Alchemille commune - effets antimelanome, in vitro et in vivo (Diseases 2024)

Effets antimélanome d’Alchemilla vulgaris : une étude complète in vitro et in vivo

Référence : Diseases 2024. — PMC11202689 · DOI 10.3390/diseases12060125 Type : etude in vitro et in vivo · Plante : Alchemille commune · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».

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Résumé

En raison de la richesse des données ethnobotaniques et des preuves croissantes issues de la médecine fondée sur les preuves, l’Alchemillae herba, c’est-à-dire les parties supérieures de l’alchémille commune (Alchemilla vulgaris L.), a été utilisée pour l’évaluation de l’activité antimélanome. L’extrait éthanolique d’A. vulgaris a fortement supprimé la viabilité des lignées cellulaires B16F1, B16F10, 518A2 et Fem-X. Contrairement à l’étude in vitro, où les cellules B16F1 étaient plus sensibles au traitement que leur contrepartie plus agressive B16F10, les résultats obtenus in vivo en utilisant le modèle murin syngénique correspondant étaient tout à fait opposés. La sensibilité plus élevée des tumeurs B16F10 in vivo peut être attribuée à une réponse plus complexe à l’extrait que celle déclenchée in vitro. En outre, le microenvironnement fortement immunosuppresseur dans le modèle B16F1 est altéré par le traitement, comme en témoignent le potentiel accru de présentation antigénique des cellules dendritiques, l’afflux et l’activité des lymphocytes T CD4+ et CD8+, la présence diminuée de lymphocytes T régulateurs et l’atténuation de la production de cytokines anti-inflammatoires. Tous ces effets sont étayés par l’absence de toxicité systémique. Le traitement par l’extrait d’A. vulgaris aboutit à une capacité durable et accrue de réduire la croissance du mélanome, suivie de la restauration de l’immunité antitumorale innée et adaptative sans affecter la physiologie globale de l’hôte.

1 Introduction

Le mélanome malin est connu comme le type de cancer le plus agressif résultant de la transformation néoplasique des mélanocytes. Bien qu’il ne représente que 1 % de toutes les tumeurs cutanées malignes, il est la principale cause de décès liés au cancer de la peau. Après l’approbation des agents d’immunothérapie de première et de seconde génération appartenant aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaire, la survie s’est significativement améliorée chez ces patients. La survie médiane de la maladie métastatique non résécable a été prolongée de 6–9 mois à près de 6 ans pour la combinaison du blocage de CTLA-4 et de PD-1. Malgré ces avancées récentes, de nombreux patients actuellement traités par immunothérapie présentent une progression de la maladie en raison d’une résistance initiale ou acquise. Le développement de médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques qui répondent à ces problèmes représente donc un défi majeur, ouvrant un espace pour la médecine complémentaire ou alternative. Dans la liste des approches non conventionnelles en médecine, les substances naturelles dérivées des plantes occupent la première place. Étant donné qu’un nombre substantiel de chimiothérapies officielles sont des médicaments isolés de plantes ou synthétisés sur la base de biomolécules végétales, les plantes médicinales peuvent être considérées comme une source puissante de médicaments potentiels, fréquemment étudiée au cours des dernières décennies. Outre le fait que les composés purs représentent un système précis et reproductible pour évaluer les effets biologiques, l’impression générale issue des expériences scientifiques et ethnobotaniques est que les extraits totaux, plus précisément leurs fractions lipophiles, ont un plus grand potentiel de suppression de la croissance tumorale que les composants individuels en raison des interactions des molécules polyphénoliques. Cette observation peut être comparée aux protocoles officiels où plusieurs médicaments ayant différentes entrées de signalisation intracellulaire sont combinés afin d’éviter l’émergence de résistances. En reliant les riches données ethnobotaniques et la teneur élevée en phénols rapportées pour les populations balkaniques d’Alchemilla vulgaris L. sensu latiore, communément connue sous le nom d’alchémille commune, l’Alchemillae herba a été sélectionnée pour une étude menée conformément à la médecine fondée sur les preuves. Nous avons précédemment montré que l’extrait de la partie aérienne de la plante, obtenu par différentes procédures d’extraction, possède un fort potentiel pour diminuer la viabilité de nombreuses cellules tumorales in vitro, telles que les lignées cellulaires de tumeurs des organes reproducteurs féminins (HeLa et A2780), de prostate humaine (PC-3), de sein (MCF-7), de poumon (A549), de mélanome (A375) et de côlon (HCT116). De plus, même l’extrait de racine a montré une activité cytotoxique remarquable contre les lignées cellulaires de cancer de la prostate humain (PC-3), de cancer du sein (MCF-7) et de cancer colorectal humain (Caco2). Puisque l’effet d’un composé isolé n’est pas équivalent à l’influence orchestrée du mélange d’extraits, les résultats de certains traitements observés en culture cellulaire sont souvent éloignés de ceux déterminés in vivo. Cela est particulièrement prononcé dans le modèle syngénique où tous les aspects de la réponse immunitaire sont introduits. De plus, l’influence des facteurs microenvironnementaux n’est pas la même aux différents stades de la maladie, de sorte que les effets du traitement peuvent différer significativement selon le degré de progression de la maladie.

En tenant compte de tout cela, la présente étude évalue pour la première fois le potentiel de l’extrait d’A. vulgaris à supprimer la viabilité de deux générations différentes de cellules B16, F1 et F10, in vitro et in vivo, offrant la possibilité de comparer son efficacité selon le statut de différenciation et le microenvironnement.

2 Matériels et méthodes

2.1 Réactifs et cellules

Le milieu de culture RPMI-1640, le milieu de culture Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) à forte teneur en glucose et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été acquis auprès de Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Hesse, Allemagne). Le diméthylsulfoxyde (DMSO), l’iodure de propidium (PI), le Triton X-100, la RNase, le tampon phosphate salin (PBS), la 3-méthyladénine (3-MA), l’ester succinimidyl de carboxyfluorescéine diacétate (CFSE), l’acridine orange (AO), la collagénase I, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), la DNase I, la trypsine, l’acide trichloroacétique (TCA), le TRIS-HCL, le glutathion (GSH), la N-acétyl-L-cystéine (NAC) et la sulforhodamine B (SRB) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). La dihydrorhodamine 123 (DHR) provenait de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, États-Unis). La solution de pénicilline-streptomycine a été achetée chez Biological Industries (Cromwell, CT, États-Unis). Le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) et l’albumine de sérum bovin (BSA) ont été obtenus auprès d’AppliChem (Maryland Heights, MO, États-Unis). Le fluorescéine-di-β-D-galactopyranoside (FDG) provenait d’Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). Le paraformaldéhyde (PFA) a été acquis auprès de Serva (Heidelberg, Allemagne). L’annexine V-FITC (AnnV) provenait de BD Pharmingen (San Diego, CA, États-Unis). Apostat a été acquis auprès de R&D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis). LysoTracker™ Red DND-99 a été obtenu auprès d’Invitrogen (Waltham, MA, États-Unis). Les lignées cellulaires de mélanome murin (B16F1 et B16F10) et de fibroblastes embryonnaires murins (NIH/3T3) ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (Rockville, MD, États-Unis). La lignée cellulaire de kératinocytes humains immortalisés (HaCaT) a été obtenue auprès de CLS Cell Lines Service (Eppelheim, Allemagne). La lignée cellulaire de mélanome humain (518A2) était un don aimable du Prof. Dr. Habil. et Dr. h.c. Goran Kaluđerović, Hochschule Merseburg, University of Applied Sciences, Merseburg, Allemagne. La lignée cellulaire de mélanome humain (Fem-X) était un don aimable de la Dre Milena Čavić, Institut d’oncologie et de radiologie de Serbie, Belgrade, Serbie.

