Caractérisation phytochimique, activité antimicrobienne et potentiel antiprolifératif in vitro de l’extrait de racine d’Alchemilla vulgaris Auct. contre les lignées cellulaires cancéreuses de la prostate (PC-3), du sein (MCF-7) et d’adénocarcinome colorectal (Caco-2)
Référence : Plants 2022. — PMC9414443 · DOI 10.3390/plants11162140 Type : étude in vitro · Plante : Alchemille commune · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Malgré l’activité biologique démontrée de l’extrait de parties aériennes d’Alchemilla vulgaris, les informations disponibles sur l’activité de l’extrait de racine sont rares. Cela nous a encouragés à entreprendre la présente investigation afin d’étudier l’activité cytotoxique de l’extrait méthanolique de racine d’A. vulgaris contre diverses lignées cellulaires cancéreuses in vitro, ainsi que son activité antimicrobienne et son criblage phytochimique. Le test MTT a été appliqué pour tester l’effet cytotoxique contre les lignées de prostate (PC-3), de sein (MCF-7) et d’adénocarcinome colorectal (Caco-2), ainsi que contre des cellules Vero normales. La cytométrie en flux a été employée pour évaluer l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose par rapport à la nécrose dans les cellules PC-3. L’expression des gènes liés à l’apoptose (BAX, BCL2 et P53) a été quantifiée par analyse qRT-PCR. Les résultats obtenus ont montré une forte activité antiproliférative sur les trois lignées cellulaires cancéreuses et les cellules Vero normales d’une manière dépendante de la dose. Un indice de sélectivité (IS) élevé a été enregistré contre les trois lignées cellulaires, les cellules PC-3 présentant l’IS le plus élevé et la CI50 la plus faible. Cet effet était associé à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et à l’induction d’une apoptose totale de 27,18 %, principalement une apoptose précoce. L’induction de l’apoptose était liée à la surexpression des gènes proapoptotiques P53 et BAX et à la sous-expression du gène antiapoptotique BCL2. De plus, l’extrait a démontré une activité antibactérienne in vitro contre Agrobacterium tumefaciens, Serratia marcescens et Acinetobacter johnsoni. De plus, il a montré une activité antifongique contre Rhizoctonia solani, Penicillium italicum et Fusarium oxysporium. Sept acides phénoliques et sept flavonoïdes ont été détectés. Les acides phénoliques prédominants étaient les acides cinnamique et caféique, tandis que l’hespéridine et la quercétine étaient les principaux flavonoïdes. Ces constatations fournissent des preuves claires de l’effet proapoptotique prometteur de l’extrait de racine d’A. vulgaris, ce qui contribue à jeter les bases d’investigations futures plus larges et approfondies.
1 Introduction
La recherche en phytomédecine a récemment démontré une bonne contribution au développement d’une thérapie multicible dirigée principalement vers la stimulation des mécanismes de défense, de protection et de réparation de l’organisme plutôt que vers la confrontation des agents dommageables. Le cancer est l’une des maladies dévastatrices les plus courantes, qui offre une bonne possibilité d’application d’une thérapie multicible utilisant des produits naturels d’origine végétale. L’alchémille (Alchemilla vulgaris Auct. syn., Alchemilla xanthochlora Rothm.) est un bon exemple d’agents thérapeutiques à base de plantes potentiels pour de nombreuses maladies. A. vulgaris appartient à la famille des Rosaceae et présente un port herbacé vivace. Elle est distribuée dans toute l’Europe, l’Asie occidentale et l’Amérique du Nord. A. vulgaris est incluse dans la pharmacopée européenne et il a été rapporté qu’elle contient divers composants phytochimiques dans les parties aériennes et racinaires, avec une variété d’activités biologiques. Les composés phénoliques sont les composés prédominants identifiés dans des études antérieures. Un nombre limité de publications est disponible dans la littérature antérieure concernant le profil phytochimique et l’activité biologique des racines d’A. vulgaris, selon Boroja et al. et Jurić et al. Leurs résultats ont montré que les extraits de racines comme de parties aériennes comprenaient une teneur élevée en composés phénoliques, en particulier en tanins condensés, notamment l’acide ellagique et la catéchine. Ces composants exerçaient des activités antioxydantes, antibactériennes, antifongiques et anti-inflammatoires. Cela a soutenu l’idée qu’A. vulgaris est une bonne source de composants antioxydants, comme l’ont rapporté Kovač et al.
