 % ont été ajoutés et l’incubation a été prolongée de 5 min. Après la seconde incubation, 250 µl de NaOH 1 M ont été ajoutés et le mélange a été complété avec de l’eau distillée jusqu’à un volume final de 1,25 ml. L’absorbance des échantillons a été enregistrée à 510 nm. La teneur en flavonoïdes a été calculée à l’aide d’une courbe étalon de quercétine (5–100 µg/ml) et exprimée en µg d’équivalents de quercétine par ml de surnageant (µg QE/ml).
Mesure de la capacité relative de piégeage du DPPH (RDSC)
La mesure de la capacité relative de piégeage du radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) a été déterminée selon Cheng et al. (2006). Le mélange réactionnel était constitué de 100 µl de surnageant dilué dans du méthanol. Cinq concentrations différentes (10, 20, 40, 60 et 80 µl) de surnageant et de Trolox ont été utilisées. Ensuite, 100 µl de DPPH 200 µM dans du méthanol ont été ajoutés à chaque microplaque et agités. Le blanc contenait 200 µl de méthanol et l’échantillon témoin a été préparé en mélangeant 100 µl de méthanol et 100 µl de solution de DPPH. L’absorbance a été enregistrée en continu chaque minute pendant 1,5 h à 515 nm. Le pourcentage de DPPH neutralisé pour chaque point temporel a été calculé selon l’équation :
% DPPH neutralisé = [1 − (A échantillon − A blanc) / (A témoin − A blanc)] × 100. Les valeurs de DPPH en pourcentage neutralisé aux différents points temporels pour chaque extrait et étalon ont été portées en fonction du temps de réaction. L’aire sous la courbe obtenue (AUC) a été déterminée selon l’équation suivante :
AUC = 0,5 f0 + (f1 + f2 + f3 + … + fi−1) + 0,5 fi, où f0 représente le DPPH neutralisé au début de la mesure et fi le DPPH neutralisé au temps de réaction i. La capacité relative de piégeage du radical DPPH (RDSC) a été calculée selon l’équation :
RDSC (mM TE/ml) = AUC échantillon / AUC trolox × molarité trolox / volume échantillon.
Capacité de fixation des ions ferreux
La capacité de fixation des ions ferreux a été surveillée par la méthode précédemment décrite par Dinis et al. (1994) avec de légères modifications. Brièvement, 940 µl de dilutions de surnageant dans de l’eau distillée ont été mélangés avec 20 µl de chlorure ferreux 2 mM et incubés pendant 30 min à température ambiante. Après incubation, 200 µl de ferrozine 5 mM ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant 10 min dans les mêmes conditions. La formation d’un complexe rouge ion ferreux-ferrozine a été enregistrée à 562 nm. L’échantillon témoin a été préparé avec de l’eau distillée à la place de l’échantillon. Le pourcentage de fixation des ions ferreux a été calculé selon l’équation :
% de Fe²⁺ lié = (A témoin − A échantillon) / A témoin × 100.
Activité cytotoxique in vitro
Les effets cytotoxiques des extraits d’A. ursinum non digérés et digérés ont été étudiés sur les lignées cellulaires d’adénocarcinome cervical humain HeLa et d’adénocarcinome du côlon humain LS174 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, États-Unis). Les cellules ont été cultivées dans le milieu nutritif complet (RPMI 1640 additionné de L-glutamine (2 mM), de streptomycine (100 µg/ml) et de pénicilline (100 UI/ml), 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé par la chaleur et 25 mM d’HEPES), comme décrit ailleurs (Matić et al., 2013). Les cellules HeLa (2000 cellules par puits) et LS174 (7000 cellules par puits) ont été ensemencées dans des microplaques à 96 puits. Les cellules ont été laissées adhérer pendant 24 h, puis cinq concentrations des extraits testés ont été ajoutées aux cellules, allant de 1,25 % à 20 % (cinq dilutions successives au demi). Le milieu nutritif a été ajouté aux cellules témoins. La survie cellulaire a été déterminée par test MTT après 72 h de traitement, selon la procédure décrite pour la première fois par Mosmann (1983) et modifiée par Ohno et Abe (1991). Toutes les expériences ont été réalisées en triplicat. Le cisplatine a été utilisé comme témoin positif. La concentration IC50 a été définie comme la concentration d’un extrait provoquant l’inhibition de la survie cellulaire de 50 % par rapport à un échantillon de cellules témoins.
Analyse du cycle cellulaire
Les cellules HeLa et LS174 ont été exposées aux extraits d’A. ursinum pendant 24 h (les concentrations appliquées étaient de 5 % pour les cellules HeLa et 20 % pour les cellules LS174). Après incubation, les cellules ont été collectées, lavées dans du tampon phosphate salin (PBS) et fixées dans de l’éthanol à 70 % sur glace, selon un protocole standard (Ohno et Abe, 1991 ; Ormerod, 1994). Les échantillons de cellules ont été conservés à −20 °C pendant au moins une semaine avant la coloration. Les cellules ont été incubées avec de la RNase A dans du PBS (concentration finale 200 µg/ml) pendant 30 min à 37 °C. Ensuite, l’iodure de propidium, à une concentration de 40 µg/ml, a été ajouté aux cellules. Les distributions des phases du cycle cellulaire ont été évaluées par cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, États-Unis). Le logiciel CELLQuest (BD Biosciences) a été utilisé pour les analyses de données.
Effets d’un inhibiteur spécifique de la caspase-3
Pour examiner si les extraits d’A. ursinum pouvaient activer l’apoptose dans les cellules HeLa, l’inhibiteur peptidique irréversible spécifique de la caspase-3 (Z-DEVD-FMK, R&D Systems, Minneapolis, États-Unis) a été utilisé pour l’analyse du cycle cellulaire, comme décrit précédemment (Matić et al., 2013). Brièvement, les cellules HeLa ont été préincubées pendant 2 h avec le Z-DEVD-FMK à une concentration finale de 40 µM. Ensuite, les cellules ont été traitées avec les extraits (appliqués à une concentration de 5 %). Après 24 h de traitement, les cellules ont été récoltées et fixées dans de l’éthanol à 70 %. L’analyse du cycle cellulaire a été réalisée comme décrit dans la section précédente.
