Propriétés anti-athérogènes du lyophilisat d’Allium ursinum : effet sur l’homéostasie des lipoprotéines et les biomarqueurs cardiaques chez le lapin hypercholestérolémique
Référence : International Journal of Molecular Sciences 2016. — PMID 27517918 · DOI 10.3390/ijms17081284 Type : etude in vivo · Plante : Ail des ours · Propriété → Circulation & coeur Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
La présente étude évalue la capacité du lyophilisat de feuilles d’Allium ursinum (ail des ours) (WGLL ; teneur en alliine : 0,261 %) à atténuer les lésions cardiovasculaires chez le lapin hypercholestérolémique. Des lapins néo-zélandais ont été répartis en trois groupes : (i) alimentation pour lapin sans cholestérol (témoin) ; (ii) alimentation pour lapin contenant 2 % de cholestérol (hypercholestérolémique, HC) ; (iii) alimentation pour lapin contenant 2 % de cholestérol + 2 % de WGLL (hypercholestérolémique traité, HCT) ; pendant huit semaines. Aux temps zéro et huit semaines, des mesures échocardiographiques ont été réalisées, ainsi que la détermination des paramètres sériques de base. À l’issue de la période de traitement, après lésion d’ischémie-reperfusion, les paramètres hémodynamiques ont été mesurés à l’aide d’un modèle de cœur isolé au travail. Des analyses par western blot du tissu cardiaque ont ensuite suivi pour évaluer l’expression protéique, ainsi qu’une étude histochimique pour la détermination de l’état d’athérome. Le traitement par WGLL a médié des augmentations de la fraction de raccourcissement ; de la fonction ventriculaire droite ; de la vitesse systolique maximale ; de la vitesse systolique de l’anneau tricuspide chez l’animal vivant ; ainsi qu’une amélioration des débits aortique et coronaire. L’analyse par western blot a révélé, en association avec le WGLL, des augmentations de la protéine HO-1 et des diminutions de la production de la protéine SOD-1. Des diminutions associées au WGLL ont été observées sur la couverture de plaque athéroscléreuse aortique, l’ApoB plasmatique et l’activité de la LDH et de la CK (créatine kinase) plasmatiques. Le LDL plasmatique a également été significativement réduit. Les résultats démontrent clairement que le WGLL possède des effets cardioprotecteurs complexes, suggérant de futures stratégies pour son utilisation dans la prévention et le traitement des troubles athéroscléreux.
1. Introduction
L’ail des ours (Allium ursinum L.) est une plante sauvage appartenant à la famille des Amaryllidaceae. Il est largement distribué en Asie et en Europe et connu sous divers noms : ail des ours, ail des bois, poireau des ours, ail sauvage et ail sauvage à larges feuilles. La saveur intense de la plante en fait un condiment populaire et un composant alimentaire régulier pour les humains et les animaux vivant dans les régions où elle pousse. Le léger parfum d’ail de la plante est attribuable à sa teneur en composés soufrés. Ceux-ci comprennent, notamment, des sulfoxydes et des peptides glutamyliques. L’espèce contient aussi des taux élevés de métabolites inodores, non volatils : les S-alk(én)yl-l-cystéine-sulfoxydes, qui s’hydrolysent dans des conditions physiologiques en (poly)sulfures volatils et thiosulfinates, conférant l’odeur et la saveur caractéristiques de la plante. L’ail des ours contient également des taux élevés de composés polyphénoliques, particulièrement dans les feuilles et les bulbes, ce qui explique en grande partie les propriétés antioxydantes et thérapeutiques de ces parties de la plante. Il combine en outre deux propriétés supplémentaires favorables à la santé : la plante possède environ 20 fois le taux d’adénosine de l’ail commun (Allium sativum), et elle présente des taux significativement plus élevés d’ajoène, ces deux éléments se combinant pour stabiliser la pression artérielle et les taux de cholestérol, réduire l’agrégation plaquettaire excessive et améliorer le contrôle physiologique du métabolisme du cholestérol. En effet, les bénéfices cardiovasculaires de l’usage de cette plante ont été jugés si substantiels que l’Association pour la protection et la recherche sur les plantes médicinales européennes l’a désignée « Plante de l’année » pour 1992. Cependant, contrairement à l’ail commun, l’ail des ours n’a pas été étudié dans des essais cliniques, et bien que son effet cardiovasculaire puisse être présumé sur la base de ses constituants chimiques, la confirmation préclinique reste plutôt incomplète. A. ursinum a aussi été sélectionné comme objet de la présente étude sur la base des résultats de travaux antérieurs de ce laboratoire démontrant les propriétés cardioprotectrices d’autres extraits de plantes issus des médecines traditionnelles.
L’hypercholestérolémie, un syndrome caractérisé par des taux anormalement élevés de cholestérol et de lipoprotéines sanguins, a été choisie comme maladie modèle pour la présente étude en raison de son association à un large éventail de pathologies, en particulier l’athérosclérose, avec les thromboses, accidents vasculaires cérébraux et insuffisances cardiaques associés. Bien que A. ursinum ne soit pas typiquement utilisé comme médicament à part entière, ses propriétés anti-athérogènes sont bien connues, à tel point qu’il est utilisé comme traitement diététique de ces troubles à l’hôpital universitaire de Bucarest, en Roumanie. Une évaluation in vitro des effets de plusieurs préparations d’extraits de feuilles fraîches d’A. ursinum sur l’agrégation des plaquettes humaines a révélé que l’agrégation induite par l’ADP était significativement supprimée par les extraits éthanoliques. Les données observées suggéraient une similitude d’action pharmacologique avec le clopidogrel, un inhibiteur thiénopyridine de la formation de caillots qui est un puissant médicament antiplaquettaire. Une explication probable de ce résultat réside dans les propriétés antiagrégantes connues des composants β-sitostérol 3-O-β-d-glucopyranoside et 1,2-di-O-α-linolénoyl-3-O-β-d-galactopyranosyl-sn-glycérol (DLGG) d’A. ursinum. Il a en outre été noté que l’administration pendant 45 jours d’un aliment supplémenté à 1 % p/p d’ail des ours Allium ursinum (ail des ours) ou, alternativement, à 1 % p/p d’Allium sativum (ail cultivé) à des rats spontanément hypertendus (SHR), par groupes de 10 animaux par expérience, a médié une réduction significative de la pression artérielle systolique moyenne finale (PAS).