L’importance des composants phénoliques est de plus en plus reconnue de nos jours à travers leur rôle important dans les processus d’oxydation. En conséquence, ils présentent plusieurs activités antimicrobiennes et anticancéreuses bénéfiques. Malgré les rares informations disponibles sur les effets anticancéreux d’A. vulgaris, la littérature antérieure a suggéré des propriétés anticancéreuses potentielles, révélant une cytotoxicité prometteuse contre les lignées cellulaires cancéreuses humaines du sein MCF7, de l’ovaire A2780, du col de l’utérus HeLa et de la prostate PC-3, attribuée à sa richesse en composés phénoliques, notamment la catéchine, la quercétine et son hexoside, la lutéoline, l’apigénine, les acides gallique et caféique. Les auteurs ont assuré que les cancers reproducteurs masculins, tels que le cancer de la prostate, pouvaient être ciblés par l’extrait d’A. vulgaris, malgré les informations ethnobotaniques sur son potentiel anticancéreux contre les tissus reproducteurs féminins. De plus, il a été rapporté que l’extrait de feuilles d’A. vulgaris induisait une réduction remarquable de la viabilité de la lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y, des lignées cellulaires de mélanome de souris B16 et B16F10 et du cancer du sein de souris 4T1, suivie d’une perte du potentiel de division après 72 h de traitement. Néanmoins, des investigations plus détaillées sont nécessaires pour fournir une explication approfondie de l’activité anticancéreuse d’A. vulgaris.
Cette étude a donc été conçue pour examiner le potentiel antitumoral in vitro de l’extrait méthanolique de racine d’A. vulgaris contre les lignées cellulaires PC-3, MCF-7 et Caco-2 et pour fournir une interprétation approfondie de ses effets sur l’apoptose cellulaire, de ses effets antimicrobiens et de son profil phytochimique.
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériel végétal et préparation de l’extrait
Les racines d’alchémille (Alchemilla vulgaris Auct.) ont été collectées pendant le stade de croissance végétative à partir de plantes poussant naturellement dans la partie aval de Wadi Allaqi, dans le désert méridional égyptien, région d’Assouan. Les échantillons ont été collectés dans des sacs en papier et directement transportés au Department of Ornamental Plants and Landscape Gardening, Assiut University, Égypte, où ils ont été authentifiés par des membres seniors du personnel du département. Après nettoyage à l’eau courante puis à l’eau distillée, les racines ont été coupées en petits morceaux avant séchage à l’ombre à ~30 °C. Après séchage, les échantillons ont été pulvérisés et conservés dans des contenants sombres jusqu’à leur utilisation pour la préparation des extraits méthanoliques. La poudre de racine (100 g) a été macérée dans MeOH/H2O (8:2, v/v) à un rapport échantillon/solvant de 1:10 p/v et maintenue sur un agitateur pendant trois jours à température ambiante. Après filtration, les résidus ont été utilisés pour répéter le même processus deux fois de plus. Les filtrats combinés des trois fois ont été concentrés sous pression réduite à 50 °C au moyen d’un évaporateur rotatif (Hidolph VV2000) afin d’éliminer le méthanol. L’extrait restant a été congelé à −80 °C pendant la nuit avant d’être soumis à une lyophilisation au moyen d’un lyophilisateur Telstar-LyoQuest plus-55 à 1,5 × 10−4 mbar pendant 48 h. Le rendement de l’extrait sec a été estimé (7,15 g) et conservé dans des flacons sombres à −20 °C.
2.2. Analyse HPLC de l’extrait de racine d’A. vulgaris
L’extrait sec (0,1 g) a été dissous dans du méthanol (2 mL) afin d’obtenir une concentration d’échantillon de 50 mg/mL, utilisée pour analyser la teneur en phénols et en flavonoïdes. L’analyse a été réalisée par HPLC-(Agilent 1100), composée de deux pompes LC, d’un détecteur UV/Vis et d’une colonne C18 (125 mm × 4,60 mm, taille de particules 5 µm). Les chromatogrammes ont été obtenus et analysés au moyen d’Agilent ChemStation. Les acides phénoliques ont été séparés en employant une phase mobile en gradient de deux solvants : solvant A (méthanol) et solvant B (acide acétique dans l’eau 1:25), avec une longueur d’onde de détection de 250 nm. La phase mobile utilisée pour la séparation des flavonoïdes était l’acétonitrile (A) et l’acide formique aqueux à 0,2 % (v/v) (B), avec un programme d’élution isocratique (70:30). La longueur d’onde de détection a été réglée à 360 nm. Le programme de gradient a commencé avec 100 % de B, maintenu à cette concentration pendant les 3 premières min. Cela a été suivi par 50 % d’éluant A pendant les 5 min suivantes, après quoi la concentration de A a été augmentée à 80 % pendant les 2 min suivantes puis réduite de nouveau à 50 % pendant les 5 min suivantes. Les composés détectés ont été appariés avec des échantillons standards, et leurs concentrations ont été calculées à partir des courbes d’étalonnage de leurs composés standards. Les concentrations finales ont été exprimées en mg/g d’extrait sec ainsi qu’en poudre de racine. Tous les standards (acide chlorogénique, catéchol, acide syringénique, acide caféique, acide férulique, acide p-coumarique, acide benzoïque, acide gallique, acide chlorogénique, acide p-hydroxybenzoïque, acide cinnamique, acide salicylique, épicatéchine, acide ellagique, pyrogallol, acide protocatéchuique, tyrosol, 7-OH flavone, naringine, rutine, quercétine, kaempférol, lutéoline, hespéridine, catéchine) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis).
