Les extraits de Tulbaghia violacea et d’Allium ursinum présentent des activités antiparasitaires et antimicrobiennes
Référence : Molecules 2018 · PMID 29393867 · DOI 10.3390/molecules23020313 Type : etude in vitro · Plante : Ail des ours · Propriété → Antiparasitaire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
L’ail a joué un rôle important dans les arts culinaires et les remèdes de la médecine traditionnelle tout au long de l’histoire humaine. Les infections parasitaires représentent un fardeau dans la société, en particulier des pays pauvres, causant plus d’un milliard d’infections chaque année et entraînant environ un million de décès. Dans cette étude, nous avons examiné le mode d’action antiparasitaire des « ails sauvages » Tulbaghia violacea et Allium ursinum, à travers leurs extraits au dichlorométhane, contre les parasites Trypanosoma brucei brucei et Leishmania tarentolae, au regard de leur activité antimicrobienne déjà connue. Nous avons également évalué leur potentiel cytotoxique vis-à-vis de cellules humaines. Les deux extraits ont montré une activité trypanocide et leishmanicide notable, bien que L. tarentolae ait été moins sensible. Nous avons déterminé que le mode d’action probable des deux extraits est l’inhibition irréversible de l’activité de l’enzyme trypanothion-réductase de Trypanosoma brucei. Les extraits ont montré une activité cytotoxique modérée contre les kératinocytes humains. Ils ont également présenté une activité antibactérienne et antifongique faible — dans la plupart des cas comparable. L’analyse par HPLC-MS/MS a montré que les deux extraits sont riches en composés soufrés. Ainsi, pour la première fois, est démontrée la capacité d’Allium ursinum et de Tulbaghia violacea à tuer les parasites Trypanosoma sp. et Leishmania sp., probablement en se liant à des composés soufrés essentiels à la survie du parasite et en les inactivant.
1. Introduction
L’ail est utilisé depuis des milliers d’années, principalement à des fins culinaires mais aussi comme remède en médecine traditionnelle. Les anciens Israéliens appelaient l’ail « tueur de parasites » ; Hippocrate le mentionnait comme médicament contre les parasites intestinaux. De nombreuses études ont révélé les effets anticancéreux, antioxydants, antimicrobiens, hypolipémiants, anti-inflammatoires et antiparasitaires de l’ail.
Tulbaghia violacea Harv. (Amaryllidaceae) d’Afrique australe est connue sous le nom d’agapanthe rose ou d’ail doux. Les espèces de Tulbaghia ont été utilisées à des fins culinaires et ornementales, mais le genre présente aussi un intérêt médicinal. Les bulbes d’agapanthe rose ont été utilisés en médecine traditionnelle pour le traitement de la tuberculose pulmonaire et contre les helminthes. Des études ont vérifié que des extraits de différentes parties de la plante de T. violacea présentent des activités antibactériennes, antifongiques, anticancéreuses, antioxydantes et anthelminthiques. L’espèce européenne Allium ursinum L. (Amaryllidaceae) est aussi connue sous le nom d’ail des ours (ramsons ou bear’s garlic). Elle a été intégrée à la médecine populaire comme agent antimicrobien, digestif et protecteur contre les maladies cardiovasculaires et les problèmes respiratoires. Des recherches récentes ont confirmé ses effets anticancéreux, anti-inflammatoires, antiviraux, antiplaquettaires et hypolipémiants. T. violacea comme A. ursinum sont des espèces comestibles couramment utilisées et sont désignées comme « ails sauvages ».
Il est largement admis que l’odeur caractéristique d’ail et le goût spécifique proviennent de métabolites secondaires (MS) soufrés, typiques à la fois de Tulbaghia et d’Allium. Ces composés soufrés représentent la majorité de leurs constituants chimiques, et l’on pense fortement qu’ils sont à l’origine de leur activité pharmacologique. Les bulbes intacts sont inodores, mais dès que le tissu végétal est endommagé, une réaction enzymatique se déclenche, hydrolysant des acides aminés non protéinogènes tels que l’alliine ou des MS apparentés, ce qui conduit à des produits thiosulfinates volatils. L’analyse chimique de Tulbaghia a été plutôt négligée par rapport aux espèces d’Allium. Chez Allium, lorsque les bulbes sont lésés, l’alliinase entre en contact avec l’alliine et produit l’allicine, qui, dans des réactions ultérieures, est convertie en d’autres composés soufrés. Chez les espèces de Tulbaghia, la réaction part au lieu de l’alliine de la marasmine, qui est transformée enzymatiquement en marasmicine, un analogue de l’allicine ( [ ] ). On pense que cette voie est analogue à la voie de l’alliinase chez les espèces d’Allium.