Les mécanismes sous-jacents possibles incluent la capacité de l’ail des ours à inhiber l’activité de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA). Des tests in vitro sur l’extrait aqueux des feuilles (à la concentration de 0,300 mg/mL) ont montré une activité significativement accrue d’inhibition de l’enzyme comparée à celle des feuilles avec extrait d’ail (58 % contre 30 %). De plus, des taux significativement plus faibles d’activité de l’ECA ont été notés dans le sang des animaux nourris pendant huit semaines avec un aliment standard pour rongeurs contenant 2 % de feuilles entières pulvérisées d’A. ursinum, par rapport aux rats témoins non traités.
La signification physiologique de l’hypercholestérolémie induite par un cholestérol élevé dans l’alimentation administrée aux animaux est particulièrement bien illustrée par la considération de la manière dont de tels régimes affectent les processus inflammatoires, dont la dysrégulation impose un stress oxydatif accru à un large éventail de tissus et auquel les cellules du système cardiovasculaire sont particulièrement sensibles. Par exemple, des porcs maintenus sous régimes supplémentés à 2 % de cholestérol ont présenté une altération de la fonction endothéliale coronaire associée à une capacité réduite à neutraliser les radicaux libres, une expression diminuée de la synthétase de l’oxyde nitrique et une activation élevée du facteur nucléaire-κβ, un facteur de transcription pro-inflammatoire. Les résultats de ces investigations soulignent la signification particulière de l’hypercholestérolémie pour l’étude de la fonction cardiaque, comme cela a été démontré par les études de transfert de gènes menées.
Des travaux antérieurs des auteurs montrent que les méthodes d’extraction utilisées pour récupérer, purifier et concentrer les produits végétaux peuvent causer une certaine dégradation de la bioactivité des molécules constitutives. Pour cette raison, la lyophilisation a été utilisée pour traiter l’A. ursinum administré aux animaux dans la présente étude. Cette méthode est facile à mettre en œuvre et préserve de manière optimale les propriétés natives des molécules biologiques extraites.
2. Résultats
2.1. Analyse bioanalytique du lyophilisat de feuilles d’ail des ours
L’alliine (S-allyl-l-cystéine sulfoxyde) est un acide aminé non protéique abondant dans la plupart des espèces d’Allium. C’est le substrat naturel de l’alliinase. Par conséquent, sa teneur sous forme pure est couramment analysée par HPLC. Le pourcentage d’alliine totale a été analysé par HPLC [ ]. L’analyse d’un échantillon lyophilisé représentatif a révélé que la feuille contenait 0,261 % d’alliine en poids (RSD % = 0,45 %). Le pic majeur à 3,8 min (détection à 204 nm) est identique à l’alliine sur la base de son spectre UV et de son temps de détection identiques à ceux d’un étalon de référence.
2.2. Analyses échocardiographiques
Tous les examens échocardiographiques ont été réalisés dans un intervalle de 20 min, avec les résultats présentés dans le tableau 1 [ ]. Le diamètre télésystolique (ESD) du ventricule gauche mesuré en mode M a présenté des augmentations significatives chez les animaux hypercholestérolémiques (HC) (1,242 ± 0,045 cm pour HC, contre 1,016 ± 0,091 cm noté dans le groupe témoin). Néanmoins, aucun changement de ce paramètre n’a été observé chez les animaux hypercholestérolémiques traités par le lyophilisat de feuilles d’ail des ours (WGLL) (HCT) (1,184 ± 0,020 cm) en comparaison de ce paramètre dans le groupe témoin.
Les données de fraction de raccourcissement (FS) et de fraction d’éjection (EF) étaient fortement corrélées aux mesures des vues parasternales grand axe et petit axe. La FS et l’EF des animaux HC étaient significativement diminuées par rapport à ce résultat évalué chez les animaux du groupe témoin (FS_HC : 29,010 ± 1,056, contre FS_Témoin : 32,310 ± 0,718 ; et EF_HC : 49,810 ± 1,140, contre EF_Témoin : 56,910 ± 1,294, respectivement). En outre, des augmentations significatives de la fraction de raccourcissement ont été observées dans le groupe HCT par rapport au groupe HC (FS_HCT : 32,970 ± 1,131 et EF_HCT : 55,990 ± 1,756). La fonction diastolique du ventricule gauche a été évaluée par les rapports vitesse maximale de remplissage diastolique précoce mitral / vitesse maximale de remplissage diastolique auriculaire (E/A) mesurés en Doppler (onde pulsée, PW). Les rapports E/A étaient significativement plus bas dans le groupe HC par rapport aux animaux témoins (HC : 1,207 ± 0,037 contre le témoin : 1,376 ± 0,045). Malgré ces résultats, aucun changement significatif n’a été observé dans les rapports E/A des animaux traités (HCT : 1,344 ± 0,076) par rapport aux témoins. Le temps de décélération de l’onde E (DecT) a présenté un allongement significatif chez les animaux HC (HC : 87,440 ± 3,534 ms contre le témoin : 71,250 ± 4,101 ms). Cependant, les valeurs de DecT des animaux traités par WGLL étaient significativement plus basses par rapport aux lapins HC (HCT : 69,540 ± 4,787 ms). L’imagerie de vitesse tissulaire (TDI) a révélé une tendance non significative à la diminution des rapports latéraux E’/A’ chez les animaux traités par WGLL. De manière surprenante, la fonction ventriculaire droite caractérisée par la mesure des ondes de vitesse systolique maximale (S’) et de l’excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide (TAPSE) a présenté une amélioration significative chez les animaux traités par WGLL. Les amplitudes des ondes S’ étaient significativement augmentées chez les animaux traités par WGLL, par rapport au groupe HC (HCT : 9,156 ± 0,210 cm/s contre HC : 8,103 ± 0,216 cm/s), et les valeurs de TAPSE étaient également significativement élevées chez les animaux HCT traités par WGLL par rapport aux lapins HC (HCT : 0,646 ± 0,020 cm contre HC : 0,5762 ± 0,015 cm). De plus, les rapports E’/A’ du ventricule droit des animaux traités par WGLL étaient légèrement diminués.
2.3. Fonction cardiaque sur cœurs isolés au travail
La figure 2 montre l’effet, sur les paramètres fonctionnels cardiaques, de l’hypercholestérolémie induite par un cholestérol alimentaire élevé et du traitement par WGLL [ ]. Les fonctions cardiaques évaluées comprenaient : le débit aortique (AF, figure 2A), le débit coronaire (CF, figure 2B), la pression aortique (AoP, figure 2C), la fréquence cardiaque (HR, figure 2D), le débit cardiaque (CO, figure 2E) et le volume d’éjection systolique (SV, figure 2F). La mesure de ces fonctions chez les animaux des groupes HC et HCT a révélé des diminutions de l’AF, de la HR et du CO pour les fonctions basales des cœurs perfusés, par rapport aux témoins (p < 0,05). Il y avait des augmentations significatives de l’AoP pré-ischémique, à la fois dans les groupes hypercholestérolémique et hypercholestérolémique traité par WGLL, par rapport au groupe témoin (p < 0,05). Après 60 min de reperfusion, les animaux de tous les groupes ont montré des diminutions de l’AF, du CF, de la HR et du CO par rapport aux valeurs pré-ischémiques. Des augmentations significatives de la récupération de l’AF et de la HR ont été observées dans le groupe traité par WGLL, par rapport aux autres groupes (p < 0,05). La corrélation ultérieure avec les résultats des mesures échocardiographiques (tableau 1) a encore renforcé la capacité cardioprotectrice du WGLL.