Les lignées cellulaires (B16F1, B16F10, 518A2 et Fem-X) ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 tamponné par HEPES, tandis que les lignées NIH/3T3 et HaCaT ont été cultivées dans un milieu DMEM, les deux milieux étant préalablement supplémentés avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 0,01 % de pyruvate de sodium et des antibiotiques (pénicilline (100 unités/mL) et streptomycine (100 μg/mL)) (milieu de culture). Les cellules ont été maintenues dans des conditions de croissance standard à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2. La densité des cellules B16F1 et B16F10 dans des plaques à 96 puits était respectivement de 3 × 10^3 cellules/puits et 2 × 10^3 cellules/puits, tandis que pour les analyses par cytométrie en flux dans des plaques à 6 puits, elle était respectivement de 1,5 × 10^5 et 1 × 10^5 cellules/puits. La densité des cellules 518A2, Fem-X, NIH/3T3 et HaCaT dans des plaques à 96 puits était de 5 × 10^3 cellules/puits.

Le contenu chimique de l’extrait éthanolique dérivé d’Alchemilla vulgaris L., employé dans cette recherche, ainsi que la méthodologie d’extraction, ont été précédemment documentés. Récolté dans son habitat natif, dans les prairies montagneuses vallonnées modérément humides du sud-est de la Serbie, le matériel végétal, recueilli pendant la phase de floraison, a été méticuleusement identifié et archivé sous forme de spécimens de référence (No. RS-120718-1). Le solvant binaire éthanol-eau (70 % d’éthanol) a été utilisé comme solvant vert et universel fournissant le rendement le plus élevé en polyphénols de l’alchémille commune, principalement des acides phénoliques, des flavonoïdes, des flavanones et des tanins. De plus, dans les Balkans, la teinture d’Alchemilla (extrait éthanolique) est préférée à la consommation de sa tisane monocomposant (décocté). Après une extraction de deux heures, l’analyse chimique du solide résultant, c’est-à-dire de l’extrait évaporé sous vide, a été réalisée par UHPLC-HRMS, révélant la présence de 45 composés, principalement des glycosides de flavonols et de flavones, notamment des dérivés de la quercétine et du kaempférol.

L’extrait éthanolique d’A. vulgaris obtenu sans solvant a été utilisé pour la préparation d’une solution mère dans du DMSO pur (100 %) afin d’atteindre la concentration de 200 mg/mL. Les solutions de travail ont été préparées à partir de la solution mère par dissolution supplémentaire dans le milieu de culture. La concentration la plus élevée de DMSO dans les solutions de travail n’a pas dépassé 0,1 % pour les expériences in vitro et 4 % pour les expériences in vivo.

2.2 Animaux

Des souris femelles C57BL/6 âgées de six à huit semaines ont été obtenues auprès de l’animalerie de l’Institut de recherche biologique « Siniša Stanković » - Institut national de la République de Serbie, Université de Belgrade (Belgrade, Serbie). Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions de laboratoire standard (non spécifiques, exemptes d’agents pathogènes), avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Le protocole d’étude et la manipulation des animaux étaient conformes aux règles de l’Union européenne et approuvés par le comité institutionnel local de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) et les lignes directrices de la Communauté européenne (directive UE 2010/63/UE pour les expériences animales). Les protocoles expérimentaux ont été approuvés et autorisés par le comité national d’agrément du Département du bien-être animal, Direction vétérinaire, Ministère de l’Agriculture, des Forêts et de la Gestion de l’eau de la République de Serbie (permission No. 323-07-12008/2020-05).

2.3 Essais colorimétriques de viabilité cellulaire (MTT et SRB)

Afin d’évaluer l’effet de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris L. sur la viabilité des cellules tumorales, les essais SRB et MTT ont été utilisés. Les cellules B16F1, B16F10, 518A2, Fem-X, NIH/3T3 et HaCaT ont été ensemencées pendant la nuit et exposées à une large gamme de concentrations (3,13–200 µg/mL) d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h.

Ensuite, pour l’essai SRB, les cellules ont été fixées à l’aide de 10 % de TCA pendant 2 h à 4 °C. Après lavage à l’eau distillée, les cellules ont été colorées pendant 30 min à température ambiante (TA) avec une solution de SRB à 0,4 %. Enfin, les cellules ont été lavées avec de l’acide acétique à 1 % et séchées pendant la nuit. Le colorant a été dissous dans un tampon TRIS 10 mM. Après 20 min d’incubation à TA, l’absorbance a été mesurée à 540 nm avec une longueur d’onde de référence à 670 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage des cellules non traitées (contrôle) et toutes les expériences ont été répétées en triplicat.

Alternativement, à la fin du traitement, les cellules ont été incubées avec une solution de MTT (0,5 mg/mL) pendant 90 min et les cristaux de formazan formés ont été dissous par l’ajout de DMSO dans la culture cellulaire. L’absorbance a été mesurée avec un lecteur automatisé de microplaques à 540/670 nm tandis que les résultats ont été exprimés en pourcentage des cellules non traitées (contrôle). Toutes les expériences ont été répétées trois fois.

Pour estimer si la production de ROS/RNS sous-tend l’action tumoricide potentielle de l’extrait d’A. vulgaris, un traitement concomitant par l’extrait d’A. vulgaris et les antioxydants GSH ou NAC a été réalisé. Les cellules B16F1 et B16F10 ont été exposées à une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris en parallèle avec 0,8 mM de GSH ou 1,25 mM de NAC, et la viabilité cellulaire a été évaluée après 72 h à l’aide des essais MTT et SRB.

2.4 Détection de l’apoptose, activation des caspases et autophagie

Les cellules B16F1 et B16F10 ont été ensemencées pendant la nuit et exposées à une dose IC50 (40 µg/mL et 80 µg/mL, respectivement) d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h.