Activité gélatinase
L’activité gélatinase a été dosée selon la procédure décrite par Su et al. (1991). Les isolats bactériens ont été étalés sur des boîtes de gélose contenant 3 % de gélatine (Oxoid) à 37 °C pendant 48 h et inondés d’une solution saturée de sulfate d’ammonium (Centrohem, Stara Pazova, Serbie). Un halo transparent autour des cellules et des précipités de gélatine a été utilisé comme indication de production de gélatinase. E. faecalis V583 (Paulsen, 2003) a été utilisé comme témoin positif.
Activité hémolytique
Les deux isolats de L. fermentum (BGSR163 et BGSR227) ont été testés pour leur activité hémolytique. Les souches ont été cultivées dans du bouillon MRS et striées sur des boîtes de gélose Columbia contenant 5 % de sang de mouton (Oxoid). Les boîtes ont été incubées pendant 48 h à 37 °C. Les boîtes de gélose au sang ont été examinées à la recherche de signes de β-hémolyse (zones claires autour des colonies), d’α-hémolyse (zones à teinte verte autour des colonies) ou de γ-hémolyse (aucune zone autour des colonies) comme décrit par Argyri et al. (2013).
Concentration minimale inhibitrice (CMI)
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) d’antibiotiques cliniquement pertinents ont été déterminées par microdilution selon les recommandations de l’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA, Panel, 2012). La sensibilité a été testée vis-à-vis de : ampicilline (2 µg/ml), gentamicine (16 µg/ml), kanamycine (64 µg/ml), streptomycine (64 µg/ml), érythromycine (1 µg/ml), clindamycine (1 µg/ml), tétracycline (8 µg/ml) et chloramphénicol (4 µg/ml). Les tests de microdilution ont été réalisés dans du MRS (Oxoid). La densité cellulaire a été surveillée après 24 h d’incubation à 37 °C à 595 nm à l’aide d’un lecteur de plaques Infinite 200 pro (MTX Lab Systems, Vienne, Autriche).
Test de cytotoxicité des souches probiotiques et de leurs postbiotiques
Un kit de dosage de cytotoxicité de la lactate déshydrogénase (LDH) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) a été utilisé pour mesurer le niveau de cytotoxicité dans les cultures cellulaires par détection de la LDH libérée par les cellules mortes. Après traitements des cellules Caco-2 et des cellules des ganglions lymphatiques mésentériques (MLNC) avec les souches de Lactobacillus sélectionnées, l’activité de la LDH dans les surnageants a été déterminée en suivant les instructions du fabricant. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de plaques Infinite 200 pro (MTX Lab Systems).
Adhérence aux cellules Caco-2
La capacité d’adhésion des isolats de L. fermentum a été réalisée sur des cellules Caco-2 de type colonocytes. Les Caco-2 ont été achetées auprès de l’European Collection of Cell Cultures (ECACC N° 86010202). La culture et l’entretien des cellules ont été effectués selon les procédures décrites par Sánchez et al. (2010) en utilisant le milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 100 U/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Les milieux et réactifs ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. L’adhérence (exprimée en pourcentage) a été calculée comme suit : UFC bactéries adhérées/UFC bactéries ajoutées. Les expériences ont été réalisées dans deux boîtes répliquées et dans chaque boîte ; trois puits ont été utilisés par échantillon.
Isolement et traitement des cellules des ganglions lymphatiques mésentériques
Les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) ont été isolés de rats Wistar et la suspension de cellules (MLNC) a été préparée par disruption mécanique des MLN, comme décrit par Bajić et al. (2020). Les MLNC ont été stimulées avec de la concanavaline A (ConA, Sigma-Aldrich, 2,5 µg/ml) et traitées avec des surnageants de culture cellulaire provenant de 2,5 × 10⁷ cellules bactériennes, avec des bactéries inactivées par UV à un rapport de 10:1 (bactéries/cellule eucaryote), 1 % d’extrait d’A. ursinum après passage dans le tractus gastro-intestinal (TGI), et une matrice alimentaire complexe utilisée comme vecteur lors du passage dans le TGI pendant 72 h. Après 72 h d’incubation, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et soumis au test de cytotoxicité et à la quantification des cytokines.
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d’éthique du ministère de l’Agriculture, des Forêts et de la Gestion des eaux de la République de Serbie (numéro de licence 119-01-5/14/2017-09).
Quantification des cytokines
La concentration en cytokines dans les surnageants de culture cellulaire de 72 h a été déterminée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Pour la détection de l’interleukine (IL)-10 et de l’interféron (IFN)-γ, des kits DuoSet ELISA spécifiques ont été utilisés selon les instructions du fabricant (R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis). Pour la détection de l’IL-17A, le kit rat IL-17A (homodimère) ELISA Ready-SET-Go a été utilisé selon les instructions du fabricant (eBioscience, San Diego, CA, États-Unis). Les échantillons ont été analysés en duplicats et les résultats ont été calculés à l’aide des courbes étalons.
Analyse statistique
Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± erreur type de la moyenne. Une ANOVA à un facteur avec le test post hoc de Dunnett a été utilisée pour comparer plusieurs groupes. Des valeurs de p < 0,05 ou moins ont été considérées comme statistiquement significatives. Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois. L’analyse statistique et la conception des graphiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism.
Résultats
Teneur en phénols totaux, en flavonoïdes totaux et activités antioxydantes
La teneur en phénols totaux (TPC) des surnageants obtenus avant et après digestion a été présentée dans le Tableau 2. Les fractions bioaccessibles d’ail des ours non digéré SN1t0-SN3t0 contenaient 187–221 µg GAE/ml et la matrice alimentaire seule avait une teneur en phénols plus faible de 92 µg GAE/ml, tandis que les échantillons digérés présentaient des valeurs de TPC significativement plus élevées, de 235–264 µg GAE/ml pour les échantillons d’ail des ours et 110 µg GAE/ml pour la matrice alimentaire. Dans le cas de tous les échantillons étudiés, la digestion in vitro a provoqué une augmentation statistiquement significative de la TPC. La teneur en flavonoïdes totaux de la fraction bioaccessible avant la digestion variait de 35,1 à 46,2 µg QE/ml, tandis qu’après la digestion, une légère augmentation a été enregistrée dans deux échantillons d’ail des ours SN1 et SN2. La fraction bioaccessible de la matrice alimentaire non digérée contenait une teneur significative en flavonoïdes de 15,8 µg QE/ml qui a également augmenté après la digestion, comme on peut le voir dans le Tableau 2. L’activité antioxydante des échantillons non digérés, mesurée par dosage cinétique de piégeage du DPPH, a suivi la même tendance que la TFC, allant de 0,35 à 0,45 µM TE/ml. La digestion a provoqué une élévation significative du piégeage des radicaux dans les échantillons SN1 et SN2. La matrice alimentaire a montré une activité deux fois plus faible pour l’échantillon non digéré et l’augmentation après digestion n’a pas été observée. Les capacités de chélation des ions ferreux avant digestion variaient de 42,5 %, détectés dans la matrice alimentaire, jusqu’à 71,3 % dans l’échantillon SN2. Une augmentation substantielle de la FCC après digestion a été enregistrée dans tous les échantillons, y compris la matrice alimentaire.