2.4. Analyse par western blot des biomarqueurs de la fonction du tissu cardiaque
Les taux tissulaires myocardiques de quatre médiateurs majeurs de l’homéostasie cardiaque, mesurés par analyse western blot, sont présentés dans la figure 3 [ ]. Les résultats des traitements administrés aux lapins dans ces expériences ont révélé que l’expression de la protéine HO-1 était significativement plus élevée dans le tissu prélevé chez les animaux HCT, par rapport aux taux observés dans le groupe HC (figure 3A, p < 0,05). L’expression tissulaire de la SOD-1 dans le groupe HC s’est avérée significativement plus élevée par rapport aux animaux témoins et HCT (figure 3C, p < 0,05). Les protéines COXIII et VEGF étaient exprimées à des taux plus faibles à la fois dans les groupes HC et HCT par rapport aux quantités de ces protéines trouvées dans les cœurs prélevés chez les animaux témoins (figure 3B,D, p < 0,05).
2.5. Histologie de l’aorte du lapin
Les coupes histologiques d’aortes colorées à l’hématoxyline-oil red O provenant des trois groupes sont présentées dans la figure 4 [ ]. Aucune lésion athéroscléreuse n’a été observée dans les coupes de ces vaisseaux sanguins prélevés chez les animaux témoins nourris avec l’aliment normal pour lapin (figure 4A). À la fin de la période de traitement de huit semaines, jusqu’à 35 % de la surface aortique totale prélevée chez les animaux HC était positive à l’oil red O (figure 4B). L’étendue des lésions athéroscléreuses observées chez les animaux du groupe HC était significativement accrue (figure 4D, 38,610 % ± 0,146 %) en comparaison de la couverture lésionnelle dans les coupes aortiques prélevées chez les animaux du groupe témoin (p < 0,05). Une formation discrète de lésions a été visualisée par coloration à l’oil red O et analyse quantitative consécutive dans les aortes des lapins du groupe HCT (figure 4C). Les aortes prélevées chez les animaux traités par WGLL du groupe HCT ont présenté une couverture lésionnelle athéroscléreuse significativement réduite par rapport au groupe HC (figure 4D, 16,710 % ± 3,421 %, p < 0,05).
2.6. Corrélats sérologiques des traitements expérimentaux
Les résultats des analyses du sérum sanguin périphérique des animaux traités par les régimes alimentaires sélectionnés sont présentés dans le tableau 2 [ ]. Le cholestérol total (TC) et le cholestérol LDL plasmatiques à jeun étaient deux ordres de grandeur plus élevés, et la concentration en cholestérol HDL était huit fois plus élevée dans le groupe HC et six fois plus élevée dans le groupe HCT, par rapport aux taux de ces analytes dans le sérum des animaux du groupe témoin (p < 0,05). Cependant, des taux plasmatiques significativement plus bas de cholestérol TC et LDL ont été observés dans le groupe HCT, par rapport au groupe HC (p < 0,05), montrant un possible effet protecteur du WGLL. De plus, les taux d’ApoA détectés dans le sang des animaux HC (0,022 ± 0,003) étaient significativement plus faibles par rapport à ceux des lapins témoins nourris avec des régimes à teneur normale en cholestérol (0,042 ± 0,005) et des lapins traités par WGLL du groupe HCT (0,056 ± 0,008, p < 0,05). Aucune différence significative n’a été notée entre la teneur en ApoA du sérum des animaux du groupe témoin, par rapport au groupe HCT (p > 0,05). Les taux sériques d’ApoB chez les lapins des groupes HCT et HC étaient significativement plus élevés par rapport au groupe témoin (p < 0,05). De plus, les taux d’ApoB détectés dans le sérum des lapins du groupe HCT (0,172 ± 0,019) étaient significativement plus bas par rapport à la teneur de cet analyte dans le groupe HC (0,280 ± 0,063, p < 0,05). En outre, aucune différence significative n’a été observée entre la teneur en TG sérique de ces trois groupes. Il a en outre été noté que la teneur sérique en protéine C-réactive (CRP), biomarqueur pro-inflammatoire, était augmentée de façon significative dans le sang des animaux HC, par rapport au groupe témoin. Les taux de l’enzyme hépatique GOT étaient élevés dans le sang des animaux du groupe HC (48,8 ± 16,22), par rapport aux groupes témoin et HCT (29,670 ± 2,895 ; 24,910 ± 2,708 ; p < 0,05). Les taux sériques de LDH (316,6 ± 37,17) et de créatine kinase (CK) (2851 ± 600,800) étaient significativement diminués dans le groupe HCT par rapport au groupe HC (791,90 ± 325,4 et 4955 ± 1353 ; p < 0,05).
3. Discussion
Comme décrit dans la section 2.1 des Résultats de ce rapport, l’analyse bioanalytique d’un échantillon représentatif de WGLL a révélé que la feuille contient 0,261 % d’alliine en poids, une propriété de ce matériau qui contribue à sa capacité à atténuer l’expression d’autres biomolécules décrites ici, impliquées dans les processus physiopathologiques athéroscléreux. Ce composant naturel de l’ail frais est un dérivé sulfoxyde formé à partir de l’acide aminé cystéine et contribue de façon majeure à la capacité des extraits d’ail à piéger les radicaux hydroxyles, ainsi qu’à une grande variété d’autres propriétés antioxydantes qui contrent les dommages tissulaires oxydatifs. Il a aussi été démontré que l’alliine stabilise et renforce puissamment l’immunorégulation, contribuant aux propriétés curatives bien connues de l’ail.
Les résultats des analyses échocardiographiques menées sur les animaux vivants, présentés dans le tableau 1, révèlent l’effet du cholestérol alimentaire élevé et du traitement par WGLL. La signification physiologique de ces résultats peut être énoncée selon quatre interprétations majeures des données présentées. Celles-ci peuvent se résumer comme suit :
(1) La stabilité observée tout au long de la période d’évaluation des fréquences cardiaques, des fréquences respiratoires et des mesures en mode M et Doppler démontre que l’activité cardiopulmonaire basale n’a pas été substantiellement perturbée par l’hypercholestérolémie, un résultat pour lequel des preuves préliminaires avaient été fournies par une étude antérieure menée dans le laboratoire des auteurs.