Les infections parasitaires ont toujours été une cause de mortalité dans les sociétés humaines, en particulier dans les pays pauvres. Plus d’un milliard d’infections surviennent chaque année, entraînant environ un million de décès. Avec seulement quelques médicaments homologués — souvent assortis d’effets secondaires graves — contre les infections parasitaires telles que la trypanosomiase et la leishmaniose, de nouveaux agents thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence.
Chez les parasites de la classe des Kinetoplastida, l’enzyme vitale pour le système d’oxydoréduction est la trypanothion-réductase, contrairement aux humains chez qui la glutathion-réductase joue le rôle principal. Alors que le glutathion est le principal composé d’oxydoréduction chez les vertébrés, c’est le trypanothion chez les Kinetoplastida. Bien que les deux enzymes présentent des caractéristiques similaires, leur spécificité pour les disulfures est différente, car le site de liaison du substrat de la trypanothion-réductase est — contrairement à celui de la glutathion-réductase — hydrophobe, plus large et chargé négativement. Leur différence structurelle constitue la base d’une opportunité thérapeutique intéressante : trouver des agents capables d’inactiver la trypanothion-réductase et le trypanothion, mais pas la glutathion-réductase ni le glutathion.
Comparées à d’autres espèces d’Allium, telles que l’ail ( A. sativum ) et l’oignon ( A. cepa ), les deux espèces d’ail sauvage ( T. violacea et A. ursinum ) sont mal caractérisées. C’est pourquoi, dans cette étude, nous avons examiné la phytochimie des deux espèces et le mode d’action antiparasitaire potentiel des extraits de bulbes au dichlorométhane contre les parasites Trypanosoma brucei brucei et Leishmania tarentolae. Pour la première fois, l’activité trypanocide et leishmanicide de T. violacea et d’A. ursinum est rapportée, et la preuve que le système trypanothion-réductase / trypanothion est impliqué est apportée. L’activité antimicrobienne a été confirmée en testant sept bactéries à Gram positif et cinq bactéries à Gram négatif (y compris plusieurs souches multirésistantes) ainsi que deux champignons.
2. Résultats et discussion
Les extraits au dichlorométhane d’ail doux ( Tulbaghia violacea, TV) et d’ail des ours ( Allium ursinum, AU) ont été évalués pour leurs activités antiparasitaires et antimicrobiennes, ainsi que pour le mode d’action moléculaire potentiel de leur action antiparasitaire.
L’analyse par HPLC-MS/MS a clairement démontré que les composés soufrés sont abondants dans les deux extraits. Nous avons trouvé la présence d’allicine et d’ajoène dans les bulbes d’A. ursinum ( [ ] ). L’extrait de TV contenait également des composés soufrés, qui différaient de l’extrait d’AU. Le composé principal était la marasmicine, ce qui concorde avec des rapports antérieurs ( [ ] ). Les composés ont été identifiés selon le temps de rétention et les données de spectrométrie de masse, en référence à des publications antérieures.
Les extraits ont présenté une activité antibactérienne et antifongique faible et non spécifique ( [ ] ). L’extrait d’AU s’est révélé plus efficace contre Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) que le TV, avec une CMI de 80 µg/mL. Les extraits d’AU et de TV ont totalement inhibé la croissance visible de B. subtilis à une CMI de 80 et 40 µg/mL, respectivement. AU a présenté une activité modérée contre Pseudomonas aeruginosa (CMI à 40 µg/mL). Les deux extraits ont inhibé la croissance des levures Candida : 10 µg/mL d’AU ont suffi non seulement à inhiber la croissance, mais aussi à tuer C. parapsilosis à la même concentration que le témoin positif, la nystatine. L’essai a servi de contrôle pour montrer que nos résultats concordent avec des études antérieures ayant rapporté de faibles activités antimicrobiennes des extraits d’AU et de TV.
Les extraits d’AU et de TV ont tué 50 % des T. b. brucei à 1,45 et 2,83 µg/mL, respectivement. Les parasites L. tarentolae étaient moins sensibles que les trypanosomes, tout en restant sensibles à l’activité antiparasitaire des deux extraits. Les courbes dose-dépendantes correspondantes sont illustrées dans la [ ], tandis que les valeurs de CI50 sont documentées dans la [ ].