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Analyse GC × GC-MS
L’analyse par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle de la fraction bioaccessible d’A. ursinum obtenue après digestion a révélé la présence de sept composés volatils qui étaient absents du surnageant de la matrice alimentaire digérée (Figures 1A,B). Les composés dominants dans le spectre analysé des échantillons contenant de l’A. ursinum étaient les produits de décomposition de l’allicine : 3,4-diméthylthiophène ; 1,3-dithiane ; disulfure de diallyle ; disulfure d’allyle et de méthyle ; 2-vinyl-1,3-dithiane ; disulfure de (E)-1-propényle et de méthyle ; disulfure de (E)-1-propényle et d’allyle (Figure 1B).
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Effets des extraits sur la distribution des phases du cycle cellulaire
L’étude des mécanismes de l’activité cytotoxique des extraits d’A. ursinum par analyse du cycle cellulaire a révélé que tous les extraits testés appliqués à une concentration de 5 % induisaient une augmentation remarquable des cellules HeLa dans la phase subG1 par rapport à celles déterminées dans l’échantillon de cellules témoins non traitées après des traitements ayant duré 24, 48 et 72 h. Les effets des extraits sur la distribution des phases du cycle cellulaire sont présentés dans la Figure 2A. Des différences entre les pourcentages de cellules HeLa aux phases spécifiques du cycle cellulaire exposées aux extraits d’A. ursinum non digérés et digérés ont été observées. Les extraits non digérés 1 et 2 après 24 h d’incubation ont provoqué une accumulation de cellules HeLa dans la phase G2/M du cycle cellulaire par rapport aux cellules témoins. L’augmentation des cellules en phase S a été observée dans les cellules HeLa traitées pendant 48 et 72 h avec les extraits non digérés. Parmi les extraits non digérés, l’extrait 1 a induit l’accumulation la plus intense de cellules en phase S, accompagnée d’un arrêt en phase G2/M après 48 h de traitement. Le traitement des cellules HeLa avec la matrice alimentaire n’a pas affecté de manière significative leur distribution des phases du cycle cellulaire (Figure 2A).
[ ] Dans les cellules d’adénocarcinome du côlon humain LS174, l’exposition pendant 24, 48 et 72 h aux extraits d’A. ursinum non digérés et digérés appliqués à une concentration de 20 % a conduit à une augmentation remarquable du pourcentage de cellules subG1 par rapport à l’échantillon de cellules témoins, comme le montre la Figure 2B. L’augmentation des cellules LS174 dans la phase subG1 était remarquablement plus élevée dans les cellules incubées avec 20 % d’extraits non digérés. En outre, les trois extraits digérés ont provoqué un arrêt du cycle cellulaire en G2/M dans les cellules LS174 après 24, 48 et 72 h d’incubation. L’accumulation des cellules LS174 dans la phase G2/M était la plus prononcée dans les échantillons de cellules exposées pendant 24 h aux extraits testés. Il convient de noter que la matrice alimentaire à une concentration de 20 % a légèrement augmenté le pourcentage de cellules LS174 dans la phase subG1.
L’activité cytotoxique des extraits d’A. ursinum testés digérés in vitro sur les cellules HeLa et LS174 est présentée dans le Tableau 3.
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Effets de l’inhibiteur de la caspase-3
Pour explorer si l’augmentation observée des cellules HeLa dans la phase subG1 après 24 h d’exposition aux extraits d’A. ursinum non digérés et digérés pouvait être attribuée à la mort cellulaire apoptotique, l’analyse du cycle cellulaire des cellules prétraitées avec un inhibiteur spécifique de la caspase-3 a été réalisée. La diminution du pourcentage de cellules HeLa subG1 prétraitées avec l’inhibiteur de la caspase-3 avant l’exposition à chacun des extraits testés a été constatée par rapport aux cellules traitées qui n’avaient pas été préincubées avec un inhibiteur (Figure 2C). Ces résultats soulignent la capacité des extraits d’A. ursinum non digérés et digérés à induire l’apoptose dans les cellules HeLa par l’activation de la caspase-3, principal effecteur.
Évaluation du microbiote associé à l’A. ursinum
Afin de déterminer la composition des BL et des bactéries étroitement apparentées associées à l’A. ursinum, une analyse DGGE des amplicons d’ARNr 16S obtenus à l’aide des amorces spécifiques des lactobacilles Lab-0159f et Uni-0515-GCr a été réalisée. L’analyse DGGE du microbiote dominant présent dans la première dilution des feuilles d’A. ursinum a révélé la présence prédominante des genres : Streptococcus, correspondant aux bandes 5, 6, 7, 8 et 9 (69,2 %), Lactococcus, correspondant aux bandes 2, 3 et 4 (23,1 %), et Lactobacillus, correspondant aux bandes 11 et 13 (15,3 %). Les résultats de séquençage des bandes réamplifiées du gel DGGE ont indiqué la domination de Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus reuteri et Lactobacillus gasseri (Figure 3 et Tableau supplémentaire 1).
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Isolement et identification des BL de l’A. ursinum
Les BL et d’autres bactéries étroitement apparentées ont été isolées de la première dilution des feuilles d’A. ursinum. Les 50 isolats sélectionnés sur la base de leur croissance sur gélose MRS, GM17 et Nutri ont été analysés plus avant par séquençage de l’ADNr 16S. Le genre le plus abondant appartenait à Staphylococcus (34 %), Lactobacillus tous L. fermentum (30 %) et Bacillus (14 %) (Tableau supplémentaire 2).
Afin de déterminer les différences inter-souches parmi les isolats de L. fermentum, 15 souches de L. fermentum ont été analysées par PFGE. Le dendrogramme produit par le logiciel SPSS a démontré une similarité génomique allant de 75 à 100 % (Figure 4). Deux clusters présentant des différences allant jusqu’à 25 % ont été observés. Le cluster I comprend un pulsotype (14 isolats) ; tandis que le cluster II ne contient qu’un seul pulsotype avec un isolat BGSR163. Le profil de bandes a révélé la présence de deux pulsotypes PFGE (souches) différents de L. fermentum (Figure 4), c’est pourquoi les souches BGSR163 et BGSR227, appartenant à des pulsotypes PFGE différents, ont été choisies pour le test de cytotoxicité, ainsi que pour l’évaluation du potentiel probiotique – survie à travers le TGI simulé, adhésion aux cellules épithéliales intestinales (CEI) et activité immunomodulatrice, comme principaux critères de sélection des souches probiotiques.