(2) De plus, par rapport aux lapins témoins non traités nourris avec un régime normal, le diamètre télésystolique du ventricule gauche (ESD) mesuré chez les animaux HC était significativement accru, avec ou sans traitement par WGLL, avec une diminution de la fraction de raccourcissement et de la fraction d’éjection chez les animaux HC, et une forte corrélation a été trouvée entre les données de fraction de raccourcissement (FS) et de fraction d’éjection (EF) mesurées sur les vues parasternales grand axe et petit axe. En outre, les effets du traitement par WGLL comprenaient des observations selon lesquelles, par rapport aux animaux HC ne recevant pas le lyophilisat, les lapins HCT montraient des augmentations significatives de la fraction de raccourcissement. Un ESD pathologiquement augmenté est associé à un risque accru de mortalité dans la maladie cardiaque, et une FS et une EF diminuées ont récemment été impliquées comme contributrices à la maladie fibrotique. Ces résultats suggèrent que le WGLL contribuera à la survie des patients cardiaques et à une moindre propension au développement de la fibrose.
(3) Les données de fonction diastolique du tableau 1, générées en mode Doppler (PW), révèlent également que le cholestérol alimentaire élevé a entraîné des rapports E/A du ventricule gauche significativement plus bas par rapport à ceux observés chez les animaux témoins. Les animaux traités par WGLL ont montré des valeurs proches des témoins. De plus, un allongement significatif a été observé dans le temps de décélération de l’onde E (DecT) chez les animaux HC, montrant un schéma de remplissage diastolique anormal du ventricule, qui a été contré par le régime supplémenté en WGLL, indiquant une fonction diastolique légèrement améliorée.
(4) Enfin, des augmentations étonnamment significatives ont été montrées dans le tableau 1, dans la fonction ventriculaire droite médiée par le traitement par WGLL des animaux nourris avec des régimes à cholestérol élevé, obtenues par l’évaluation des ondes de vitesse systolique maximale (S’) et de l’excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide (TAPSE). La réduction de la vitesse systolique maximale identifie la présence d’une dysfonction du ventricule droit (VD) avec une haute sensibilité. Cette réduction était significative chez les animaux HC, mais a été entièrement contrée par le traitement par WGLL, montrant que les effets bénéfiques susmentionnés de la supplémentation en WGLL peuvent aussi s’observer sur la fonction ventriculaire droite. Chez les patients en insuffisance cardiaque, la réduction de la vitesse systolique de l’anneau tricuspide est associée à la sévérité de la dysfonction du VD. De manière surprenante, les valeurs de TAPSE dans le groupe traité par WGLL étaient significativement augmentées même par rapport aux animaux sains. Ces observations indiquent qu’un régime supplémenté en WGLL pourrait avoir des effets positifs sur la fonction systolique du ventricule droit, mais la pertinence de ces effets et les mécanismes sous-jacents nécessitent des investigations supplémentaires.
L’évaluation des fonctions cardiaques sur cœurs isolés au travail montés selon Langendorff, présentée dans la figure 2, a révélé des valeurs d’AoP pré-ischémiques significativement augmentées à la fois dans les groupes hypercholestérolémique et hypercholestérolémique traité par WGLL, par rapport aux lapins témoins non traités. En outre, comme le montre la figure 2, les diminutions de l’AF, du CF, de la HR et du CO associées à la lésion d’ischémie-reperfusion, par rapport aux valeurs pré-ischémiques, ainsi qu’une récupération significativement accrue de l’AF et de la HR chez les animaux nourris avec le lyophilisat ont encore renforcé les propriétés anti-ischémiques du WGLL. Ces effets sont cohérents avec des études antérieures des auteurs, dans lesquelles des interventions qui diminuent le stress oxydatif sur le tissu cardiaque amélioraient de façon spectaculaire la récupération après les événements ischémiques. Une interprétation de la signification de ces résultats pour la capacité cardioprotectrice du WGLL doit être considérée dans le contexte du fait que les événements ischémiques myocardiques réduisent typiquement la pression sanguine aortique cardiaque (AoP), avec une réduction des besoins métaboliques myocardiques, du débit sanguin coronaire et de la tension ventriculaire gauche. Pour ces raisons, les influences qui diminuent l’AoP peuvent être soit délétères, soit bénéfiques. Ainsi, alors qu’une AoP pré-ischémique augmentée chez les animaux HC indique qu’une telle augmentation est pathologique pour les animaux maintenus sous un régime riche en cholestérol, l’incapacité du traitement par WGLL à abaisser l’AoP suggère que l’extrait a un effet négligeable sur cet aspect de la fonction cardiovasculaire.
Les données décrites dans la section 2.4 des Résultats de cet article et présentées dans la figure 3 fournissent les profils d’expression tissulaire ventriculaire de protéines impliquées dans la pathogenèse et la réponse adaptative à la maladie athéroscléreuse. L’analyse western blot du tissu myocardique révèle une teneur significativement élevée en protéine HO-1 dans le tissu prélevé chez les animaux HCT, par rapport à celui prélevé chez les lapins du groupe HC. La protéine de choc thermique HO-1 (hsp-32) est une enzyme majeure de défense antioxydante, qui est augmentée en réponse au traumatisme intrinsèque à un large éventail de maladies, notamment (et surtout) les syndromes athéroscléreux. Souvent, les effets d’un processus pathologique dépassent la capacité protectrice offerte par l’expression endogène de HO-1. Cependant, ses effets cardioprotecteurs peuvent être grandement amplifiés par l’administration d’inducteurs pharmacologiques, comme l’ont démontré les auteurs du présent rapport. Les effets cytoprotecteurs corrélés à une expression accrue de HO-1 sont un effet probable de la dégradation de l’hème par cette enzyme pour produire de la bilirubine et du monoxyde de carbone (CO), tous deux améliorant la fonction saine du tissu cardiovasculaire à la concentration normalement produite par l’activité de HO-1 lors de la clairance normale de l’hème.
L’amplification thérapeutique de HO-1 dans ces études a été obtenue à l’aide d’extraits d’amandes de noyaux de Prunus cerasus (cerise aigre). La présente étude démontre que le lyophilisat de feuilles d’ail des ours médie également cet effet. Cependant, comme ce matériau végétal stimule aussi d’autres effets protecteurs, il ne peut être déterminé, sur la base des données présentées ici, dans quelle mesure l’expression de HO-1 induite par le WGLL contribue aux effets cardioprotecteurs spécifiques révélés.