Pour la détection de la mort cellulaire apoptotique, les cellules de mélanome (B16F1 et B16F10) ont été colorées avec (15 μg/mL) d’annexine V-FITC et (15 μg/mL) de PI pendant 15 min à TA, à l’abri de la lumière. Enfin, les cellules ont été remises en suspension dans un tampon de liaison de l’AnnV (ABB) et analysées par cytométrie en flux à l’aide de CyFlow® Space (Partec, Münster, Allemagne). La coloration Apostat a été utilisée pour la détection de l’activité totale des caspases et, après le traitement, les cellules ont été lavées, trypsinisées et incubées avec 0,5 µg/mL d’inhibiteur pan-caspase Apostat pendant 30 min à 37 °C selon les instructions du fabricant. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS, remises en suspension et analysées comme décrit ci-dessus. Pour évaluer la présence d’autophagie, deux protocoles de coloration ont été appliqués, l’acridine orange (AO) supravitale et LysoTracker Red (Waltham, MA, États-Unis). Selon le pH, l’AO s’accumule dans les organites acides (autolysosomes), où elle est protonée et piégée, formant des agrégats qui fluorescent en rouge vif. De même, LysoTracker marquait sélectivement les autophagosomes et les compartiments endo/lysosomaux acides. Les cellules ont été colorées avec le colorant AO (10 μM) pendant 15 min à 37 °C, lavées et remises en suspension dans du PBS avant l’analyse. Alternativement, les cellules B16F1 ont été colorées avec LysoTracker Red (50 nM) pendant 30 min à 37 °C. Après la période d’incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS, remises en suspension et analysées par cytométrie en flux. Afin de préciser le rôle de l’autophagie détectée (cytoprotectrice vs cytodestructrice), un traitement combiné par l’extrait d’A. vulgaris et l’inhibiteur de l’autophagie 3-MA a été réalisé. Les cellules B16F1 ont été exposées à une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris en présence/absence d’une concentration de 1 mM de 3-MA pendant 72 h et la viabilité cellulaire a été évaluée avec l’essai SRB.

2.5 Mesure de la génération d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS)

Avant l’ensemencement, les cellules de mélanome (B16F1 et B16F10) ont été colorées avec le colorant sensible à l’oxydoréduction DHR 123 pendant 20 min (1 µM) à 37 °C et traitées avec une dose IC50 (40 µg/mL pour B16F1 et 80 µg/mL pour B16F10) d’extrait d’A. vulgaris. Après 72 h, les cellules ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et analysées par cytométrie en flux (CyFlow® Space (Partec, Münster, Allemagne)).

Pour estimer si la production de ROS/RNS sous-tend l’action antitumorale potentielle de l’extrait d’A. vulgaris, les cellules de mélanome (B16F1 et B16F10) colorées avec DHR 123 ont été exposées à la dose IC50 (40 µg/mL pour B16F1 et 80 µg/mL pour B16F10) d’extrait d’A. vulgaris seul ou en combinaison avec GSH (0,8 mM) ou NAC (1,25 mM). Après 72 h, les cellules ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et analysées comme mentionné ci-dessus.

2.6 Détection de la prolifération cellulaire

Pour la détection de la prolifération cellulaire, les cellules de mélanome (B16F1 et B16F10) ont été précolorées avec une solution de CFSE à 1 μM pendant 10 min à 37 °C. Après incubation, les cellules ont été lavées, ensemencées, puis exposées à une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris (40 µg/mL pour B16F1 et 80 µg/mL pour B16F10). Après 72 h, les cellules ont été lavées, trypsinisées, dissoutes dans du PBS et analysées par cytométrie en flux (CyFlow® Space (Partec, Münster, Allemagne)).

2.7 Détermination de la sénescence

Les cellules B16F1 ont été cultivées dans des plaques à 6 puits et traitées avec une dose IC50 (40 µg/mL) d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et incubées avec 1 mM de FDG à 37 °C pendant 1–2 min. La réaction a été arrêtée par l’ajout de 900 µL de milieu RPMI glacé. Les cellules ont été analysées dans l’heure suivant la coloration par cytométrie en flux (CyFlow® Space (Partec, Münster, Allemagne)).

2.8 Analyse du cycle cellulaire

Afin d’évaluer la distribution des cellules B16F1 et B16F10 dans les phases du cycle cellulaire, les cellules ont été cultivées dans des plaques à 6 puits pendant la nuit et traitées avec la concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et fixées dans de l’éthanol à 70 % glacé pendant la nuit à 4 °C. Enfin, les cellules ont été lavées dans du PBS glacé et incubées avec 10 µg/mL de PI et 0,1 mg/mL de RNase pendant 45 min à 37 °C. Après la période d’incubation, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (cytomètre en flux CytoFLEX, Beckman Coulter, Life Sciences, Indianapolis, IN, États-Unis).

2.9 Coloration PI sur lames de chambre

Pour l’évaluation des signes morphologiques d’apoptose, les cellules B16F1 et B16F10 ont été ensemencées pendant la nuit sur des lames de chambre. Ensuite, les cellules ont été traitées avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. À la fin de l’incubation, les cellules ont ensuite été fixées avec 4 % de PFA pendant 15 min à TA, puis colorées avec une solution de PI 50 μg/mL, 0,1 mM EDTA pH 8,0, 0,1 % Triton X-100 et 85 μg/mL de RNase dans du PBS pendant 1,5 min. Entre toutes les étapes, les cellules ont été lavées plusieurs fois dans du PBS. À la fin, un milieu de montage fluorescent a été ajouté et l’analyse a été menée à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) à un grossissement de 400×.

2.10 Induction du mélanome solide et traitement expérimental

Les tumeurs ont été induites par implantation sous-cutanée (s.c.) de 1,8 × 10^5 cellules B16F1 ou 2 × 10^5 cellules B16F10 dans la région lombo-sacrée dorsale droite de souris femelles C57BL/6 syngéniques. Le traitement avec 50 mg/kg d’extrait d’A. vulgaris dans 4 % DMSO/PBS (i.p.) a commencé lorsque les tumeurs sont devenues palpables. Le traitement a été appliqué pendant 5 jours consécutifs avec une pause de 2 jours entre les cycles. Le groupe témoin a reçu le solvant selon le même régime. Les souris ont été sacrifiées lorsque le volume tumoral a atteint la valeur maximale autorisée chez les animaux témoins. La taille tumorale a été mesurée à l’aide d’un pied à coulisse et le volume a été calculé avec la formule : (longueur × largeur^2) × 0,52.