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Détermination du statut de sécurité des isolats de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227
Afin de déterminer le statut de sécurité des isolats de L. fermentum, les activités cytotoxique, gélatinase et hémolytique ont été dosées, et la sensibilité aux concentrations minimales inhibitrices d’antibiotiques a été déterminée. Les cellules Caco-2 ont été exposées à des isolats vivants de L. fermentum pour déterminer l’éventuel effet cytotoxique des souches. Les résultats ont montré que les souches bactériennes vivantes L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 exerçaient une activité cytotoxique sur les cellules Caco-2, tandis que les surnageants de culture cellulaire des deux souches n’exerçaient pas d’activité cytotoxique sur ces mêmes cellules (Figure 5A). Le test MTT a montré que les surnageants de culture cellulaire de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ne diminuent pas l’activité métabolique cellulaire des cellules Caco-2 après le traitement (Figure 5B). L’absence d’activité gélatinase, pour les deux souches de L. fermentum (BGSR162 et BGSR227), sur les boîtes de gélose à la gélatine a été notée, ainsi que l’absence de zones d’hémolyse sur les boîtes de gélose au sang. Les deux souches étaient sensibles à tous les antibiotiques cliniquement pertinents (ampicilline, gentamicine, kanamycine, streptomycine, érythromycine, clindamycine, tétracycline et chloramphénicol).
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Survie de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 lors d’un transit dans le TGI chimiquement simulé
La survie des souches L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 lors d’un transit dans le TGI chimiquement simulé a été testée. Les résultats ont révélé que les deux souches survivaient avec succès au passage à travers les conditions simulées du TGI (Figure 6A). Les résultats ont montré que le nombre de cellules viables des deux souches de L. fermentum après 10 min (conditions buccales simulées) n’était pas significativement modifié par rapport à celui du début de l’expérience. Cependant, une exposition de 110 min aux conditions gastriques simulées a abaissé le nombre de cellules viables des deux souches de L. fermentum d’environ 1 unité log (ΔLogBGSR163 = 0,8 et BGSR227 = 1), bien que le nombre de cellules viables ait été plutôt élevé (8 Log UFC/ml). Fait intéressant, lorsque les cellules ont été exposées aux conditions simulées de l’intestin grêle (100 min) avec des concentrations accrues de sels biliaires, la croissance des souches a été restaurée (ΔLogBGSR163 = 0,7 et ΔLogBGSR227 = 0,8). Le taux de survie de la souche BGSR163 était de 98,85 % ; Δlog UFC/ml = 0,1), tandis que le taux de survie de BGSR227 était de 97,73 % ; Δlog UFC/ml = 0,2 (Figure 6A).
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Adhérence aux cellules Caco-2
Les capacités d’adhérence des isolats de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ont été étudiées sur des cellules Caco-2. Les deux souches étaient capables d’adhérer aux cellules Caco-2, quoique à un degré différent (Figure 6B). La souche L. fermentum BGSR163 a présenté une capacité d’adhérence plus élevée (13,73 %), comparée à la souche L. fermentum BGSR227 (4,45 %) (Figure 6B).
Activité immunomodulatrice
Afin d’évaluer l’effet immunomodulateur des bactéries probiotiques potentielles (bactéries inactivées par UV et surnageant de culture cellulaire) ainsi que de l’extrait d’A. ursinum, la production des cytokines pro-inflammatoires IL-17 et IFN-γ, et de la cytokine immunorégulatrice IL-10 de MLNC stimulées avec de la ConA a été testée. Il est important de noter qu’aucun des traitements utilisés n’a exercé d’effets cytotoxiques (données non présentées). Les traitements des MLNC avec des surnageants de culture sans cellules et des bactéries inactivées par UV L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ont significativement stimulé la production d’IL-17 (p < 0,01 et 0,001 respectivement) (Figure 7A), tandis que les traitements des MLNC avec des surnageants de culture sans cellules de L. fermentum BGSR163 et des bactéries inactivées par UV des deux souches ont conduit à une diminution de la production d’IFN-γ (p < 0,01 et 0,001 respectivement) (Figure 7B). Les surnageants de culture cellulaire de L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ainsi que leurs bactéries inactivées par UV ont stimulé de manière statistiquement significative la production d’IL-10 dans les MLNC (p < 0,001) (Figure 7C). Le traitement par l’extrait végétal et le traitement par la matrice alimentaire complexe n’ont pas exercé d’effets sur la production de cytokines (Figures 7A–C).
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Discussion
L’ail des ours – Allium ursinum est utilisé comme plante médicinale depuis des siècles. Alors que ses activités antimicrobienne, cytotoxique et antioxydante ont été démontrées précédemment, le microbiote associé à l’ail des ours n’avait pas été caractérisé jusqu’à présent. La présente étude représente la première tentative d’élucider l’effet de la digestion simulée de l’ail des ours en présence d’une matrice alimentaire complexe sur la bioaccessibilité des composés phénoliques et organosoufrés ainsi que sur leurs activités biologiques in vitro. Ainsi, cet article présente la caractérisation des activités antiproliférative et antioxydante de l’ail des ours, conjointement avec les propriétés bénéfiques pour la santé de ses BL associées. À savoir, le nombre d’études au cours de la dernière décennie a identifié les communautés microbiennes complexes associées aux plantes, appelées microbiote végétal (Compant et al., 2019). De plus, les effets bénéfiques du microbiote végétal sur la croissance et la santé de la plante ont été démontrés (Compant et al., 2019). Cependant, les analyses complètes des extraits de plantes conjointement avec les effets bénéfiques pour la santé du microbiote végétal sont rares. En particulier, les données relatives aux effets probiotiques du microbiote associé à l’A. ursinum font défaut.