Les taux de SOD1 mesurés par analyse western blot dans le tissu myocardique des animaux HC après lésion d’ischémie/reperfusion étaient significativement élevés par rapport aux témoins, tandis que l’expression de SOD1 chez les animaux traités par WGLL était maintenue à des taux normaux (témoins). Tant la signalisation apoptotique que les réponses adaptatives au stress oxydatif impliquent des processus pour lesquels l’activité de la SOD1 est un composant critique. Cette enzyme produit de l’oxygène moléculaire et du peroxyde d’hydrogène (H2O2) comme métabolites finaux de son activité principale, qui est de neutraliser le superoxyde. Le H2O2 est lui-même une espèce réactive de l’oxygène (ROS) toxique et peut contribuer à la lésion d’ischémie-reperfusion du tissu myocardique, par une signalisation apoptotique anormalement élevée et des dommages tissulaires oxydatifs dans la cardiopathie ischémique.
La SOD1 est connue pour avoir une capacité à limiter les effets délétères des ROS en éliminant l’O2− pour produire du H2O2, qui est éliminé par la glutathion peroxydase ou par la catalase en H2O et O2 inoffensifs, mais d’autre part, avec du fer(II) libre, le H2O2 peut aussi former des radicaux hydroxyles libres par la réaction de Fenton (voir le résumé graphique). Des taux élevés de SOD associés à des quantités considérables de Fe2+ sont associés à une production accrue du radical hydroxyle hautement toxique et peuvent même accroître l’étendue de la lésion de reperfusion. Un déséquilibre entre la production de H2O2 prooxydant (SOD1) et d’antioxydants, tels que la glutathion peroxydase et la catalase, dans la cellule pourrait conduire à une production renforcée de radicaux libres, susceptible d’entraîner de graves dommages cellulaires. Cela est étayé par l’évaluation de l’activité de la SOD dans le sang de patients ayant subi un infarctus du myocarde, qui a révélé que, par rapport aux individus témoins sains, les taux de SOD dans le groupe de patients étaient significativement plus élevés. Cette différence reflète probablement une réponse adaptative normale visant à limiter les dommages oxydatifs au myocarde imposés par la lésion tissulaire ischémique (et autre).
Les analyses western blot menées dans cette étude ont révélé que COXIII et VEGF, tous deux impliqués dans la physiopathologie des syndromes cardiovasculaires, étaient exprimés à des taux plus faibles, à la fois dans les groupes HC et HCT, par rapport aux quantités de ces protéines trouvées dans les cœurs prélevés chez les animaux témoins. Pour les taux de protéines COXIII et VEGF, il n’y avait pas de changements significatifs entre les groupes traité par WGLL et hypercholestérolémique. Nos résultats suggèrent que l’ail des ours pourrait développer son activité cardioprotectrice via le système hème/HO et n’a pas d’effet sur les protéines COXIII et VEGF.
L’étendue de la couverture de plaque athéroscléreuse sur la surface intimale des aortes de lapin colorées à l’hématoxyline-oil red O révèle une plaque négligeable sur les coupes prélevées chez les animaux témoins maintenus sous des régimes à teneur normale en cholestérol et une étendue lésionnelle d’environ 35 % dans les coupes des lapins HC (figure 4). La couverture lésionnelle significativement réduite observée chez les lapins traités par WGLL nourris avec un aliment riche en cholestérol (HCT) est un effet également observé dans des travaux antérieurs de ces auteurs, dans lesquels l’expression de HO-1 augmentée par l’ajout d’extrait de noyaux de cerise aigre à l’aliment pour lapin protégeait contre la formation de plaque artérielle induite par le cholestérol alimentaire.
Le sang des animaux utilisés dans la présente étude a été évalué pour des analytes sériques exprimés à des taux pouvant être utilisés comme indicateurs diagnostiques et d’effet thérapeutique pour la sévérité de la maladie cardiovasculaire ainsi que pour un large éventail d’autres syndromes inflammatoires sévères. Les résultats des mesures de paramètres sériques sont présentés dans le tableau 2. Ils révèlent des taux plasmatiques à jeun significativement élevés de TC et de cholestérol LDL, qui étaient deux ordres de grandeur plus élevés, et une concentration en cholestérol HDL, qui était huit fois plus élevée chez les lapins HC et six fois plus élevée chez les lapins HCT par rapport aux témoins, des effets qui sont un résultat attendu des régimes riches en cholestérol. Cependant, des taux élevés de cholestérol HDL chez les lapins traités par WGLL peuvent indiquer une propriété cardioprotectrice du lyophilisat dans le contexte des effets bénéfiques du HDL. Des taux significativement plus bas de cholestérol TC et LDL ont été observés chez les animaux traités par WGLL (HCT) par rapport aux groupes nourris avec un aliment riche en cholestérol, mais sans WGLL (HC), démontrant que le lyophilisat est protecteur vis-à-vis de l’influence de ces analytes. Les taux d’ApoA dans le sang des animaux HC étaient significativement plus bas par rapport aux lapins nourris avec un aliment normal (témoins). Ainsi, l’absence de différences significatives dans la teneur en ApoA du sang des animaux nourris avec des régimes normaux (témoins) par rapport à la teneur de cette molécule chez les lapins traités par WGLL maintenus sous cholestérol élevé (HCT) indiquait un effet normalisant du lyophilisat sur ce résultat. La signification de ce résultat est que le déficit en ApoA-I cause à la fois une hypertriglycéridémie et une athérosclérose accrue dans les modèles animaux, ce qui peut être contré par un régime soutenu par le WGLL.
L’analyse de l’ApoB a révélé que les taux systémiques de cet analyte chez les lapins des groupes HCT et HC étaient significativement plus élevés par rapport à ses taux dans le sang des animaux nourris avec un aliment à teneur normale en cholestérol (témoins). De plus, les taux d’ApoB détectés dans le sang prélevé chez les lapins du groupe HCT étaient significativement plus bas en comparaison de la teneur de cet analyte dans le groupe HC. Ce résultat est bien corrélé avec les taux de LDL mesurés dans les deux groupes. Cette observation était attendue puisque l’ApoB est la principale apolipoprotéine des chylomicrons, des VLDL, des IDL et des particules LDL.