2.11 Histopathologie

Les tumeurs, les reins et les foies des animaux sacrifiés ont été examinés macroscopiquement et fixés dans du formol tamponné à 10 % de pH neutre pendant 24 h. Les tissus ont été sectionnés à travers le plus grand plan tissulaire et fixés en plus pendant 24 h. Le traitement des tissus a été réalisé dans un automate de traitement tissulaire (Milestone SRL LOGOS ONE, Sorisole, BG, Italie). Le tissu a ensuite été inclus dans des blocs de paraffine sur la console d’inclusion (SAKURA Tissue-Tek TEC 5, Sakura Finetek, CA, États-Unis). Des coupes tissulaires (4 µm) ont été colorées par hématoxyline et éosine et analysées au microscope Olympus BX43 (OLYMPUS EUROPA HOLDING GMBH, Hambourg, Allemagne). La numérisation de toutes les lames a en outre été effectuée avec un scanner de lames Leica Aperio AT2 (Leica Biosystems, GmbH, Nussloch, Allemagne) à des fins d’analyse et de documentation. Les lames virtuelles générées à partir du Leica Aperio AT2 ont été analysées morphométriquement avec Leica AperioImageScope (version 12.4.6, Leica Biosystems, GmbH, Nussloch, Allemagne) et avec le logiciel FIJI-ImageJ 1.51j8.

2.12 Détection de PCNA par immunofluorescence

Les lames de tissu tumoral B16F1 ont été déparaffinées et réhydratées avant la récupération des épitopes par chauffage au micro-ondes dans un tampon citrate. Le blocage de la liaison non spécifique a été réalisé avec 5 % de BSA à TA pendant 30 min et, ensuite, les tissus ont été incubés pendant la nuit à 4 °C avec un anticorps polyclonal de lapin anti-PCNA (eBioscience, San Diego, CA, États-Unis, 1/100). Comme anticorps secondaire, un anti-lapin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis, 1/400) a été appliqué pendant 2 h à TA. Après lavage, une contre-coloration au PI a été effectuée (1 mg/mL, pendant 5 min). À la fin, tous les échantillons ont été montés avec Fluoromounth G (Southern Biotech, Birmingham, AL, États-Unis) et examinés avec un microscope confocal SP5 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Allemagne).

2.13 Préparation des suspensions monocellulaires

Des suspensions monocellulaires de tumeurs primaires et de rates ont été obtenues comme décrit précédemment. Après isolement, les tumeurs primaires B16F1 ont été déchiquetées puis placées dans 5 mL de milieu RPMI contenant 1 mg/mL de collagénase I, 1 mM d’EDTA et 2 % de FBS afin d’effectuer une digestion enzymatique. Après incubation pendant 2 h à 37 °C, 10 mL de trypsine à 0,25 % ont été ajoutés et incubés pendant 3 min. Ensuite, les cellules ont été traitées avec une solution de DNase I pendant 1 min et filtrées à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 μm BD Biosciences (San Jose, Californie, États-Unis). Les suspensions monocellulaires provenant des rates ont été obtenues par dissociation mécanique.

2.14 Analyse par cytométrie en flux

Les suspensions monocellulaires ont été marquées avec des anticorps monoclonaux conjugués à des fluorochromes : anticorps anti-souris CD3, CD4, CD8, CD25, CD86, CD40, CD49b, PD-1, CD11c et MHC II (BD Pharmingen ; BioLegend, San Diego, CA, États-Unis ; eBiosciences, San Diego, CA, États-Unis) ou avec un contrôle apparié à l’isotype, et analysées sur un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, États-Unis) à l’aide du logiciel CELLQUEST 5.1 (BD Biosciences, San Jose, CA, États-Unis).

Pour la coloration intracellulaire, les cellules ont été stimulées avec du phorbol 12-myristate13-acétate (50 ng/mL)/ionomycine (500 ng/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) et GolgyStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, États-Unis) pendant 4 h à 37 °C, 5 % CO2, colorées avec des anticorps anti-souris marqués par fluorochrome spécifiques de CD4 ou CD8, fixées et perméabilisées avec une solution Cytofix/Cytoperm. La coloration intracellulaire a été réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux : CD107a, perforine, IFN-γ, IL-10, TNF-α et Foxp3 (BD Pharmingen ; BioLegend, San Diego, CA, États-Unis ; eBiosciences, San Diego, CA, États-Unis) ou de contrôles négatifs appropriés. Les cellules ont été analysées avec le cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, États-Unis), et l’analyse a été menée avec le logiciel FlowJo™ 10.7.2.

2.15 Analyse statistique

Pour l’évaluation de la signification statistique entre les groupes et pour des analyses supplémentaires des données, le package Statistica 12 (Informer Technologies, Inc., Los Angeles, CA, États-Unis) a été utilisé et des valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives. Le test non paramétrique de Mann-Whitney a été utilisé pour l’analyse des résultats in vivo.

3 Résultats

3.1 L’extrait éthanolique d’A. vulgaris régule à la baisse la viabilité des cellules de mélanome et supprime la croissance des cellules tumorales dans les deux modèles syngéniques de tumeur primaire, de bas et de haut grade

Le potentiel antimélanome de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris a été testé dans deux lignées cellulaires de mélanome B16 de potentiel invasif différent (F1 et F10), et deux lignées cellulaires de mélanome humain (518A2 et Fem-X), et la viabilité cellulaire a été déterminée après 72 h à l’aide des essais MTT et SRB. Comme présenté dans [ ], l’extrait d’A. vulgaris a diminué le nombre de cellules viables dans toutes les cultures cellulaires de manière dose-dépendante, avec un effet légèrement plus profond obtenu par les mesures MTT que par les mesures SRB. L’évaluation visuelle des cultures exposées à l’extrait a révélé que les valeurs obtenues par SRB reflétaient plus précisément le nombre de cellules viables, indiquant que la respiration cellulaire avant la viabilité est affectée par le traitement ; ainsi, les valeurs IC50 calculées à partir de SRB ont été sélectionnées comme plus appropriées pour une investigation ultérieure ([ ]). Comme attendu d’après leur phénotype plus agressif, B16F10 a montré une sensibilité plus faible au traitement appliqué par comparaison avec sa contrepartie F1. En outre, la viabilité cellulaire des cellules primaires d’exsudat péritonéal, ainsi que des fibroblastes embryonnaires murins (NIH/3T3) et des kératinocytes humains immortalisés (HaCaT), a été préservée après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris ([ ]), indiquant la sélectivité du traitement envers le phénotype malin.

Compte tenu de toutes les limites du cadre in vitro dans l’évaluation du potentiel de composés/mélanges séparés ou d’extraits à limiter la croissance des cellules cancéreuses, l’efficacité d’A. vulgaris a ensuite été explorée en utilisant les deux modèles syngéniques de mélanomes solides primaires peu et très agressifs induits par inoculation s.c. de cellules B16F1 et B16F10, respectivement. Cette approche permet l’examen du potentiel suppresseur de tumeur des extraits à partir d’une plateforme qui, contrairement aux études in vitro, mais aussi au modèle animal de xénogreffe, inclut le microenvironnement tumoral pleinement préservé avec tous les aspects impliqués dans l’interaction tumeur/hôte, ce qui la rend la plus semblable à la maladie humaine. Les animaux ont été traités quotidiennement avec 50 mg/kg d’extrait d’A. vulgaris et, après 22 jours, le volume tumoral a été estimé. Comme montré dans [ ], l’extrait d’A. vulgaris a significativement diminué le volume tumoral dans les deux modèles tumoraux, malgré les différences initiales de phénotype cellulaire et, par conséquent, de consistance et d’invasivité de la tumeur primaire. De façon surprenante et à l’opposé des données obtenues in vitro, l’effet était encore plus notable dans le modèle B16F10 hautement invasif (B16F1 p = 0,004 ; B16F10 p = 0,000491), soulignant le rôle commun des facteurs microenvironnementaux dans la réponse au traitement et mettant en évidence les aperçus limités qui proviennent de la recherche in vitro.