Teneur en phénols totaux, en flavonoïdes et activités antioxydantes
Les données de la littérature disponibles sur la TPC et la TFC de l’Allium ursinum sont très diverses et hétérogènes, ce qui est principalement dû aux différentes procédures de préparation des extraits et d’analyse chimique. Dans une étude antérieure (Gitin et al., 2012), des valeurs de TPC de 27,9 g GAE/100 g (base sèche) ont été rapportées dans un extrait de feuilles obtenu par macération de 12 jours avec de l’éthanol à 70 %, tandis que Djurdjevic et al. (2004) ont déterminé 3,24 mg/g de phénols libres totaux dans des feuilles sèches extraites avec du méthanol aqueux bouillant à 80 % (v/v), suivi d’acétate d’éthyle bouillant. La teneur en TFC des feuilles fraîches dépendait également fortement de la méthode d’extraction. Selon Gitin et al. (2012), la teneur en flavonoïdes déterminée par extraction assistée par ultrasons était de 7,3 mg de quercétine/kg de feuilles fraîches contre 2,7 mg QE/kg par macération conventionnelle. Dans une autre étude récente (Pavlović et al., 2017), les auteurs ont appliqué cinq techniques d’extraction différentes suivies de la détermination de la TPC et de la TFC dans des extraits séchés de feuilles d’A. sativum. Selon les données obtenues, la TPC variait de 24,32 à 43,97 mg de GAE/g d’extrait et les valeurs de TFC allaient de 7,46 à 38,56 mg de rutine/g d’extrait. Plusieurs études antérieures (Nakano et al., 1981 ; Carotenuto et al., 1996 ; Wu et al., 2009) ont montré que les principaux polyphénols présents dans les feuilles d’ail des ours sont très certainement des flavonoïdes, parmi lesquels les dérivés du kaempférol se sont révélés prédominants (Oszmiański et al., 2013). À notre connaissance, pas une seule des études mentionnées n’a pris en compte la bioaccessibilité des composés polyphénoliques de l’ail des ours. Dans la présente étude, la teneur en phénols totaux et en flavonoïdes a été examinée dans la fraction bioaccessible obtenue après digestion in vitro de feuilles fraîches d’ail des ours en présence d’une matrice alimentaire complexe. Le but de ce plan expérimental était d’imiter les conditions d’alimentation aussi fidèlement que possible. Les résultats obtenus ont montré que les concentrations de polyphénols totaux et de flavonoïdes totaux dans la fraction bioaccessible étaient bien inférieures à celles détectées dans les feuilles fraîches et sèches ainsi que dans leurs extraits concentrés. La teneur déterminée en TPC après la digestion en présence de matrice alimentaire n’était que de 235–264 µg GA/ml, dont 110 µg GA/ml étaient présents dans la fraction bioaccessible de la matrice alimentaire digérée sans A. ursinum. Des résultats similaires ont été obtenus pour la TFC : 40,4–55,4 µg QE/ml dans les échantillons contenant de l’A. ursinum et 22,7 µg QE/ml dans la matrice alimentaire seule. Les faibles rendements observés étaient attendus en raison des conditions d’extraction douces en milieu aqueux du tractus digestif imité par rapport à l’extraction par solvant organique appliquée dans les études précédentes. Cependant, ce n’était pas le seul facteur limitant. Divers types d’interactions entre les constituants alimentaires (protéines, glucides, lipides ou fibres) et les polyphénols affectant leur bioaccessibilité ont été documentés précédemment (Stanisavljević et al., 2015 ; Pešić et al., 2019). En comparant les valeurs de TPC et de TFC avant (SN1t0–SN3t0) et après la digestion (SN1t0–SN3t0), une légère augmentation après digestion complète a été observée dans la majorité des échantillons contenant de l’A. ursinum. De même, dans les échantillons contenant uniquement de la matrice alimentaire (SNM), des valeurs accrues de TPC et de TFC ont également été enregistrées après digestion. Ainsi, il n’est pas clair quelle portion de cette augmentation pourrait être attribuée à la libération de composés phénoliques de l’A. ursinum pendant la digestion. Les résultats obtenus pour la TPC doivent être interprétés avec la plus grande prudence, en particulier dans les échantillons contenant des matrices alimentaires complexes en milieu aqueux. Il a été déterminé précédemment que le réactif de Folin-Ciocalteu présente également une réactivité vis-à-vis des sucres réducteurs, de l’ascorbate, de certains acides organiques et gras, des amines aromatiques et des peptides qui pourraient être libérés pendant la digestion des constituants alimentaires (Prior et al., 2005). La teneur en flavonoïdes totaux de la matrice alimentaire était nettement élevée, bien qu’environ trois fois inférieure à celle des échantillons contenant de l’ail des ours. Cela pourrait s’expliquer par les insuffisances du dosage à base de chlorure d’aluminium, qui dépend du type de flavonoïde présent dans l’échantillon et est spécifique uniquement d’un nombre limité de flavonoïdes tout en pouvant réagir avec les acides phénoliques donnant une absorbance non spécifique à 510 nm (Pêkal et Pyrzynska, 2014). Il a été montré précédemment que la matrice alimentaire utilisée dans notre étude contient une quantité significative d’acides phénoliques et plusieurs flavonoïdes (Pešić et al., 2019). Des études antérieures ont montré que la composition de la matrice alimentaire et l’effet de la co-digestion des polyphénols peuvent également affecter leur activité antioxydante. Comme on peut l’observer dans le Tableau 4, l’activité de piégeage des radicaux mesurée par le dosage DPPH a montré une forte corrélation positive avec la TPC (r = 0,93) et la TFC (r = 0,94), tandis que la corrélation de ces paramètres avec la capacité de chélation des ions ferreux (FCC) était bien plus faible, r = 0,73 avec la TPC et r = 0,68 avec la TFC. L’activité de piégeage du DPPH était significativement élevée après la digestion dans le cas de deux échantillons SN1 et SN2, tandis qu’elle restait inchangée pour les échantillons SN3 et SNM. Les valeurs de FCC étaient également augmentées après digestion complète dans tous les échantillons étudiés, avec l’augmentation la plus prononcée dans la matrice alimentaire digérée seule (SNM). Compte tenu de ces résultats, on peut conclure que les constituants bioaccessibles de l’A. ursinum n’ont pas contribué de manière substantielle à la FCC, qui provient en majorité de la matrice alimentaire et des composants des fluides digestifs. On peut également observer que l’augmentation de la FCC après digestion était plus élevée dans la matrice alimentaire seule que dans sa combinaison avec l’ail des ours, indiquant que certains composants de l’ail des ours interfèrent avec les composants de la matrice nutritive, entraînant une augmentation modérée de la FCC. Cette situation a déjà été documentée dans le cas de la digestion combinée des polyphénols du raisin et du même type de matrice nutritive (Pešić et al., 2019). Prises dans leur ensemble, les quantités de TPC et de TFC dans la fraction bioaccessible de l’ail des ours, digéré en présence de matrice alimentaire, étaient modérées par rapport à celles enregistrées précédemment dans les feuilles sèches ou fraîches et leurs extraits. Cela était attendu, compte tenu des conditions d’extraction douces du tractus digestif simulé et des interactions des composés phénoliques avec les constituants alimentaires. Néanmoins, les valeurs déterminées de TPC et de TFC étaient environ deux fois plus élevées dans les échantillons contenant de l’ail des ours que dans la matrice alimentaire digérée seule. Les résultats du dosage DPPH étaient positivement et fortement corrélés avec la TPC et la TFC, tandis que la contribution des composés phénoliques à la FCC était moins prononcée.