L’élévation des TG sériques du groupe HC était tendancielle, mais non significative par rapport à celle des témoins. Une interprétation est que le métabolisme des triglycérides est inaffecté par l’une ou l’autre influence dans les limites de la présente étude. Une analyse plus poussée du sang de chacun des trois groupes testés a révélé une élévation significative de la protéine C-réactive (CRP) chez les animaux HC par rapport aux témoins. Puisque la CRP est un indicateur systémique fiable d’un large éventail de pathologies inflammatoires, ce résultat implique que les taux de cholestérol alimentaire administrés aux animaux dans cette étude ont réussi à induire l’apparition de processus inflammatoires. L’analyse des activités enzymatiques hépatiques sériques a démontré un GOT significativement élevé dans le sang des animaux du groupe HC par rapport aux groupes témoin et HCT, suggérant un effet hépatotoxique d’un apport élevé en cholestérol alimentaire, un effet noté par des investigateurs antérieurs. Enfin, les taux significativement plus bas de LDH et de CK observés chez les animaux HCT, par rapport aux lapins maintenus sous cholestérol élevé (HC), indiquaient que les effets d’une supplémentation alimentaire en WGLL pourraient avoir des effets bénéfiques sur la fonction hépatique altérée causée par l’état hypercholestérolémique. La transcription de l’ARNm d’ICAM-1 induite par le TNFα, dont il a été démontré par des études in vitro qu’elle supprime l’adhésion des monocytes aux tissus artériels porcins et aux HUVEC, était significativement inhibée par le traitement par l’alliine (S-allyl-l-cystéine sulfoxyde). De plus, l’alliine protégeait aussi contre la dépolarisation du potentiel de membrane mitochondrial et la surproduction de l’anion superoxyde, qui surviennent comme effet en aval du TNFα, et peut être corrélée à la suppression de la transcription de l’ARNm de NOX4 par les HUVEC. En outre, le traitement des HUVEC par l’alliine a également été observé comme réduisant la phosphorylation d’ERK1/2, d’IjB et d’IjB (mais pas de p38) médiée par le TNF-α. Ces résultats fournissent une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’alliine agit comme contre-mesure aux pathomécanismes athéroscléreux et sont cohérents avec les effets protecteurs de l’extrait de plante rapportés ici.
4. Partie expérimentale (Méthodologie)
4.1. Lyophilisation des échantillons et bioanalytique
Des feuilles d’Allium ursinum surgelées (Toltelekgyar Ltd., Zalakomar, Hongrie) ont été lyophilisées pendant 24 h dans un lyophilisateur Martin-Christ ALPHA 1-4 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Allemagne) à une pression ambiante de 0,120 millibar (mb), avec une température de condenseur de −50 °C et une température de plateau de 35 °C. Le rapport de la feuille congelée au matériel végétal frais et desséché était de 5:6:1. L’analyse HPLC a été réalisée à l’aide d’un système Waters 600 (Waters Corporation, Milford, CT, USA), équipé d’un détecteur à barrettes de diodes 2998, d’un dégazeur en ligne et d’un passeur automatique d’échantillons, à l’aide d’une colonne à phase inverse Phenomenex Synergi 4 μm Hydro-RP 80Å (250 mm × 4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Avec une température de colonne de 25 °C, une élution en gradient a été appliquée comme suit : 0–15 min : 100 % de phase mobile A (eau + 0,1 % d’acide phosphorique) ; 15–20 min : le ratio de phase mobile B (acétonitrile) augmenté jusqu’à 100 % ; 20–25 min : 100 % B ; 25–27 min : A augmenté jusqu’à 100 % ; 27–45 min : 100 % A. Le débit était de 0,75 mL/min, et l’alliine était surveillée à 204 nm. L’alliine a été détectée à 4,6 min. L’acquisition et l’évaluation des données ont été réalisées à l’aide du logiciel Empower Pro.
L’alliine a été achetée chez LGC Standards. L’acétonitrile utilisé pour l’analyse chromatographique (LiChrosolv® qualité HPLC) a été obtenu chez Merck (Merck Consumer Health Holding GmbH, Darmstadt, Allemagne). Le clarificateur Millipore Direct-Q UV3 (Merck Millipore, Molsheim, France) a été utilisé pour produire de l’eau purifiée pour les mesures HPLC. Des solutions étalons mères d’alliine ont été préparées avec du méthanol et conservées à 4 °C. La gamme d’étalonnage était de 0,5–5 µg d’alliine/injection. L’étalon de calibration a été injecté en triple à six niveaux de volume. L’extraction de l’alliine à partir du matériel végétal lyophilisé a été réalisée avec 10 mL de MeOH à température ambiante pendant 3 min à partir d’un échantillon de 1 g dans un bain à ultrasons. Après filtration à travers une membrane filtrante (Acrodisc® GHP 13 mm, 0,45 μm, Waters Corporation, Milford, CT, USA), 3 échantillons préparés indépendamment ont été analysés en triple.
4.2. Animaux
Les expériences ont été menées à l’aide de lapins néo-zélandais mâles adultes d’un poids corporel moyen de 2,5–3,0 kg. Les animaux ont reçu des soins humains conformément aux « Principes de soins des animaux de laboratoire » de la directive européenne 2010/63/UE pour les expériences sur animaux. La durée de l’alimentation adaptative était de 2 semaines. Les lapins ont reçu un aliment de laboratoire pour rongeurs, ou un aliment enrichi de 2,0 % de cholestérol (Jurasko Ltd., Debrecen, Hongrie), ou un aliment supplémenté en cholestérol contenant 2 % de lyophilisat de feuilles d’ail des ours (WGLL) quotidiennement pendant 8 semaines ad libitum. L’aliment contenant le lyophilisat d’Allium ursinum a été produit dans le laboratoire du Département de technologie pharmaceutique de l’Université de Debrecen. La comparaison du comportement et de l’état de santé général des animaux nourris avec un aliment non supplémenté par rapport à un aliment contenant d’autres composants n’a montré aucune différence observable, sans indication que l’administration de l’aliment ait agi comme facteur de confusion dans les expériences menées.