2.3. Activité antifongique de l’extrait de racine d’A. vulgaris
L’activité de l’extrait méthanolique de racine d’A. vulgaris a été analysée in vitro contre Rhizoctonia solani, Penicillium italicum et Fusarium oxysporium. Le milieu PDA (Potato Dextrose Agar) a été préparé de sorte qu’il contienne diverses concentrations d’extrait d’A. vulgaris (de 15,6 à 1000 ppm en dilutions au demi) en comparaison avec l’hymexazol (1000 ppm) comme témoin positif. Après versement du milieu dans des boîtes de Petri, un disque fongique de 2 mm a été inoculé au centre de chaque boîte, puis incubé à 28 °C pendant 10 jours. Lorsque la croissance fongique a recouvert le témoin (boîtes non traitées), la croissance fongique linéaire a été enregistrée dans le témoin (A) et dans les boîtes traitées (B).
2.4. Activité antibactérienne de l’extrait de racine d’A. vulgaris
L’extrait méthanolique des racines d’A. vulgaris a été testé pour son activité antibactérienne contre Agrobacterium tumefaciens, Serratia marcescens et Acinetobacter johnsoni au moyen du test de diffusion sur gélose selon la méthode décrite par Brulez et Zeller. En bref, des boîtes de Petri remplies de milieu NSA (nutrient-sucrose agar) ont été inoculées avec différentes bactéries par étalement de la suspension bactérienne sur la surface du milieu. Après séchage, un puits de 9 mm a été réalisé et rempli avec la concentration correspondante de l’extrait (de 15,6 à 1000 ppm en dilutions au demi) ou avec de l’amoxicilline (62,5 ppm) comme témoin positif, et chaque traitement a été répété quatre fois. Les cultures ont été incubées à 27 °C pendant deux jours, après quoi les zones d’inhibition en mm ont été enregistrées pour le témoin (A) et les traitements (B). Le pourcentage d’inhibition de la croissance a été calculé selon l’équation (1). La concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’extrait testé contre les trois souches bactériennes a été déterminée comme la plus faible concentration d’extrait qui supprime la croissance bactérienne après 24 h d’incubation : (1) Inhibition de la croissance = A − B / A × 100.
2.5. Test de cytotoxicité
2.5.1. Cultures cellulaires
Toutes les lignées cellulaires employées dans la présente étude ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, États-Unis). Trois lignées cellulaires cancéreuses humaines ont été incluses, c’est-à-dire la prostate (PC-3), le sein (MCF-7) et l’adénocarcinome colorectal (Caco-2), en plus des cellules Vero normales (ATCC CCL-81) isolées du rein de Cercopithecus aethiops. Les cellules MCF-7 (ATCC HTB-22) ont été isolées de la glande mammaire, dérivées du sein à partir de métastases d’épanchement pleural, les cellules PC-3 (ATCC CRL-1435) ont été isolées de la prostate dérivée de métastases osseuses et les cellules Caco-2 (ATCC ATB-37) ont été isolées de tissus du côlon. Les cellules ont été cultivées dans le milieu RPMI 1640 supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10 %, de la pénicilline G à 100 unités/mL et du sulfate de streptomycine à 100 mg/mL. Les cellules cultivées ont été incubées à 37 °C dans un incubateur à CO2. Les cellules ont été récoltées par incorporation avec de la trypsine à 0,25 % et de l’EDTA-2Na à 0,025 % dans du PBS (Phosphate-Buffered Saline).