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Analyse qualitative des composés organosoufrés volatils
Selon les données de la littérature, les composés organosoufrés dominants (cystéine-sulfoxydes) de l’A. ursinum sont la méthiine et l’alliine, mais il contient aussi certaines quantités d’isoalliine, de propiine et d’éthiine (Sobolewska et al., 2015). Les thiosulfinates sont formés à partir des cystéine-sulfoxydes lors d’une lésion mécanique des tissus par l’action hydrolytique de l’alliinase (C,S-lyase). Les conditions optimales pour le clivage hydrolytique des sulfoxydes sont un pH = 6 et une température de 35 °C. Les produits primaires de cette réaction sont les thiosulfinates, l’acide pyruvique et l’ammoniac. Les thiosulfinates les plus abondants (75–90 %) détectés dans divers extraits d’ail des ours étaient : l’allicine (diallylthiosulfinate = di-2-propényl thiosulfinate) et les méthyl-allyl- ou diméthyl-thiosulfinates (Sendl et Wagner, 1991). Selon l’espèce d’Allium et les conditions spécifiques, la décomposition des thiosulfinates peut donner une variété de constituants tels que les méthyl allyl, diallyl diéthyl mono-, di-, tri-, tétra-, penta- et hexasulfures, les vinyldithiines, ainsi que le (E)- et le (Z)-ajoène (Benkeblia et Lanzotti, 2007). Les thiosulfinates les plus abondants détectés précédemment dans les extraits de feuilles d’ail des ours sont représentés par : le disulfure d’allyle et de méthyle, le disulfure de diallyle, le trisulfure d’allyle et de méthyle, le disulfure d’allyle et de (E)-1-propényle, le trisulfure de diméthyle, le disulfure de méthyle et de (E)-1-propényle, le disulfure d’allyle et de propyle et le disulfure d’allyle et de (Z)-1-propényle (Sobolewska et al., 2015 ; Pavlović et al., 2017).
Notre analyse a déterminé la présence de sept composés volatils, dont : le 3,4-diméthylthiophène ; le 1,3-dithiane ; le disulfure de diallyle ; le disulfure d’allyle et de méthyle ; le 2-vinyl-1,3-dithiane ; le disulfure de (E)-1-propényle et de méthyle ; le disulfure de (E)-1-propényle et d’allyle. Au moins à notre connaissance, il n’existe pas de données de littérature disponibles sur les composés organosoufrés de l’A. ursinum dans la fraction bioaccessible obtenue après digestion in vitro. Cependant, des études similaires ont été menées sur plusieurs autres espèces d’Allium. Il a été montré précédemment que l’action hydrolytique de l’alliinase peut être préservée dans l’estomac, en particulier en présence d’un repas à teneur modérée à élevée en protéines qui peut transitoirement élever le pH à 4,4 ou plus, ce qui est suffisant pour permettre la catalyse et produire des allyl-thiosulfinates (Lawson et Hunsaker, 2018). Le disulfure de diallyle détecté dans notre étude appartient aux allyl polysulfures, produits de transformation spontanée des allyl-thiosulfinates (Lawson et Hunsaker, 2018). La présence de 3,4-diméthylthiophène a été précédemment détectée dans l’huile essentielle d’Allium sativum issue de la distillation de Clevenger comme l’un des principaux composés soufrés (Satyal et al., 2017) ainsi que dans l’extrait de feuilles d’A. ursinum en tant que composé mineur (Ivanova et al., 2009). Selon les données de la littérature, le 2-vinyl-1,3-dithiane se forme lors de la dégradation thermique de l’alliine à des températures supérieures à 180 °C (Kubec et al., 1997) et il a également été trouvé dans l’ail frit et cuit au four (Yu et al., 1994), mais il existe également des preuves qu’il pourrait se former à 40 °C (Keleş et al., 2014). Ce composé a récemment été détecté dans des extraits de feuilles fraîches d’A. ursinum (Ivanova et al., 2009). Le composé organosoufré cyclique rapporté dans notre étude – le 1,3-dithiane – a été caractérisé précédemment comme un constituant mineur de l’ail doté de la capacité de stimuler la production d’espèces réactives de l’oxygène dans les neutrophiles (Schepetkin et al., 2019). Il a également été détecté chez Allium roseum (Zouari et al., 2012), mais c’est le premier rapport chez Allium ursinum. La présence de disulfure d’allyle et de méthyle, de disulfure de (E)-1-propényle et de méthyle, de disulfure de (E)-1-propényle et d’allyle a été rapportée précédemment chez A. sativum et dans l’huile essentielle d’A. vineale (Prabodh Satyal et al., 2017), ainsi que dans l’huile et les extraits de feuilles d’A. ursinum (Schmitt et al., 2005 ; Gođevac et al., 2008 ; Sobolewska et al., 2015).