4.3. Échocardiographie
L’examen échocardiographique des animaux a été mené sous anesthésie légère (kétamine 15 mg/kg, xylazine 3 mg/kg (i.m.)) au temps de 8 semaines de l’étude. Le thorax de chaque animal a été rasé, et le lapin a été positionné en décubitus dorsal. Les mesures échocardiographiques ont été réalisées à l’aide d’un échographe Siemens Acuson 512 (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Allemagne), avec une sonde 7V3c à 7 MHz, en imagerie fondamentale (figure 5). Les mesures conventionnelles ont été effectuées en 2D et en mode M. Les vues parasternales grand axe ont été obtenues et enregistrées pour s’assurer que les valves mitrale et aortique, ainsi que l’apex, étaient visualisés. Les vues parasternales petit axe ont été enregistrées au niveau du muscle mi-papillaire. Les tracés en mode M ont été réalisés au niveau du muscle mi-papillaire, soit dans les vues parasternales grand axe, soit petit axe. Le mode M pour la visualisation et la quantification du mouvement pariétal en recherche cardiovasculaire a été utilisé ; l’acquisition sur ligne unique permet la très haute résolution temporelle (1000 fps) nécessaire à l’analyse de la fonction du VG. Les mesures échocardiographiques comprenaient l’épaisseur interventriculaire et de la paroi libre du ventricule gauche en diastole et en systole (IVSs, IVSd) et le diamètre interne du ventricule gauche en télédiastole (LVIDd) et en télésystole (LVIDs). Le volume télésystolique (ESV), le volume télédiastolique (EDV), le volume d’éjection systolique (SV) et la masse du ventricule gauche ont été calculés. La fraction de raccourcissement a été calculée à l’aide de l’équation FS = [(LVIDd − LVIDs)/LVIDd] × 100 %, et la fraction d’éjection a été calculée à l’aide de la formule suivante (Teicholz) : EF = (LVEDD² − LVESD²)/LVEDD². Dans cette dernière formule, LVEDD signifie dimension télédiastolique du ventricule gauche, tandis que LVESD est la dimension télésystolique du ventricule gauche. Les excursions systoliques maximales des anneaux mitral et tricuspide (MAPSE et TAPSE) ont été évaluées en mode M, en mesurant la distance de mouvement de l’anneau mitral ou tricuspide entre la télédiastole et la télésystole. Toutes les mesures ont été moyennées sur trois à cinq cycles cardiaques consécutifs.
L’imagerie Doppler (PW) de la valve mitrale et de la valve aortique a été obtenue à partir de la vue apicale 4 cavités et de la vue apicale 5 cavités. À partir de l’image de vitesse de remplissage mitral, les mesures suivantes ont été obtenues : ondes E max et A max (vitesses de remplissage mitral précoce et tardif), le rapport E sur A (E/A) et le temps de décélération des vitesses de remplissage précoce (DecT). Les paramètres aortiques et de la chambre de chasse du ventricule gauche (LVOT) ont aussi été calculés : LVOTVmax, LVOT maxPG et LVOTEnvTi.
Les mesures d’imagerie de vitesse tissulaire (TVI) ont été analysées à partir de la vue apicale 4 cavités et des vues parasternales grand axe et petit axe également. Un volume d’échantillonnage tissulaire de 5 mm a été obtenu au niveau de l’anneau mitral à partir des parois septale et latérale. À partir des images acquises, les paramètres fonctionnels suivants ont été mesurés : vitesses des ondes S’, E’/A’, E/E’ (vitesse de remplissage mitral diastolique précoce divisée par la valeur moyenne des vitesses Doppler tissulaires diastoliques précoces latérale et septale) et E’/A’ (rapport des vitesses Doppler tissulaires diastoliques précoce et tardive).
4.4. Mesure des paramètres sériques
Des échantillons de sang ont été prélevés avec des tubes sous vide EDTA-K2 (BD Vacutainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) dans la veine marginale de l’oreille des animaux, au terme du traitement. Les échantillons ont été prélevés et traités aseptiquement pour minimiser l’activité hémolytique. Le taux sérique de cholestérol total (TC), de triglycérides (TG), de cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL-C), de cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL-C) et la valeur de l’apolipoprotéine A-I (ApoA), de l’apolipoprotéine B (ApoB), de la protéine C-réactive (CRP), de l’aspartate transaminase (également appelée transaminase glutamique oxaloacétique, GOT), de la lactate déshydrogénase (LDH) et de la créatine kinase (CK) ont été détectés par des analyseurs automatisés au Département de médecine de laboratoire de l’Université de Debrecen.
4.5. Préparation du cœur isolé au travail (méthode de Langendorff)
Chacun des animaux a été anesthésié avec un mélange kétamine/xylazine (50/5 mg/kg, par voie intramusculaire). Un bolus d’héparine a été administré (1000 U/kg de poids corporel, par voie intraveineuse) 20 min avant la thoracotomie, pour éviter la thrombose. Ensuite, la cavité thoracique a été ouverte et le péricarde incisé. Le cœur a été prélevé et immédiatement transféré dans un tampon Krebs–Henseleit modifié (mKH) glacé (pH 7,4 à 37 °C, gazé avec un mélange 95 % O2 et 5 % CO2). L’aorte a ensuite été canulée et le cœur perfusé pendant 10 min, de manière rétrograde en mode Langendorff avec le tampon mKH pour éliminer le sang résiduel de chaque organe prélevé. Le perfusat avait la composition suivante : NaCl, 118 mmol/L ; NaHCO3, 25 mmol/L ; KCl, 4,8 mmol/L ; CaCl2, 1,8 mmol/L ; Mg2SO4, 1,2 mmol/L ; KH2PO4, 1,2 mmol/L ; et 10 mM de glucose. Une pompe péristaltique à double tête contrôlait le débit de perfusion du tampon mKH. L’auricule gauche a été incisée, et les veines pulmonaires ligaturées. Une petite incision a été pratiquée à la bifurcation des artères pulmonaires ; ainsi tout l’effluent coronaire était collecté par l’artère pulmonaire. Ensuite, la circulation a été commutée en perfusion antérograde, afin de fixer les paramètres de base en mode cœur au travail pendant 20 min.
Les paramètres suivants ont été enregistrés et les données résultantes analysées à l’aide d’un capteur de pression fixé à la ligne d’éjection aortique : pression aortique (AoP), fréquence cardiaque (battements/min), pression développée du ventricule gauche (LVDP). Le débit aortique (AF, mL/min) et le débit coronaire (CF, mL/min) ont été mesurés à l’aide d’un débitmètre. Les cœurs ont ensuite été soumis à 30 min d’ischémie globale, puis perfusés pendant 15 min en mode Langendorff et convertis en mode cœur au travail pendant 105 min. Les paramètres énumérés ci-dessus ont été mesurés et enregistrés pendant la reperfusion aux temps de 30, 60, 90 et 120 min. Immédiatement après 120 min de reperfusion, de petites biopsies myocardiques du tissu cardiaque du VG ont été prélevées et congelées pour une analyse biologique moléculaire ultérieure.