Afin de comparer l’effet antiparasitaire des extraits d’AU et de TV à leur cytotoxicité envers les cellules humaines et d’évaluer leur éventuel usage topique contre la leishmaniose ainsi que les infections bactériennes et fongiques, nous avons utilisé in vitro des kératinocytes spontanément transformés issus de cellules cutanées histologiquement normales (HaCaT). Les extraits d’AU et de TV ont montré une activité cytotoxique modérée en tuant 50 % des cellules à des concentrations de 23,71 et 21,35 µg/mL, respectivement. Les indices de sélectivité (IS), avec des valeurs de 16 et 8 pour AU et TV chez les trypanosomes, respectivement, sont plus favorables lorsqu’on compare l’activité cytotoxique envers les cellules HaCaT avec l’effet trypanocide qu’avec l’effet leishmanicide. AU pourrait potentiellement être utilisé par voie topique lors de la première phase de l’infection à T. brucei, au cours de laquelle les parasites peuvent se trouver dans la peau après la piqûre de la mouche tsé-tsé pendant quelques jours. Les valeurs d’IS et de CI50 sont documentées dans la [ ].
Nous avons émis l’hypothèse que l’effet trypanocide et leishmanicide est causé par des composés soufrés capables d’établir des liaisons disulfure (–S–S–) avec des groupes thiol libres (–SH), les inactivant ainsi. Les groupes thiol libres sont présents à l’intérieur du parasite au niveau des sites actifs de certaines substances vitales pour la survie des trypanosomes, comme la flavoenzyme à NADPH trypanothion-réductase et le trypanothion lui-même, qui fournissent un environnement réducteur intracellulaire et jouent un rôle majeur dans la défense contre le stress oxydatif ( [ ] ). Le système d’oxydoréduction du trypanothion est propre aux Trypanosomatida, tandis que les humains dépendent du système glutathion-réductase / glutathion. Afin d’évaluer notre hypothèse, nous avons étudié l’inhibition de l’enzyme TbTR par les extraits, et les résultats sont illustrés dans la [ ]. Dans notre expérience, nous avons confirmé que les deux extraits sont des inhibiteurs irréversibles de l’enzyme TbTR : 50 µg/mL d’extrait d’AU et de TV ont inhibé l’activité enzymatique de la TbTR de 71 % et 63 % en 4 h, respectivement. L’un des composés que nous avons trouvés dans l’extrait d’AU est l’ajoène. Nos données sur l’inhibition de la TbTR concordent avec une étude antérieure ; celle-ci a fourni la preuve que l’ajoène est un inhibiteur de la trypanothion-réductase. Le TV semble inhiber la TbTR de manière rapide ; après 0,5 min, une diminution de l’activité de la TbTR était perceptible. Il se pourrait que la marasmicine, le composé principal de l’extrait de TV, en soit responsable. Dans cette étude, la capacité d’un extrait contenant de la marasmicine à inhiber une enzyme vitale pour la survie des Kinetoplastida et à tuer efficacement les parasites est démontrée pour la première fois. Des études in vivo sont nécessaires pour confirmer le potentiel antiparasitaire de la marasmicine dans un organisme vivant afin d’ouvrir de nouvelles voies pour le développement possible d’un nouveau médicament.
Ainsi, pour la première fois, la preuve d’une activité antiparasitaire notable d’Allium ursinum et de Tulbaghia violacea contre les parasites Trypanosoma et Leishmania est apportée. De futures études analysant en profondeur le mécanisme d’action et l’activité in vivo sont justifiées. Nos résultats indiquent un mécanisme d’action probable : les composés soufrés inhibent des composés vitaux pour la survie des parasites, tels que la trypanothion-réductase. Il convient toutefois de noter que les deux parasites trypanosomatidés utilisés pour les essais ne sont pas pathogènes pour l’homme. D’autres études avec des espèces/souches cliniquement pertinentes restent à mener.
3. Matériels et méthodes
3.1. Produits chimiques
Le chlorure d’hémine a été acheté chez Merck Millipore (Darmstadt, Allemagne). Le milieu DMEM avec Glutamax, le MEM, les acides aminés non essentiels (NEAA), la pénicilline, la streptomycine, la trypsine-EDTA et la l-glutamine provenaient de Gibco® Invitrogen (Darmstadt, Allemagne). Le chlorhydrate de doxorubicine a été obtenu auprès de l’hôpital universitaire de Heidelberg. La nystatine et l’ampicilline ont été achetées chez AppliChem (Darmstadt, Allemagne). Le reste des produits chimiques a été obtenu chez Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Allemagne).