Propriétés anticancéreuses
Les résultats de l’étude des propriétés anticancéreuses des extraits d’Allium ursinum sont en accord avec les données de Xu et al. (2013) qui ont démontré que les extraits aqueux d’A. ursinum provoquaient l’apoptose par l’activation des caspases-3, -8 et -9, et un arrêt en G2/M dans les cellules d’adénocarcinome gastrique humain AGS. Notre étude est la première à rapporter l’influence de la digestion gastro-intestinale in vitro sur l’activité cytotoxique des extraits obtenus à partir d’A. ursinum contre des lignées cellulaires malignes humaines. Il a été rapporté que les extraits préparés à partir de la plante médicinale A. ursinum exercent diverses activités pharmacologiques, telles que des activités antioxydante, antihypertensive, antidiabétique, antimicrobienne, antifongique et anti-inflammatoire, en plus de l’activité anticancéreuse (Xu et al., 2013 ; Trio et al., 2014 ; Sobolewska et al., 2015, et les références qui y sont citées). L’utilisation en médecine traditionnelle européenne et les diverses activités biologiques présentées par l’A. ursinum peuvent être attribuées à divers composés soufrés, notamment les thiosulfinates qui sont les constituants chimiques les plus abondants de l’A. ursinum et les composés phénoliques (Xu et al., 2013 ; Sobolewska et al., 2015). Seuls sept composés soufrés, qui représentent les produits de dégradation des thiosulfinates, ont été détectés par analyse de chromatographie en phase gazeuse 2D dans les extraits examinés. Il a été montré que les composés allyl soufrés, dont le disulfure de diallyle identifié dans les extraits testés, inhibent la prolifération des cellules malignes en induisant une accumulation en phase G2/M ainsi qu’en induisant l’apoptose (Knowles et Milner, 2001 ; Herman-Antosiewicz et Singh, 2004 ; Park et al., 2007 ; Yi et Su, 2013). En outre, il a été démontré que le disulfure de diallyle déclenchait l’apoptose dans les cellules cancéreuses par l’activation de la caspase-3 et de la voie de signalisation mitochondriale (Nagaraj et al., 2010 ; Yi et Su, 2013).
Les résultats de notre étude in vitro suggèrent que la consommation d’A. ursinum pourrait avoir des propriétés bénéfiques pour la santé, y compris des effets anticancéreux. Des recherches in vivo approfondies sont nécessaires pour évaluer pleinement l’éventuelle efficacité de prévention du cancer de l’A. ursinum et de ses composés bioactifs, en plus d’études supplémentaires de biodisponibilité et de pharmacocinétique.
Effets bénéfiques du microbiote associé à l’A. ursinum
Les données récentes de la littérature ont révélé que de nombreuses molécules phytothérapeutiques proviennent du microbiote associé aux plantes, bien qu’il s’agisse encore d’un domaine très peu exploré (Köberl et al., 2013). En particulier, le microbiote des plantes médicinales est très spécifique, dépendant des métabolites secondaires bioactifs uniques produits par les plantes médicinales (Qi et al., 2012). Les plantes sont reconnues comme une source importante de BL, bien que non systématiquement étudiée. Récemment, Köberl et al. (2019) ont identifié les surfaces foliaires et l’endosphère foliaire de Matricaria chamomilla L. et Calendula officinalis L. comme une source de BL, avec les Enterococcaceae présentes de manière dominante dans les deux plantes, tandis que les Lactobacillaceae et les Carnobacteriaceae étaient plus abondantes sur M. chamomilla, et les Leuconostocaceae et Streptococcaceae plus abondantes sur C. officinalis. L’objectif spécifique de cette étude était la détermination du microbiote associé à l’A. ursinum, ainsi que l’isolement et l’identification des BL de l’A. ursinum aux effets bénéfiques potentiels pour la santé.
En général, les communautés microbiennes peuvent être évaluées par des méthodes traditionnelles et moléculaires. Le nombre d’études relatives à l’évaluation de l’écologie des communautés microbiennes a démontré que la diversité et la structure du microbiote associé ne peuvent pas être étudiées avec succès en utilisant une seule des approches mentionnées ci-dessus. Les méthodes conventionnelles dépendantes de la culture sont chronophages et nécessitent l’isolement et la culture des micro-organismes avant leur identification ainsi que des tests physiologiques. Ainsi, les taxons moins abondants peuvent souvent être supplantés sur les boîtes de culture par des espèces numériquement plus abondantes. En revanche, l’analyse DGGE, comme l’une des techniques moléculaires les plus fréquemment utilisées et hautement fiables pour l’étude de l’écologie microbienne complexe, repose sur l’isolement direct de l’ADN, bien que cette méthode manque d’informations quantitatives relatives aux proportions des taxons présents. En effet, il est largement admis que la combinaison des approches dépendantes et indépendantes de la culture devrait être utilisée pour décrire la diversité, la structure et la dynamique des communautés microbiennes complexes (Cocolin et al., 2013).
Dans cette étude, l’analyse DGGE a révélé la présence prédominante des espèces de BL Lc. lactis, S. thermophilus, L. reuteri et L. gasseri. En outre, Leuconostoc mesenteroides/pseudomesenteroides et Macrococcus caseolyticus, un gros coque à Gram positif, souvent associé à la viande et au lait de brebis, de chèvre et de vache, ont été identifiés. De plus, Erwinia billingiae, une bactérie à Gram négatif appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, généralement retrouvée comme pathogène des plantes, ainsi que Staphylococcus warneri, associé à des bactériémies, ont été identifiés dans l’analyse DGGE (Kamath et al., 1992 ; Prod’homme et al., 2017).
Cependant, lorsque l’approche microbiologique traditionnelle dépendante de la culture a été utilisée, outre les BL principalement représentées par L. fermentum, diverses autres espèces ont été identifiées, notamment la bactérie du sol Bacillus niacini (Nagel et Andreesen, 1991), la rhizobactérie favorisant la croissance des plantes Bacillus aryabhattai (Bhattacharyya et al., 2017), Paenibacillus amylolyticus, précédemment isolé de son de riz fermenté (Akuzawa et al., 2016), le pathogène des plantes Curtobacterium flaccumfaciens (Evtushenko et Takeuchi, 2006), le pathogène des plantes et de l’homme Bacillus pumilus (Yuan et Gao, 2015), le pathogène opportuniste, cause principale des infections staphylococciques Staphylococcus haemolyticus (Czekaj et al., 2015), Arthrobacter woluwensis, associé à l’endocardite infectieuse subaiguë (Bernasconi et al., 2004), ainsi que Rothia amarae précédemment trouvé dans les boues d’un égout d’eaux usées (Fan, 2002).
Prises dans leur ensemble, les résultats obtenus dans cette étude ont révélé des divergences entre les deux méthodes utilisées, soulignant que les espèces moins abondantes n’ont pas été entièrement détectées par la méthode dépendante de la culture. Les divergences constatées pourraient également être liées à la détection par PCR de l’ADN résiduel de cellules mortes qui ne pouvaient pas être détectées par la méthode dépendante de la culture, ainsi qu’aux milieux de culture utilisés dans l’étude, certaines espèces ayant des exigences de croissance spécifiques qui n’étaient pas satisfaites dans le dispositif expérimental.