3.2 L’extrait d’A. vulgaris manifeste un mode d’action dissemblable dans des lignées cellulaires de mélanome B16 de grades différents in vitro

L’analyse par cytométrie en flux du taux de prolifération et de la présence/des caractéristiques de différents types de mort cellulaire dans les cultures B16F1 et B16F10 exposées aux concentrations IC50 d’A. vulgaris in vitro a révélé des différences significatives entre la génération F1 et F10 en réponse au traitement, qui peuvent être attribuées aux changements phénotypiques obtenus au cours du processus de progression tumorale. Pour estimer la division cellulaire en réponse au traitement, les cellules B16F1 et B16F10 ont été colorées avec le colorant spécifique CFSE, puis exposées à une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Les résultats obtenus ont montré que l’extrait d’A. vulgaris augmentait le pourcentage de cellules non divisées dans les deux lignées cellulaires, avec un effet plus profond sur la forme moins invasive ([ ]). En parallèle, un arrêt significatif en phase S du cycle cellulaire a été détecté dans les deux lignées cellulaires testées, tandis que la tendance à l’accumulation de cellules hypodiploïdes n’était visible que dans les cultures B16F10 exposées au traitement ([ ]). En conséquence, la double coloration Ann/PI a révélé que l’extrait d’A. vulgaris entraînait une mort cellulaire apoptotique des cellules F10 hautement invasives, avec principalement une accumulation de cellules apoptotiques tardives après 72 h, reconnue par le profil Ann+/PI+ ([ ]). L’illustration de l’effet mentionné était évidente en microscopie à fluorescence, où une forme nucléaire irrégulière, des noyaux rétractés, des corps apoptotiques et des micronoyaux sporadiques ont été détectés ([ ]). Néanmoins, malgré une apoptose intense, l’activation des caspases n’a pas été observée ([ ]). À l’opposé de la sensibilité plus élevée de B16F1 vs B16F10 in vitro, l’absence de cellules apoptotiques précoces et tardives dans les cultures B16F1 après 72 h de traitement par l’extrait d’A. vulgaris a été notée ([ ]). L’analyse microscopique de la morphologie nucléaire a découvert la présence de noyaux grands et allongés qui, avec la densité cellulaire B16F1 diminuée, étaient en accord avec les déclarations précédentes concernant l’absence d’apoptose ([ ]). D’autre part, une autophagie intense, mesurée par coloration AO et LysoTracker Red, a été notée seulement dans les cultures de cellules B16F1 ([ ]) mais pas B16F10. Puisque l’autophagie possède un double rôle et peut s’opposer à la cytotoxicité du traitement ou la médiatiser, afin de préciser sa contribution à l’efficacité du médicament, la 3-MA, un inhibiteur spécifique de l’autophagie, a été appliquée. En effet, la 3-MA bloque la formation des autophagosomes et conduit ainsi à l’échec du processus autophagique. L’inhibition du processus autophagique à l’aide de cet inhibiteur a confirmé l’implication du processus autophagique dans la diminution de viabilité déclenchée par l’extrait végétal testé ([ ]). En outre, une sénescence cellulaire modérée déterminée par coloration FDG dans la fraction de cellules vitales ([ ]) pourrait expliquer davantage le bon effet de l’extrait dans la culture cellulaire B16F1. Tous les effets observés étaient corrélés à une production accrue de ROS/RNS déterminée par coloration DHR, avec un effet plus notable dans le clone invasif ([ ]). Afin d’évaluer si la production intensifiée de ROS/RNS était responsable de l’action antitumorale de l’extrait d’A. vulgaris, ils ont été éliminés par des antioxydants, GSH ou NAC. La N-acétylcystéine fournit un apport de cystéine nécessaire à la synthèse et à la reconstitution du GSH. Les résultats obtenus ont montré que le traitement concomitant par l’extrait d’A. vulgaris avec GSH ou NAC restaurait significativement la viabilité des cellules B16F1 et B16F10, par comparaison avec les cellules exposées à la dose IC50 d’A. vulgaris seule ([ ]). En outre, l’analyse par cytométrie en flux a révélé que la quantité de ROS/RNS déclenchée par l’extrait testé était remarquablement réduite en présence de GSH ou de NAC, confirmant leur importance en tant que médiateurs de l’action tumoricide de l’extrait ([ ]).

3.3 L’extrait d’A. vulgaris a favorisé la rétraction tumorale dans les deux modèles syngéniques peu et très agressifs par des voies étonnamment différentes par comparaison avec celles déterminées in vitro

L’analyse histopathologique du tissu tumoral a montré une étendue plus élevée de nécrose dans les sections obtenues à partir du modèle B16F10 traité avec l’extrait d’A. vulgaris par comparaison avec le groupe témoin (34,8 ± 16,5 % et 20,4 ± 10,2 %, respectivement) ([ ]). D’autre part, bien que le volume des tumeurs ait également été significativement réduit dans le modèle B16F1, le degré de nécrose était de manière inattendue plus élevé dans les échantillons témoins que dans le groupe traité (37,3 ± 15,9 % et 23 ± 7,7 %, respectivement), ce qui indiquait que les composés de l’extrait, contrairement au modèle tumoral B16F10, ne réduisaient pas la taille tumorale par induction de nécrose ([ ]). Toutefois, l’expression de l’antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA), en tant qu’indicateur du taux de mitose cellulaire, était significativement régulée à la baisse dans ces tumeurs après le traitement des animaux avec l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). Plus important encore, outre le fait que l’extrait végétal testé n’a pas favorisé l’apoptose dans B16F1 in vitro, dans les sections tumorales, des zones de mort cellulaire ressemblant à des champs apoptotiques étaient évidentes, expliquant en outre le volume tumoral rétracté dans le modèle de mélanome solide de grade inférieur ([ ]). En effet, une forme et une taille irrégulières des noyaux, ainsi qu’une condensation de la chromatine, ont été observées dans tous les échantillons tissulaires d’animaux traités avec l’extrait d’A. vulgaris.