3.2. Préparation des extraits
Les bulbes d’Allium ursinum et de Tulbaghia violacea ont été obtenus auprès du Jardin botanique de l’Université de Heidelberg. Pour préparer les extraits, 30 g de bulbes de chaque espèce ont été écrasés et homogénéisés dans un mixeur commercial, trempés dans 100 mL de dichlorométhane (CH2Cl2) et laissés sur un agitateur toute la nuit. Les extraits ont ensuite été filtrés sur papier filtre et l’excès d’eau a été éliminé de la phase dichlorométhane à l’aide de sulfate de sodium anhydre. Les extraits au dichlorométhane ont été concentrés à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 °C. Les extraits ont été conservés à −80 °C jusqu’à analyse ultérieure.
3.3. Lignées cellulaires
Pour les expériences, des lignées cellulaires de Trypanosoma et de Leishmania non infectieuses pour l’homme ont été utilisées. Notre lignée cellulaire de T. b. brucei de forme sanguine a été obtenue à l’origine auprès du Prof. Peter Overath (Max-Planck-Institut für Biologie, Tübingen, Allemagne). Elle a été maintenue dans un milieu Baltz complet. Les kératinocytes humains immortalisés (HaCaT ; en collaboration avec le Prof. Stefan Wölfl, Institut de pharmacie et de biotechnologie moléculaire, Heidelberg, Allemagne) ont été cultivés dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec Glutamax, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les deux lignées cellulaires ont été cultivées à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité. Leishmania tarentolae, isolée à l’origine de geckos, a été aimablement fournie par le Prof. Marcel Deponte (Zentrum für Infektiologie, Parasitologie Universitätsklinikum Heidelberg, Heidelberg, Allemagne). Les parasites au stade promastigote ont été cultivés à 26 °C dans du BHI complété par du chlorure d’hémine (10 μg/mL), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Toutes les expériences ont été réalisées avec des cellules en phase de croissance logarithmique.
3.4. Criblage des activités trypanocide, leishmanicide et cytotoxique
Les activités trypanocide, leishmanicide et cytotoxique des extraits ont été étudiées à l’aide de l’essai de cytotoxicité MTT. L’essai MTT repose sur la mesure de la viabilité des cellules par la réduction d’un sel de tétrazolium (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium ; MTT) dans les mitochondries des cellules vivantes en son sel de formazan coloré. Des dilutions en série des extraits ont été obtenues dans le milieu correspondant à la lignée cellulaire, la concentration maximale de solvants ne dépassant pas 2 %. L’incubation de 2 × 10^4 cellules de T. b. brucei ou de 20 × 10^4 cellules de L. tarentolae par puits a été réalisée avec les extraits en dilution en série au demi pendant 48 h dans une plaque de 96 puits (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Allemagne). Ensuite, 0,5 mg/mL de MTT ont été ajoutés. Après 4 h ( T. b. brucei ) et 90 min ( L. tarentolae ) d’incubation, les cristaux de formazan produits par les cellules viables ont été dissous dans 100 µL de DMSO, et les plaques ont été agitées à température ambiante pendant 10 min. Les plaques ont ensuite été lues à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques Biochrom Asys (Biochrom, Cambridge, Royaume-Uni). Après ensemencement de 2 × 10^4 cellules HaCaT par puits et incubation pendant 24 h, les cellules ont ensuite été incubées avec une dilution en série des extraits pendant 24 h. L’essai MTT a ensuite été réalisé comme indiqué précédemment. Le médicament trypanocide suramine, l’amphotéricine B leishmanicide et la doxorubicine cytotoxique ont été utilisés comme témoins positifs. La viabilité cellulaire a en outre été évaluée par microscopie optique. À l’aide de la régression logistique à quatre paramètres (SigmaPlot® 11.0, San Jose, CA, États-Unis), une courbe sigmoïde a été ajustée, et la CI50, qui représente une réduction de 50 % de la viabilité par rapport aux cellules non traitées, a été calculée.
3.5. Indice de sélectivité
La cytotoxicité contre T. b. brucei et L. tarentolae a été comparée à celle contre les cellules HaCaT, afin de calculer l’indice de sélectivité (IS). L’IS représente le rapport de la valeur de CI50 pour les cellules de mammifères divisée par la CI50 chez les trypanosomes ou les parasites leishmaniens. Des valeurs plus élevées d’IS signifient une activité sélective contre les parasites et sont donc importantes si l’on envisage l’utilisation d’un agent chimiothérapeutique.