L’analyse détaillée des isolats de L. fermentum a révélé que les 14 souches pouvaient être divisées en deux pulsotypes PFGE. Ainsi, le potentiel bénéfique pour la santé de la souche L. fermentum BGSR163, appartenant au pulsotype 1, et de L. fermentum BGSR227, appartenant au pulsotype 2, a été caractérisé plus avant.
Selon (Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture et Organisation mondiale de la santé, 2006), les probiotiques sont définis comme des « micro-organismes vivants qui confèrent des bienfaits pour la santé de l’hôte lorsqu’ils sont ingérés en quantités adéquates ». Les principaux critères de détermination des probiotiques sont leur statut de sécurité, leur survie dans les conditions simulées du TGI, la capacité à coloniser le TGI et le potentiel immunomodulateur.
Le statut de sécurité des souches probiotiques implique l’absence de facteurs de virulence (par exemple, activité hémolytique et/ou gélatinase) et la sensibilité aux antibiotiques cliniquement pertinents (Autorité européenne de sécurité des aliments, 2012). Les résultats obtenus dans cette étude ont confirmé que les souches L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 sont sûres pour une utilisation comme probiotiques puisqu’elles ne présentent pas d’activité hémolytique et gélatinase et sont sensibles à tous les antibiotiques cliniquement pertinents.
La survie dans les conditions gastro-intestinales simulées est un critère important pour la sélection des souches probiotiques afin qu’elles exercent leurs effets probiotiques dans l’intestin (Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture et Organisation mondiale de la santé, 2006). Les résultats de cette étude ont révélé que les souches survivaient avec succès au passage simulé dans le TGI. Il était connu d’après les données de la littérature que les bactéries survivent mieux au transit dans le TGI lorsqu’elles sont appliquées dans une matrice alimentaire en raison de l’effet tampon et protecteur des composants alimentaires sur les bactéries probiotiques (Ranadheera et al., 2010). En particulier, les souches survivaient avec succès aux conditions buccales simulées, indiquant que les deux souches étaient résistantes à la salive et à l’α-amylase. Le nombre de cellules viables a diminué dans les conditions gastriques simulées, bien que le nombre d’UFC ait été encore assez élevé, indiquant que les souches sont habituées à l’environnement acide, ce qui est attendu pour les souches de BL (Nikolic et al., 2012). Fait intéressant, la croissance des souches a été restaurée dans les conditions intestinales simulées, indiquant une possible pré-adaptation dans l’environnement naturel puisque L. fermentum a été communément trouvé dans l’intestin.
La colonisation transitoire de la muqueuse intestinale est un autre critère important proposé par la directive FAO/OMS pour la sélection des souches probiotiques. Dans cette étude, l’adhésion des souches de L. fermentum BGSR163 et BGSR227 aux cellules épithéliales intestinales (CEI) Caco-2 a été étudiée. Les deux souches ont présenté la capacité d’adhérence aux CEI dans une gamme commune aux souches probiotiques (Sokovic Bajic et al., 2019), bien que l’adhésion la plus élevée ait été observée chez la souche L. fermentum BGSR163 que chez la souche L. fermentum BGSR227.
Enfin, les effets immunomodulateurs des souches L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227, ainsi que de l’extrait d’A. ursinum, ont été évalués. Les deux souches L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ont significativement stimulé la production de la cytokine pro-inflammatoire IL-17 (p < 0,01 et 0,001 respectivement), ainsi que la production de la cytokine immunorégulatrice IL-10 (p < 0,001). Les résultats obtenus indiquent le potentiel de ces probiotiques à stimuler la réponse du système immunitaire aux pathogènes extracellulaires. Le surnageant de culture cellulaire de L. fermentum BGSR163 et les bactéries inactivées par UV L. fermentum BGSR163 et L. fermentum BGSR227 ont diminué la production de la cytokine pro-inflammatoire IFN-γ (p < 0,01 et 0,001 respectivement). Étant donné que les souches inactivées par UV ont significativement réduit la production d’IFN-γ, la principale cytokine Th1, importante pour la réponse aux pathogènes intracellulaires, les surnageants de cultures cellulaires apparaissent comme un meilleur choix pour une utilisation comme postbiotiques. L’utilisation possible du surnageant de culture cellulaire de L. fermentum BGSR227 comme postbiotique pourrait être une bonne stratégie pour stimuler la réponse aux pathogènes, sans réduire la capacité du système immunitaire à répondre à une infection virale concomitante. Le traitement par l’extrait végétal et le traitement par la matrice alimentaire n’ont pas exercé d’effets sur la production de cytokines.
Conclusion
Prises dans leur ensemble, les résultats de cette étude suggèrent que la consommation d’A. ursinum pourrait avoir des propriétés bénéfiques pour la santé, y compris des effets anticancéreux. Le statut de sécurité (l’absence d’activité gélatinase et hémolytique, la sensibilité aux antibiotiques cliniquement pertinents) et le potentiel bénéfique pour la santé (survie lors du passage simulé dans le TGI, la capacité à coloniser la muqueuse intestinale et le potentiel immunomodulateur) des souches de L. fermentum associées à l’A. ursinum isolées dans cette étude indiquent que les souches pourraient être utilisées comme probiotiques pour la consommation humaine. Cependant, des recherches in vivo approfondies sont nécessaires pour évaluer pleinement l’éventuelle efficacité de prévention du cancer de l’A. ursinum et de ses composés bioactifs, ainsi que l’activité probiotique de ses souches de L. fermentum associées, en plus d’études supplémentaires de biodisponibilité et de pharmacocinétique.
Déclaration de disponibilité des données
Les contributions originales présentées dans l’étude sont incluses dans l’article/le matériel supplémentaire, les demandes complémentaires peuvent être adressées à l’auteur correspondant.
Contributions des auteurs
NS, SB et MT ont conçu et élaboré l’étude. NS et SB ont réalisé le travail principal. NP a participé à la recherche sur le statut de sécurité et la relation entre les origines des isolats, et a réalisé les expériences avec les animaux utilisés. DP et AT-V ont participé à l’isolement et au dénombrement des BL. SB, MT et DP ont participé à la caractérisation probiotique des isolats et à l’analyse DGGE. NS, SB, MT et NG ont analysé, interprété et révisé de manière critique les données. NS, SB, NG et JS ont préparé le manuscrit pour soumission. ŽJ a réalisé les dosages d’activité antioxydante. IM a testé les effets des extraits sur la distribution des phases du cycle cellulaire. VB a réalisé la GC × GC-MS. Tous les auteurs ont finalement approuvé la version à publier.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière susceptible d’être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.