2.5.2. Test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium)
Le protocole du test MTT rapporté par Bahuguna et al. a été appliqué pour tester l’activité cytotoxique de l’extrait de racine d’A. vulgaris avec de légères adaptations. En bref, les cellules ont été récoltées à partir des quatre lignées cellulaires investiguées et cultivées dans des plaques à 96 puits à 100 mL/puits (1 × 105 cellules/mL), puis incubées à 37 °C dans des conditions de CO2. Une monocouche de cellules a été laissée se développer pendant 24 h avant décantation du milieu et lavage de la couche deux fois avec un milieu de croissance frais. Un milieu d’entretien RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) supplémenté avec 2 % de sérum bovin fœtal a été utilisé pour préparer des dilutions sériées au demi (de 31,5 à 1000 ppm) de l’extrait, comparées à la doxorubicine comme témoin positif. Tous les signes visuels de toxicité cellulaire ont été enregistrés. Les plaques ont été incubées pendant 48 h avant la réalisation du test MTT. Le milieu de culture a été décanté, et 20 mL de solution de MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits puis incubés dans l’obscurité pendant 4 h dans les mêmes conditions. La solution de MTT a été décantée et remplacée par du DMSO (diméthylsulfoxyde) afin de solubiliser le cristal de formazan (produit métabolique du MTT), puis incubée pendant 30 min dans les mêmes conditions. Les densités optiques ont été enregistrées à une longueur d’onde de 560 nm pour les cellules en plaque au moyen d’un lecteur ELISA. Le pourcentage de cytotoxicité a été estimé à partir de la formule : pourcentage de cytotoxicité = (A560 témoin − A560 échantillon)/A560 témoin × 100. La CI50 a été calculée pour l’extrait testé contre chaque lignée cellulaire ainsi que contre les cellules Vero normales, à partir de quoi l’indice de sélectivité (IS) a été calculé comme IS = CI50 calculée pour les cellules normales/CI50 calculée pour les cellules cancéreuses. Les données obtenues ont été comparées avec la CI50 de la doxorubicine testée contre les mêmes lignées cellulaires dans les mêmes conditions.
2.6. Évaluation de l’arrêt du cycle cellulaire
Étant donné que la CI50 la plus faible et l’IS le plus élevé ont été enregistrés pour la lignée cellulaire PC-3, celle-ci a été employée pour examiner la distribution du cycle cellulaire selon la méthode précédemment rapportée par Alqahtani et al. et Nasr et al. Les cellules PC-3 ont été traitées avec l’extrait de racine d’A. vulgaris à 88 µg/mL (la CI50 enregistrée contre la lignée cellulaire PC-3), puis incubées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été récoltées et lavées deux fois avec du PBS, fixées avec de l’éthanol froid à 70 %, puis conservées à 4 °C pendant 4 h. Après cela, les cellules fixées ont été réhydratées avec du PBS puis incubées pendant 30 min avec de la RNase A à 100 μg/mL et de l’iodure de propidium à 100 μg/mL (ab139418_Propidium Iodide Flow Cytometry Kit/BD, Abcam, Boston, MA, États-Unis). La teneur en ADN a été évaluée au moyen d’un cytomètre en flux (BD FACSCalibur). L’intensité de fluorescence de l’iodure de propidium a été collectée sur FL2 d’un cytomètre en flux et avec une excitation laser à 488 nm.
2.7. Évaluation par cytométrie en flux des cellules apoptotiques par rapport aux cellules nécrotiques
Un kit de détection de l’apoptose, FITC Annexin V avec PI (BioVision, CA, États-Unis), a été employé avec les instructions du fabricant pour évaluer l’apoptose et la nécrose dans les cellules PC-3 traitées avec l’extrait de racine d’A. vulgaris. Les cellules PC-3 ont été cultivées dans des plaques de culture à 6 puits à 4 × 105 cellules/puits pendant 24 h, suivies du traitement avec l’extrait d’A. vulgaris à 88 µg/mL et incubées pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été récoltées et lavées deux fois avec du PBS, puis remises en suspension dans 100 µL de tampon de liaison à l’annexine V et mélangées avec 5 μL de chacun des colorants Annexin V-FITC et iodure de propidium. Après incubation pendant 15 min dans l’obscurité, les cellules apoptotiques par rapport aux cellules nécrotiques ont été évaluées par cytométrie en flux (BD FACSCalibur).