3.6. Essai d’inhibition de la trypanothion-réductase de Trypanosoma brucei (TbTR)
La méthode a été développée à l’origine par Jockers-Scherübl et al. (1989). La TR recombinante et le trypanothion ont été synthétisés selon des procédures déjà publiées. Dans un mélange réactionnel de 200 μL, 20 et 50 μg/mL d’extraits ou une quantité équivalente de solvant ont été incubés avec 25 μL de TbTR (20 U/mL) en présence et en l’absence de 400 μM de NADPH à température ambiante pendant 240 min. Après 0,5, 15, 30, 60, 120 et 240 min, un aliquot de 5 μL a été prélevé et utilisé pour déterminer l’activité résiduelle de l’enzyme dans un essai standard. Le troisième mélange contenait le tampon, la TbTR, l’extrait et pas de NADPH, afin de vérifier si l’enzyme oxydée peut réagir de manière irréversible.
3.7. Tests antimicrobiens
Les extraits ont été testés contre sept bactéries à Gram positif et cinq bactéries à Gram négatif ainsi que deux champignons, à des concentrations comprises entre 320 et 2,5 µg/mL. Les micro-organismes à Gram positif étaient Bacillus subtilis ATCC 6051, Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) NCTC 10442, l’isolat clinique SARM KL 21790, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis résistant à la vancomycine VanB positif (ERV) ATCC 51299, et Streptococcus pyogenes ATCC 12344. Les bactéries à Gram négatif étaient Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli entérohémorragique O157:H7 ATCC 35150, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, l’isolat clinique Klebsiella pneumoniae UL 30082, et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. L’activité anti-candida a été déterminée à l’aide de Candida albicans ATCC 90028 et Candida parapsilosis ATCC 22019. Tous les organismes ont été fournis par le Département des maladies infectieuses, de microbiologie médicale et d’hygiène de l’Université de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne.
La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été obtenue par microdilution en bouillon selon la méthode du CLSI. Les bactéries ont été maintenues sur gélose Columbia additionnée de 5 % de sang de mouton, et les champignons sur gélose dextrosée de Sabouraud (SDA). Le milieu liquide utilisé pour la détermination des CMI était le bouillon Müller-Hinton pour les bactéries, à l’exception de Streptococcus spp. et Enterococcus spp., qui ont été testés dans du bouillon d’infusion cœur-cervelle (BHI). Le milieu liquide fongique était le RPMI 1640. Pour la détermination des concentrations minimales microbicides (CMM), des volumes définis de chaque puits présentant des concentrations ≥ CMI ont été étalés sur boîte de gélose et incubés pendant 24 h (bactéries) et 48 h (champignons). La concentration minimale d’extraits tuant au moins 99,9 % de l’inoculum initial a été considérée comme la CMM. Des témoins de croissance en présence de solvant et de stérilité ont été inclus dans les tests. La ciprofloxacine et l’ampicilline ont servi de témoin positif pour les bactéries, la nystatine a été utilisée pour les champignons. Les tests ont été réalisés en double par plaque et effectués trois fois.
3.8. Analyse par HPLC-MS/MS
La chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-PDA-MS/MS) a été utilisée pour identifier la composition chimique des extraits. Le système LC était un Thermofinnigan (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, États-Unis) couplé à un spectromètre de masse à trappe ionique LCQ DECA XP Plus avec une source ESI. La séparation a été réalisée à l’aide d’une colonne à phase inverse C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18, Rapid resolution, 4,6 × 150 mm, 3,5 µm, Agilent, Santa Clara, CA, États-Unis). Un gradient d’eau et d’acétonitrile (0,1 % d’acide formique chacun) de 5 % à 70 % d’ACN en 45 min a été appliqué, puis maintenu pendant 5 min dans les dernières conditions. Le débit était de 1 mL/min et un séparateur a été utilisé pour n’acheminer que 50 % de l’échantillon dans l’analyseur. Les échantillons ont été injectés automatiquement à l’aide de l’auto-échantillonneur Surveyor ThermoQuest. L’instrument était contrôlé par le logiciel Xcalibur pour collecter le chromatogramme UV en mode PDA et les données de spectrométrie de masse. Le spectromètre de masse fonctionnait en mode positif avec une tension capillaire de −10 V, une température de source de 275 °C, et de l’azote de haute pureté comme gaz de gainage et gaz auxiliaire à un débit de 80 et 40 (unités arbitraires), respectivement. Les ions ont été détectés en balayage complet dans une gamme de masse de 50–2000 m/z.