3.4 L’extrait d’A. vulgaris améliore la réponse immunitaire antitumorale dans un modèle de mélanome solide B16F1

Récemment, il a été rapporté qu’outre l’instabilité génétique accrue dans les lésions précancéreuses et cancéreuses, les tumeurs montraient une tendance à diminuer l’hétérogénéité dans les formes de haut grade par l’établissement d’un réseau multicellulaire bien fonctionnel, hautement autonome et faiblement immunogène. En conséquence, dans les stades de grade inférieur, le système immunitaire passe de la voie pro-inflammatoire à l’établissement d’un environnement protumorigène immunosuppresseur. La présence de cellules nécrotiques, nécroptotiques et apoptotiques dans le tissu tumoral peut conduire à un profilage des cellules immunitaires protumorigène par différentes voies. Alors que les cellules apoptotiques favorisaient l’établissement d’un milieu anti-inflammatoire, les cellules nécrotiques libéraient différentes molécules dans le microenvironnement tumoral désactivant la réponse immunitaire antitumorale. Pour cette raison, il était difficile d’étudier le potentiel de l’extrait testé à restaurer l’immunité protectrice de l’hôte contre la tumeur et à réaliser une percée dans le microenvironnement tumoral immunosuppresseur, en dehors de son effet direct sur les cellules malignes.

Une augmentation significative du pourcentage de cellules dendritiques (DCs) CD11c+ exprimant MHC II ([ ]) et la molécule costimulatrice CD86 ([ ]) dans la rate des souris porteuses de mélanome B16F1 après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris a été observée. Bien que l’analyse de la sous-population fonctionnelle de cellules T n’ait pas révélé de différence dans le pourcentage de cellules CD3+ CD8+ entre les groupes examinés ([ ]), dans la rate des souris porteuses de tumeur traitées avec l’extrait d’A. vulgaris, le pourcentage de cellules T CD8+ exprimant PD-1 était significativement diminué ([ ]). En outre, le pourcentage de cellules T CD3+ CD8+ productrices de perforine était augmenté ([ ]). En ce qui concerne les cellules Th, les pourcentages de cellules T spléniques CD3+ CD4+ ne différaient pas entre les groupes ([ ]). Toutefois, un pourcentage significativement plus élevé de cellules CD4+ productrices d’interféron-gamma (IFN-γ) ([ ]) et un pourcentage plus faible de cellules CD4+ productrices d’interleukine-10 (IL-10) ([ ]) dérivées de la rate de souris porteuses de tumeur traitées avec l’extrait d’A. vulgaris ont été trouvés. Fait important, l’extrait d’A. vulgaris a remarquablement diminué le pourcentage de cellules T régulatrices (Tregs) CD3+ CD25+ Foxp3+ dans les rates des souris porteuses de tumeur ([ ]).

Des résultats similaires ont été observés dans l’analyse des leucocytes infiltrant la tumeur (TILs). L’extrait d’A. vulgaris a augmenté le pourcentage de DCs CD11c+ totales ([ ]) ainsi que de celles exprimant CD40 au sein de cette population ([ ]). Le même traitement a augmenté le pourcentage de cellules T CD3+ CD8+ ([ ]) dans les tumeurs primaires. De plus, des augmentations du pourcentage de cellules CD107a+ ([ ]), ainsi que de cellules T CD8+ productrices de perforine ([ ]), dans les tumeurs primaires dérivées de souris traitées avec l’extrait d’A. vulgaris, ont été détectées. Le pourcentage de cellules T CD3+ CD4+ dans le microenvironnement tumoral était significativement augmenté après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). Les analyses du phénotype fonctionnel des cellules T CD3+ CD4+ ont révélé une augmentation du pourcentage de cellules productrices du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) ([ ]) et une diminution des cellules CD4+ productrices d’IL-10 ([ ]), après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris. Enfin, le même traitement a abrogé le pourcentage de Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ dans la tumeur ([ ]), ouvrant l’espace pour le rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale active.

3.5 L’extrait d’A. vulgaris a réalisé un fort effet antitumoral dans les deux modèles de mélanome sans toxicité systémique remarquable

Outre le potentiel antitumoral évident d’A. vulgaris dans les deux formes de mélanome solide, réalisé par l’interaction entre l’effet direct contre les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral, son influence sur les tissus sains, en particulier ceux impliqués dans le métabolisme et la clairance, peut être d’une importance majeure pour l’issue du traitement. À cette fin, en plus du tissu tumoral, les changements histopathologiques dans le rein ([ ]) et le foie ([ ]) ont été estimés microscopiquement. Des changements discrets et non significatifs ont été observés dans les échantillons collectés chez les animaux exposés au traitement. Seuls quelques rares infiltrats interstitiels mononucléés et une dilatation des veinules corticales dans les échantillons de tissu rénal, ainsi que de rares tubules avec cylindres protéiques, ont été identifiés. L’analyse de la dilatation des veinules portales, de la vacuolisation des hépatocytes périportaux, de rares foyers d’hématopoïèse extramédullaire et de zones d’infiltration de cellules mononucléées n’a révélé aucune différence significative entre les groupes. Ces résultats ont présenté la première ligne de preuves soutenant l’hypothèse selon laquelle l’extrait testé n’a pas favorisé de toxicité significative et sont en concordance avec les données obtenues à partir de l’évaluation des paramètres urinaires chez les animaux exposés au traitement ([ ]). Pris ensemble, l’extrait d’A. vulgaris a réalisé un fort effet antitumoral dans les deux modèles de mélanome sans toxicité systémique évidente.

4 Discussion

Notre étude précédente a montré que l’extrait éthanolique d’A. vulgaris est riche en composés phénoliques et présente un fort potentiel anticancéreux. Alors que de nombreuses études ont exploré l’activité biologique de molécules isolées, il est apparent que leurs interactions exercent des effets divers. Ces interactions peuvent non seulement affecter les cellules tumorales, mais aussi influencer d’autres composants du microenvironnement tumoral, notamment les cellules immunitaires et stromales, les vaisseaux sanguins, etc. La synergie bien exprimée entre les composés bioactifs aboutit souvent à des extraits bruts présentant des effets biologiques plus élevés que leurs composants individuels. Cependant, l’obstacle sérieux à l’application des extraits bruts est l’inconstance de leur composition en raison des variations géographiques et saisonnières, entraînant une faible reproductibilité des données obtenues. Cela crée des difficultés dans la standardisation de l’extrait et la fabrication à grande échelle, représentant des barrières insurmontables pour une éventuelle utilisation en pratique clinique. D’autre part, la corrélation entre contenu et activité biologique peut donner un aperçu précieux de l’interaction de composés avec différents mécanismes anticancéreux et de la manière dont ils contribuent aux effets observés. L’exemple d’agents qui ont été inclus dans la pratique clinique, les soi-disant alcaloïdes de la pervenche, vinblastine (VLB) et vincristine (VCL), ont été isolés de la plante pervenche (Catharanthus roseus (L.) G. Don. (Apocynaceae)). Il a été observé que l’extrait de cette plante réduit le nombre de globules blancs ainsi que le nombre de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse des rats, et plus tard l’activité contre la leucémie lymphocytaire chez les souris a également été déterminée. Ces études ont conduit à l’isolement de VLB et de VCL comme composants actifs, et leur découverte peut être indirectement attribuée à la recherche originale sur l’activité de cet extrait végétal. Compte tenu de la riche histoire ethnomédicinale de l’extrait d’A. vulgaris, il est intriguant d’explorer l’impact d’un mélange de composés bioactifs lorsqu’ils sont appliqués dans un rapport bien défini équilibré par la nature. Notre objectif était de valider ces données ethnopharmacologiques, qui peuvent servir de point initial pour d’autres analyses complètes. Les résultats collectés peuvent servir de base à la conception de protocoles combinés où l’utilisation de différents composants isolés peut aider à surmonter la résistance thérapeutique.