2.8. PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
L’analyse qRT-PCR a été conduite pour les cellules PC-3 (4 × 105 cellules/mL) dans une plaque à 6 puits soumise au traitement avec l’extrait de racine d’A. vulgaris à 88 µg/mL pendant 24 h. Le réactif TRIzol a été utilisé pour extraire l’ARN des cellules témoins comme des cellules traitées. 1 μg d’ARN extrait a été converti en ADNc au moyen d’un kit BioRad syber green PCR MMX. Des amorces spécifiques de BAX, BCL2 et P53 ont été employées pour réaliser la qRT-PCR au moyen du système Rotorgene RT-PCR (Corbett Research, Sydney, Australie).
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2.9. Analyse statistique
Toutes les expériences ont été menées en trois essais indépendants et les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Le logiciel Statistix (ver. 8.1, Analytical Software, Tallahassee, FL, États-Unis) a été utilisé pour effectuer l’analyse statistique. Une ANOVA à un facteur a été appliquée avec le test LSD pour comparer les moyennes des groupes.
3. Résultats
3.1. Composition chimique de l’extrait de racine d’A. vulgaris
Une analyse quantitative des composants phénoliques et flavonoïdes de l’extrait méthanolique de racine d’A. vulgaris a été conduite au moyen de la HPLC. Au total, sept acides phénoliques ont été identifiés, avec une concentration totale de 93,9 μg/g de poudre de racine. Les acides phénoliques prédominants étaient les acides cinnamique et caféique (25,8 et 24,7 μg/g de poudre de racine, respectivement). Les autres acides détectés étaient, dans l’ordre décroissant suivant : acides salicylique (13,7 μg/g), ellagique (12,1 μg/mg), syringénique (7,6 μg/g), gallique (6,8 μg/g) et protocatéchuique (3,2 μg/g), en plus de trois autres composés inconnus.
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Au total, sept flavonoïdes ont été détectés avec une concentration totale de 70,2 μg/g de poudre de racine. L’hespéridine comme la quercétine ont enregistré les concentrations les plus élevées (16,5 et 14,7 μg/g, respectivement). Elles ont été suivies, dans l’ordre décroissant, par la catéchine (11,0 μg/g), la naringine (9,1 μg/g), la rutine (7,4 μg/g), le kaempférol (6,0 μg/g) et la lutéoline (5,5 μg/g).
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3.2. Activité antimicrobienne de l’extrait de racine d’A. vulgaris
L’activité antibactérienne de l’extrait de racine d’A. vulgaris a montré une inhibition significative de la croissance des trois bactéries testées, notamment la bactérie Gram positive pathogène humaine Acinetobacter johnsonii, la bactérie Gram positive bioagent Serratia marcescens et la bactérie Gram négative phytopathogène. Les trois concentrations les plus faibles (15,6, 31,3 et 62,5 µg/mL) n’ont montré aucune inhibition de croissance pour aucune des trois bactéries. L’effet inhibiteur de l’extrait de racine d’A. vulgaris a commencé à 125 µg/mL (CMI) pour les trois souches bactériennes, atteignant une zone d’inhibition de 7,67, 8,00 et 8,00 mm, correspondant à des pourcentages d’inhibition de 27,78, 3,33 et 33,33 % pour Serratia marcescens, Acinetobacter johnsonii et Agrobacterium tumefaciens, respectivement. Des concentrations plus élevées ont présenté une augmentation dépendante de la dose de la zone d’inhibition et du pourcentage d’inhibition de la croissance. La croissance d’Acinetobacter johnsonii a montré le pourcentage d’inhibition le plus fort, tandis que Serratia marcescens et Agrobacterium tumefaciens ont répondu de manière similaire. Entre-temps, Serratia marcescens était la plus affectée par le témoin positif antibiotique (amoxicilline), puis Serratia marcescens, suivie d’Acinetobacter johnsonii puis d’Agrobacterium tumefaciens.
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L’extrait de racine d’A. vulgaris à toutes les concentrations testées a présenté une suppression dépendante de la dose de la croissance des souches fongiques employées : Rhizoctonia solani, Penicillium italicum et Fusarium oxysporium. Cela indique que la CMI pour les trois espèces fongiques est supérieure à 1000 µg/mL. L’effet inhibiteur le plus fort de l’extrait a été observé contre Fusarium oxysporium, enregistrant 45,56 % d’inhibition de croissance à 1000 µg/mL d’extrait, contre 81,85 % d’inhibition en réponse au traitement témoin positif par hymexazol.