4.6. Analyse histologique de la racine aortique
La coloration des lipides a été réalisée à l’oil red O (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) selon le protocole suivant : les tissus aortiques ont été congelés dans un milieu OCT (Optimal Cutting Temperature) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Des coupes tissulaires au cryostat ont été découpées à une épaisseur de 6,0 µm et appliquées sur des lames Superfrost Plus (Daiggers, Vernon Hills, IL, USA). Les lésions athéroscléreuses de la racine aortique ont été examinées à 3 emplacements, chacun séparé de 120 μm. Quatre à 5 coupes sériées ont été préparées à partir de chaque emplacement, en commençant au-delà de la crosse aortique. Les coupes ont été colorées, comme décrit précédemment, à l’oil red O, suivie de l’analyse de la composition lipidique des lésions, en calculant le pourcentage de surface positive à l’oil red O par rapport à la surface totale de la paroi vasculaire en coupe transversale. Les noyaux ont été contre-colorés à l’hématoxyline (Sigma Diagnostics), selon des méthodes de routine. Toutes les images ont été capturées avec un microscope optique binoculaire (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Allemagne) équipé d’une caméra vidéo et analysées à l’aide du logiciel Scion Image (Scion Corp., Torrance, CA, USA).
4.7. Extraction de la protéine myocardique
Trois cents milligrammes de tissus congelés du myocarde ventriculaire gauche du lapin ont été homogénéisés dans 800 µL de tampon A (25 mM Tris-HCl, pH 8, 25 mM NaCl, 4 mM Na-orthovanadate, 10 mM NaF, 10 mM Na-pyrophosphate, 10 nM acide okadaïque, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF et cocktail d’inhibiteurs de protéases (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) dans un homogénéisateur Polytron. Les homogénats ont été centrifugés à 2000 tr/min à 4 °C pendant 10 min. Le surnageant de la centrifugation ci-dessus a été centrifugé à nouveau à 10 000 tr/min à 4 °C pendant 20 min, et le surnageant résultant a été utilisé comme extrait cytosolique. Le culot nucléaire a été remis en suspension dans 400 µL de tampon A avec 0,1 % de Triton-X-100 et 500 mM de NaCl, puis lysé par incubation pendant une heure sur glace. Les homogénats ont ensuite été centrifugés à 14 000 tr/min à 4 °C pendant 10 min, et le surnageant a été utilisé comme lysat mitochondrial. Les extraits cytosoliques et mitochondriaux ont été aliquotés, congelés instantanément et conservés à −80 °C pour des investigations ultérieures. La concentration totale en protéines a été dosée à l’aide de la méthode à l’acide bicinchoninique (BCA) avec de l’albumine sérique bovine comme étalon (Pierce, Rockford, IL, USA).
4.8. Essais western blot pour l’expression protéique dans le tissu cardiaque
L’analyse western blot a été utilisée pour évaluer, dans le tissu myocardique ventriculaire gauche, le niveau d’expression des protéines suivantes : hème-oxygénase 1 (HO-1), superoxyde-dismutase 1 (SOD1), facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGF), cytochrome c oxydase III (COXIII), cytochrome c oxydase IV (COXIV) et glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). La concentration totale en protéines dans l’extrait cytosolique et mitochondrial a été déterminée à l’aide du kit de dosage protéique BCA. Ensuite, la protéine a été diluée avec du tampon de Laemmli et chauffée à 100 °C pendant 10 min. Les échantillons dénaturés ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) à 120 V pendant 90 min et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) à 100 V pendant 1 h. Des étalons Precision plus Protein Kaleidoscope (Bio-Rad Laboratories) ont été utilisés comme étalons de poids moléculaire. Les membranes ont été bloquées dans un tampon de blocage au lait écrémé à 5 % pendant 90 min, puis incubées une nuit à 4 °C avec des anticorps primaires (Sigma-Aldrich). Après avoir été lavées trois fois pendant 10 min avec du tampon salin tris (TBS) contenant du Tween 20 (TBS-T), les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort dilué au 1:2000 dans du TBS-T et 1 % (p/v) de lait écrémé en poudre pendant 90 min à température ambiante. Un substrat chimioluminescent amélioré (ECL, Litmus Scientific, Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) a été utilisé pour identifier les bandes. La détection a été réalisée par autoradiographie pour des durées variables avec du film radiographique médical (Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgique). L’analyse quantitative des blots scannés a été réalisée à l’aide du programme d’imagerie densitométrique Scion for Windows version Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). L’intensité du signal pour les bandes correspondant à chaque protéine d’intérêt a été estimée et rapportée en unités arbitraires ± SEM.
4.9. Analyse statistique
Toutes les données sont présentées sous forme des amplitudes moyennes de chaque résultat dans un groupe ± erreur standard de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie de tests de comparaison multiple de Kruskal–Wallis avec le logiciel GraphPad Prism pour Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Les valeurs de probabilité (p) inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
5. Conclusions
Les résultats du présent rapport démontrent que le lyophilisat de feuilles d’ail des ours améliore les fonctions cardiaques sur cœurs isolés prélevés chez les lapins traités par WGLL. Les améliorations observées comprennent des valeurs post-ischémiques significativement meilleures du débit aortique chez les animaux traités par rapport au groupe HC (p < 0,05). Les mesures de débit coronaire ont montré des tendances similaires. Les mesures échocardiographiques ont montré des fonctions cardiaques diastoliques améliorées chez les animaux ayant consommé un régime riche en cholestérol contenant du lyophilisat d’Allium ursinum. Une relaxation altérée exprimée par le DecT et les rapports E/A a été trouvée chez les animaux HC, tandis que les paramètres mesurés chez les animaux traités par WGLL atteignaient des valeurs normales. La fonction systolique exprimée par la FS et l’EF s’est aussi avérée significativement diminuée chez les animaux HC, et le processus a été grandement contré par le traitement par WGLL. Fait intéressant, de meilleures fonctions ventriculaires droites ont été mesurées chez les animaux traités (vitesse de l’onde E maximale plus élevée et valeurs de TAPSE plus élevées). La coloration tissulaire a montré une formation de plaque athéroscléreuse significativement diminuée chez les animaux traités par HCT par rapport au groupe HC. Les taux de cholestérol sanguin total chez les animaux nourris avec un régime contenant 2 % de cholestérol ont montré une augmentation spectaculaire après la période de huit semaines, tandis que les valeurs du groupe témoin restaient dans la plage physiologique. Les taux de cholestérol chez les animaux traités par le lyophilisat d’Allium ursinum étaient significativement plus bas par rapport au groupe HC (p < 0,05). Le WGLL a aussi eu des effets bénéfiques notables sur les autres paramètres sériques surveillés (GOT, LDH, CK). Parmi les nouveautés importantes de ce présent rapport figurent les observations qu’un apport accru en cholestérol alimentaire peut élever le taux de SOD1 dans le tissu cardiaque, ce qui est associé à des dommages tissulaires accrus dépendants des ROS, et que ceci peut être contré par le traitement par WGLL ; en outre, nos travaux ont révélé que la supplémentation en WGLL pourrait élever l’activité de la voie cardioprotectrice médiée par HO-1 dans des circonstances hypercholestérolémiques.