Contrairement à la qualification antérieure des tumeurs comme maladies au comportement aléatoire, nous sommes aujourd’hui confrontés à la stratégie encore inexplicable des communications intra- et extra-tumorales menées par une orchestration multicellulaire parfaite, dont la complexité n’a été qu’« effleurée » au cours des dernières années de recherche. Depuis cette plateforme, la réponse limitée des tumeurs de haut grade au traitement n’est pas seulement une conséquence de l’établissement d’un phénotype résistant à l’apoptose, mais aussi d’une communication intercellulaire dans le microenvironnement conduisant à la progression tumorale. L’effet net de ces interactions se reflète dans la résistance thérapeutique initiale ou acquise, aboutissant à la progression tumorale et à la repopulation après le traitement.

Cependant, il existe de sérieuses déficiences dans les conclusions qui découlent des expériences réalisées en culture cellulaire, liées à un système trop simplifié et à l’absence de la complexité des maladies néoplasiques lorsqu’elles sont jugées dans le contexte du microenvironnement tumoral et de l’influence sur les tissus affectés par la maladie. Le problème des déficiences n’est pas complètement résolu par les modèles in vivo, qu’il s’agisse d’un modèle syngénique, d’une xénogreffe ou d’une xénogreffe dérivée de patient, puisque chacun d’eux possède ses propres imperfections. Pour explorer le potentiel antimélanome de l’extrait d’A. vulgaris dans le contexte mentionné ci-dessus, ses effets ont été évalués dans cette étude in vitro et in vivo, en utilisant des modèles syngéniques de mélanome de formes moins et plus invasives. Cela nous a permis d’obtenir un aperçu des différences majeures de réponse au traitement appliqué de la tumeur primaire de mélanome selon le grade et, par conséquent, l’agressivité, dans le contexte d’un système immunitaire préservé qui n’existe que dans les modèles syngéniques. La sensibilité observée in vitro lorsque les cellules F1 et F10 étaient exposées à l’extrait d’A. vulgaris était hautement reproductible in vivo, mesurée par une réduction notable du volume tumoral dans les deux tumeurs primaires, mais avec une différence remarquable. Alors que la réponse in vitro du clone F1 à l’extrait d’A. vulgaris était significativement plus élevée par comparaison avec F10, comme attendu compte tenu de la souche du dernier, le traitement in vivo a abouti à une rétraction tumorale évidente dans les deux modèles, mais avec un effet plus marqué dans la forme F10 de haut grade. Cette observation souligne la spécificité de l’extrait d’alchémille commune à exercer un effet antitumoral encore plus profond dans l’état de haut grade de la maladie, mais seulement lorsqu’il est évalué in vivo, indiquant l’importance de tous les constituants du tissu tumoral et de ses caractéristiques. L’évaluation histopathologique des tumeurs dans les deux modèles a révélé que le traitement par A. vulgaris conduisait à une nécrose accrue dans les tumeurs avancées, tandis que cet effet n’était pas présent dans le modèle tumoral induit par inoculation sous-cutanée de la génération F1 de cellules B16. D’autre part, dans le tissu tumoral, de grandes surfaces apoptotiques et un indice mitotique significativement réduit dans la zone environnante ont été trouvés. L’évaluation cytofluorimétrique en flux des cellules B16F1 et B16F10 exposées in vitro à l’extrait d’A. vulgaris a révélé des déviations significatives par rapport aux données in vivo. En dehors d’une diminution bien synchronisée de la prolifération in vitro et in vivo, l’absence complète d’apoptose était évidente dans les cultures B16F1 in vitro, tandis que dans les échantillons tissulaires de grandes zones de type apoptotique déclenchées par le traitement étaient évidentes. La nécrose significative favorisée par l’extrait d’A. vulgaris dans les échantillons obtenus à partir du modèle B16F10 était en divergence avec la mort cellulaire apoptotique dominante déterminée in vitro dans la culture cellulaire exposée à l’extrait. Contrairement à la culture cellulaire, dans le tissu, les cellules apoptotiques sont éliminées par phagocytose d’une manière immunosuppressive. En outre, l’apoptose massive dans le tissu tumoral, qui présentait fondamentalement un objectif majeur de la radio- ou chimiothérapie appliquée, si elle n’est pas équilibrée avec d’autres signaux pouvant limiter les stimuli anti-inflammatoires et mitogènes délivrés par la communication intercellulaire directe et indirecte dans les zones riches en apoptose, favorise la progression tumorale, l’échappement immunitaire et la repopulation en réponse à la chimio- ou radiothérapie. En partie pour cette raison, l’impression générale est que les extraits de plantes, à l’opposé des effets bien définis des chimiothérapies non sélectives, affectent le microenvironnement tumoral à de multiples niveaux compte tenu du contenu en composés synergiquement actifs. Cela ouvre la possibilité d’influencer la croissance des cellules tumorales, mais en parallèle prépare le tissu tumoral à une réponse protectrice de l’hôte contre les phénotypes malins.

Récemment, il a été rapporté que l’instabilité génétique et l’hétérogénéité tumorale augmentent dans les lésions précancéreuses et cancéreuses mais diminuent avec le grade tumoral, indiquant que la période clé pour la réponse immunitaire ainsi que pour l’échappement immunitaire et l’établissement d’un environnement immunosuppresseur est définie à la phase de grade inférieur. Cela indique en outre le fait qu’à ce stade de la maladie, l’activité de la réponse immunitaire et, par conséquent, l’évolution ultérieure de la maladie peuvent être influencées par le traitement avec un extrait de plante comme l’est A. vulgaris. De manière concordante, l’évaluation du microenvironnement tumoral et de la composition cellulaire de la rate a montré que l’extrait d’A. vulgaris conduisait à un retournement et au rétablissement des activités antitumorales des cellules immunitaires. Les DCs matures sont les cellules les plus importantes dans l’initiation et la régulation des réponses immunitaires acquises aux tumeurs en croissance et, en parallèle, l’une des cibles communes des activités immunosuppressives des cellules tumorales. Une immunogénicité diminuée se produit en raison du manque de stimulation des cellules T, de la perte d’expression de MHC de classe I, d’une présentation antigénique inadéquate de CD4+ aux cellules auxiliaires, ainsi que de la production de facteurs immunosuppresseurs. Les DCs exposées à l’extrait d’A. vulgaris commencent à exprimer significativement plus de MHC II et de molécules costimulatrices CD86 de façon systémique, et expriment plus de ligand CD40 localement, devenant ainsi compétentes pour présenter correctement les antigènes tumoraux et activer la réponse des cellules T.