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3.3. Activité antiproliférative de l’extrait de racine d’A. vulgaris
L’extrait méthanolique de racines d’A. vulgaris a montré un effet cytotoxique sur les lignées de prostate (PC-3), de sein (MCF-7) et d’adénocarcinome colorectal (Caco-2), ainsi que sur les cellules Vero normales, d’une manière dépendante de la dose. Les caractéristiques morphologiques des cellules traitées et non traitées sont claires sur les photos présentées. Des indices de sélectivité (IS) remarquablement élevés ont été enregistrés, en particulier dans le cas des lignées cellulaires PC-3 et Caco-2 (6,69 et 5,36), atteignant ≈6 fois ceux enregistrés par la doxorubicine (1,03 et 1, respectivement). La CI50 la plus faible et l’IS le plus élevé ont été enregistrés pour la lignée cellulaire PC-3 et, par conséquent, celle-ci a été employée dans des études ultérieures sur l’arrêt du cycle cellulaire, la proapoptose et l’expression des gènes liés à l’apoptose.
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3.4. Effet de l’extrait de racine d’A. vulgaris sur l’arrêt du cycle cellulaire dans les cellules PC-3
L’arrêt du cycle cellulaire a été étudié dans des cellules PC-3 exposées à l’extrait de racine d’A. vulgaris à 88 µg/mL et les données sont illustrées. Le traitement par l’extrait a provoqué un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. L’évaluation de la distribution du cycle cellulaire et de la teneur en ADN des cellules a révélé une proportion plus élevée de G0/G1 dans les cellules PC-3 traitées (63,28 %) par rapport au témoin (56,39 %). La proportion des autres phases cellulaires a montré des pourcentages inférieurs à ceux des cellules témoins.
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3.5. Effet de l’extrait de racine d’A. vulgaris sur l’apoptose et la nécrose des cellules
L’exposition des cellules PC-3 à l’extrait de racine d’A. vulgaris à 88 µg/mL a induit une apoptose considérablement plus élevée que celle des cellules témoins. L’apoptose totale dans les cellules traitées a atteint 20,38 %, incluant 11,07 % d’apoptose précoce et 9,13 % d’apoptose tardive. Ces valeurs correspondent à environ 31 fois le pourcentage d’apoptose enregistré dans les cellules témoins (0,64 %). D’autre part, les cellules PC-3 traitées n’ont enregistré que 6,8 % de cellules nécrotiques, contre 1,51 % de nécrose dans les cellules témoins.
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3.6. Effet de l’extrait de racine d’A. vulgaris sur l’expression des gènes liés à l’apoptose dans les cellules PC-3
L’analyse qRT-PCR a été employée pour quantifier l’expression de trois gènes liés à l’apoptose (BAX, BCL2 et P53) dans les cellules PC-3 exposées au traitement par l’extrait de racine d’A. vulgaris à 88 µg/mL. Une diminution considérable a été enregistrée dans le gène antiapoptotique BCL2 (0,74 % du témoin), tandis que l’expression des gènes proapoptotiques P53 et BAX a montré une augmentation considérable, enregistrant 450 % et 360 % de celle du témoin. La surexpression des gènes proapoptotiques P53 et BAX contribue à expliquer le mécanisme d’induction de l’apoptose en réponse au traitement par l’extrait de racine d’A. vulgaris.