Bien qu’il ait été montré que les cellules T CD4+ spécifiques des antigènes tumoraux peuvent médier l’élimination des cellules tumorales même en l’absence d’expression endogène de MHC de classe II sur les cellules tumorales, la présence de DCs matures puissantes est extrêmement importante pour leur activation. Après activation, les cellules T CD4+ se différencient en cellules de type Th1 produisant des niveaux élevés de cytokines Th1, ce qui s’est révélé être un médiateur majeur dans le contrôle tumoral. Les résultats présentés dans cette étude ont montré que les cellules T CD4+ activées se différencient dans la direction Th1 et produisent davantage d’IFN-γ dans la rate en raison du traitement par l’extrait d’A. vulgaris. L’IFN-γ peut interagir directement avec les cellules tumorales, ou promouvoir indirectement la différenciation des effecteurs CTL. Simultanément, l’IFN-γ peut faciliter l’entrée des CTLs dans le site effecteur. Une accumulation accrue de cellules Th CD4+ productrices de TNF-α dans le microenvironnement tumoral a également été observée chez les souris après traitement. Il est possible que le TNF-α augmente la susceptibilité des cellules cibles à la cytolyse dépendante des cellules T et contribue ainsi à la mort des cellules cibles et l’accélère. En accord avec nos résultats, la production de TNF-α est essentielle pour l’élimination du mélanome par les cellules Th1. Outre l’effet stimulateur de l’extrait d’A. vulgaris sur la maturation des DCs et la différenciation des cellules Th1, la diminution de l’accumulation de cellules Th productrices d’IL-10 immunosuppressives et de Tregs dans la rate et la tumeur primaire a été détectée. Cet effet contribue grandement à une réponse immunitaire et à une suppression plus réussie de la croissance tumorale. Il est connu que les cellules Treg jouent un rôle crucial dans l’immunosuppression par inhibition de la réponse des cellules T spécifiques de la tumeur, tandis que leur infiltration dans la tumeur est fortement associée à la tumorigenèse. Fait important, le ratio cellules T CD8+ cytotoxiques versus cellules T régulatrices CD4+ Foxp3+ peut avoir une valeur prédictive pour l’issue du mélanome.

Un composant important de l’immunosuppression et de la tolérance des cellules immunitaires aux cellules tumorales est étroitement connecté à la voie de signalisation programmed death ligand-1/programmed death-1 (PD-L1/PD-1). Bien que les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) puissent reconnaître les antigènes associés aux tumeurs exprimés sur les cellules tumorales, ils ne sont généralement pas capables d’induire une réponse immunitaire productive en raison de la signalisation négative médiée par PD-1 via l’immunoreceptor tyrosine switch (ITSM). Les DCs, en tant que cellules présentatrices d’antigènes puissantes, activent les cellules T CD8+. Cette étude a montré que l’extrait d’A. vulgaris augmente significativement l’accumulation de lymphocytes cytotoxiques dans le microenvironnement tumoral avec un pourcentage réduit de ceux exprimant la molécule inhibitrice PD-1 à leur surface. CD107a (également connu sous le nom de LAMP-1) est un marqueur substitut de l’activité cytotoxique exprimé par les cellules T cytotoxiques, les cellules natural killer (NK) et les cellules T γδ, qui apparaît à la surface cellulaire dans un court intervalle de temps après la dégranulation. L’expression de CD107a est étroitement liée à l’expression d’IFN-γ et de TNF-α et à la cytotoxicité des cellules T. En concordance avec l’expression diminuée de PD-1, l’expression accrue des marqueurs d’activité cytotoxique, CD107a et perforine, dans les cellules T CD8+ dérivées de la rate et de la tumeur primaire déclenchée par le traitement par l’extrait soutient fortement l’hypothèse du rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale réussie.

Il semble que les composés bioactifs d’A. vulgaris facilitent la maturation des DCs et la différenciation subséquente des Th1 et des CTL. En bref, le traitement par l’extrait soutient l’immunité antitumorale d’au moins deux manières. Les cellules Th productrices de TNF-α et les cellules T CD8+ tumoricides migrent vers le site tumoral, contactent les cellules tumorales et libèrent de la perforine qui médie la destruction des cellules cancéreuses. En parallèle, l’accumulation inhibée de cellules immunosuppressives dans le microenvironnement tumoral facilite en outre le développement d’une puissante réponse immunitaire antitumorale. Tout ce qui précède nous conduit à la conclusion que l’extrait d’A. vulgaris module significativement la réponse immunitaire à la tumeur en faveur des lymphocytes Th1 et des médiateurs cytotoxiques, dont l’activité peut supprimer avec succès la croissance et la propagation de la tumeur.

Il existe encore des débats sur la cytotoxicité possible des composés tanniques, où les ellagitanins ont été identifiés comme constituants significatifs dans l’Alchemillae herba. Les données controversées se réfèrent principalement aux effets de toxicité ciblant le foie des extraits riches en tanins. Néanmoins, aucun effet cytotoxique sur les cellules mammaires, hépatiques et rénales causé par un extrait d’Alchemilla riche en fraction tannique n’a été observé dans nos récentes expériences ex vivo sur modèle animal. Avec le fait que le traitement est bien toléré par les tissus sains, soutenant le potentiel global de l’hôte à lutter contre la maladie, le potentiel anticancéreux de cette plante mérite une investigation préclinique supplémentaire.

5 Conclusions

Outre l’amélioration impressionnante que les thérapies ciblées et l’immunothérapie ont apportée au traitement du mélanome avancé, le succès reste limité par des mécanismes de résistance initiale ou acquise, ouvrant ainsi l’espace à des approches complémentaires ou alternatives dans le traitement des patients oncologiques. Les résultats de cette étude ont révélé des bénéfices bidimensionnels de l’application de l’extrait d’A. vulgaris dans des mélanomes de différents grades : une capacité persistante et même plus profonde à réduire les tumeurs de haut grade et, en parallèle, un fort rétablissement de l’immunité antitumorale par stimulation de la réponse immunitaire antitumorale innée et adaptative et restriction de l’environnement immunosuppresseur des tumeurs de bas grade. Globalement, il s’agit du premier rapport sur l’activité anticancéreuse de l’extrait d’A. vulgaris sur un modèle de mélanome in vivo, qui fournit des preuves de son potentiel multiniveau et de son efficacité dans le mélanome avancé, soutenant ainsi fortement l’importance de recherches supplémentaires dans ce domaine.