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4. Discussion
L’extrait méthanolique des racines d’A. vulgaris investigué dans la présente étude a présenté une forte activité antiproliférative sur les lignées de prostate (PC-3), de sein (MCF-7) et d’adénocarcinome colorectal (Caco-2), ainsi que sur les cellules Vero normales, d’une manière dépendante de la dose. Un indice de sélectivité élevé a été enregistré pour l’extrait testé contre les trois lignées cellulaires, les cellules PC-3 présentant l’IS le plus élevé et la CI50 la plus faible. Cet effet était associé à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et à une induction de l’apoptose à 20,38 %, principalement une apoptose précoce. L’induction de l’apoptose était liée à la surexpression des gènes proapoptotiques P53 et BAX et à la sous-expression du gène antiapoptotique BCL2. L’induction de gènes proapoptotiques par l’extrait de racine d’A. vulgaris suggère la nécessité d’inclure d’autres lignées cellulaires cancéreuses dans des études ultérieures plus larges et approfondies, puisque l’apoptose est considérée comme une voie potentielle pour le développement de nouveaux médicaments. Contrairement à l’extrait des parties aériennes, l’extrait de racine d’A. vulgaris a été étudié dans un nombre limité d’études antérieures, notamment Boroja et al. et Jurić et al. Cependant, la cytotoxicité précédemment rapportée pour l’extrait des parties aériennes soutient les activités prometteuses révélées par l’extrait de racine dans notre étude. Il a été rapporté que l’extrait de feuilles d’A. vulgaris induisait une réduction remarquable de la viabilité de la lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y, des lignées cellulaires de mélanome de souris B16 et B16F10 et du cancer du sein de souris 4T1, suivie d’une perte du potentiel de division après 72 h de traitement. Des résultats similaires ont été obtenus par Vlaisavljević et al. contre les lignées cellulaires humaines de cancer du sein MCF7, de l’ovaire A2780, du col de l’utérus HeLa et de cancer de la prostate PC-3. Ces études ont fourni des constatations à l’appui de celles exercées par les nôtres concernant le fort effet antiprolifératif de l’extrait de racine d’A. vulgaris contre la lignée cellulaire de cancer de la prostate (PC-3). Les auteurs ont assuré que les cancers reproducteurs masculins tels que le cancer de la prostate pouvaient être ciblés par l’extrait d’A. vulgaris malgré les informations ethnobotaniques sur son potentiel anticancéreux contre les tissus reproducteurs féminins. Jurić et al. ont indiqué que les extraits méthanoliques de parties aériennes et de racines d’A. vulgaris prévenaient la toxicité hépatorénale et testiculaire induite par le cisplatine chez le rat par atténuation du niveau de plusieurs paramètres liés au stress oxydatif induit par le cisplatine, ainsi que du sérum des lésions du foie, du rein et du testicule et de la morphologie tissulaire. Selon Jelača et al., le mécanisme de mort cellulaire induit par A. vulgaris passe par la survenue de l’autophagie après le traitement, comme l’indique la présence d’autophagosomes dans les cellules de mélanome B16 par cytométrie en flux, tandis qu’un certain pourcentage de cellules de mélanome B16F10 a été soumis à une mort cellulaire programmée d’une manière indépendante des caspases. De plus, Moqidem a suggéré que la mort cellulaire induite par A. vulgaris sur la lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y passait par l’induction de l’apoptose accompagnée d’une sous-expression significative des gènes du cycle cellulaire (CDK4, CDK6 et E2F3), et d’une surexpression du gène suppresseur de tumeur PTEN.
L’extrait de racine d’A. vulgaris a démontré une activité antibactérienne in vitro contre la bactérie Gram positive pathogène humaine A. johnsonii, la bactérie Gram positive bioagent S. marcescens et la bactérie Gram négative phytopathogène A. tumefaciens. De plus, il a montré une activité antifongique contre R. solani, P. italicum et F. oxysporium. L’effet inhibiteur le plus fort de l’extrait a été induit contre la souche bactérienne A. johnsonii et la souche fongique F. oxysporium. La CMI calculée pour les trois souches bactériennes était de 125 µg/mL, tandis qu’elle était supérieure à 1000 µg/mL pour les souches fongiques. En conséquence, l’extrait de racine d’A. vulgaris est considéré comme un agent antibactérien puissant sur la base de la classification suggérée par Kuete, considérant les substances comme des agents antimicrobiens puissants, modérés ou faibles si elles induisent une activité antibactérienne avec des CMI inférieures à 0,1 mg/mL, comprises entre 0,1 et 0,625 ou supérieures à 0,625 mg/mL, respectivement. Une activité antibactérienne élevée a également été rapportée par Boroja et al. contre Enterococcus faecalis, Salmonella typhimurium, Micrococcuslysodeikticus et Bacilus mycoides comme espèces bactériennes examinées les plus sensibles aux extraits de parties aériennes et de racines d’A. vulgaris. Ils ont également enregistré une activité antifongique pour l’extrait de racines contre Phialophora fastigiate, Penicillium canescens, Trichoderma viride, T. longibrachiatum, Aspergillus glaucus et Fusarium oxysporum. Selon Boroja et al., leur étude a été la première à traiter de l’activité antimicrobienne des racines d’Alchemilla. Leurs résultats ont révélé une activité antimicrobienne et des effets anti-inflammatoires similaires des extraits de parties aériennes et de racines, avec une activité antioxydante plus élevée de l’extrait de racine. Nos constatations, avec celles des études publiées, fournissent des preuves concernant l’activité biologique de l’extrait de racine d’A. vulgaris.
L’activité antiproliférative prometteuse, l’induction de l’apoptose et l’activité antimicrobienne induites par l’extrait de racine d’A. vulgaris pourraient être discutées dans le contexte de sa teneur en composés phénoliques et flavonoïdes analysés par HPLC. Sept acides phénoliques et sept flavonoïdes ont été détectés. Les acides phénoliques prédominants étaient les acides cinnamique et caféique, tandis que l’hespéridine et la quercétine étaient les principaux flavonoïdes. Les autres acides phénoliques identifiés comprenaient les acides salicylique, ellagique, syringénique, gallique et protocatéchuique. Les flavonoïdes comprenaient également la catéchine, la naringine, la rutine, le kaempférol et la lutéoline. Les fortes activités biologiques des composés phénoliques ont été largement rapportées par de nombreux auteurs antérieurs, tels que Vlaisavljević et al., qui ont attribué la cytotoxicité prometteuse de l’extrait d’A. vulgaris contre les lignées cellulaires humaines de cancer du sein MCF7, de l’ovaire A2780, du col de l’utérus HeLa et de cancer de la prostate PC-3 à sa richesse en composés phénoliques, notamment la catéchine, la quercétine et son hexoside, la lutéoline, l’apigénine, les acides gallique et caféique. Les composés phénoliques font partie des importants métabolites secondaires actifs ayant des activités biologiques rapportées sur les fonctions physiologiques humaines, ce qui a conduit à leur reconnaissance comme compléments alimentaires et remèdes en médecine complémentaire. Leur rôle est principalement attribué à leurs effets antioxydants et donc à des effets de chimioprévention et chimiothérapeutiques. Moqidem a signifié le rôle des composés phénoliques détectés en abondance dans l’extrait d’A. vulgaris dans la réduction de la viabilité des cellules SH-SY5Y. L’activité antioxydante des composants flavonoïdes et phénoliques détectés dans l’extrait d’A. vulgaris contribue également de manière significative à son activité biologique, y compris cytotoxique. Jain et al. ont enregistré une teneur élevée en flavonoïdes et en phénoliques de l’extrait méthanolique et de l’extrait à l’acétate d’éthyle d’A. vulgaris, ce qui a conduit à des résultats de piégeage radicalaire puissants supplémentaires, l’extrait méthanolique exerçant une activité antioxydante plus élevée. La quercétine est l’un des flavonoïdes détectés dans A. vulgaris, dont il a été rapporté qu’elle atténue la néphrotoxicité et l’hépatotoxicité induites par le cisplatine. Jurić et al. ont rapporté la présence de plus de 20 composés phénoliques différents dans les extraits de parties aériennes et de racines d’A. vulgaris analysés par UHPLC/DAD, où l’acide ellagique, la catéchine et le gallate de catéchine étaient des composants dominants dans les deux extraits. Malgré le nombre plus élevé de composés phénoliques par rapport à nos constatations, leurs résultats ont indiqué que le kaempférol et la quercétine étaient sous la limite de détection dans l’extrait méthanolique de racine, alors qu’ils ont été trouvés dans l’extrait des parties aériennes. Ces résultats contredisent une autre étude publiée par Vlaisavljević et al., qui n’ont rapporté que 11 composés phénoliques dans l’extrait de parties aériennes d’A. vulgaris analysé par la technique LC-MS/MS, avec l’absence à la fois de kaempférol et de quercétine. Une variation du profil phytochimique entre les parties aériennes et racinaires d’A. vulgaris et entre du matériel végétal collecté à partir de différentes sources est attendue et raisonnable sur la base des effets connus des facteurs environnementaux sur la croissance végétale et l’induction des métabolites secondaires. De plus, il existe un effet clair des différentes techniques d’analyse chromatographique employées dans la littérature publiée.
5. Conclusions
Dans le contexte des rares informations disponibles sur l’activité biologique détaillée de l’extrait de racines d’A. vulgaris, les constatations obtenues dans la présente investigation sont d’une importance particulière. L’extrait méthanolique de racines d’A. vulgaris a présenté une forte activité antiproliférative sur PC-3, MCF-7 et Caco-2 en plus des cellules Vero, d’une manière dépendante de la dose, les cellules PC-3 présentant l’indice de sélectivité le plus élevé et la CI50 la plus faible. Cet effet était associé à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et à l’induction de l’apoptose par la surexpression des gènes proapoptotiques P53 et BAX et la sous-expression du gène antiapoptotique BCL2. De plus, il a montré une puissante activité antibactérienne et antifongique in vitro. Ces effets étaient liés aux constituants phytochimiques de l’extrait étudié, en particulier les acides phénoliques et les flavonoïdes.