Double rôle de l’extrait d’Alchemilla vulgaris L. dans la régression du cancer du sein : rétablissement d’une réponse immunitaire efficace
Référence : Pharmaceuticals 2024. — PMCID PMC10975144 · DOI 10.3390/ph17030286 Type : étude in vivo · Plante : Alchemille commune · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Les données ethnomédicinales mentionnent depuis longtemps l’usage historique d’Alchemilla vulgaris L. en médecine populaire, en particulier pour le traitement de problèmes gynécologiques. En s’appuyant sur ces connaissances ethnomédicinales concernant les maladies féminines, l’objectif de cette recherche était d’évaluer l’impact de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris sur des cellules de cancer du sein de souris (4T1) in vitro et in vivo, ainsi que son effet sur le compartiment immunitaire dans le microenvironnement tumoral. Derrière la diminution de viabilité des cellules 4T1 induite par le traitement avec l’extrait d’A. vulgaris se trouvait une forte inhibition de la prolifération cellulaire, accompagnée d’une apoptose dépendante des caspases et d’une mort cellulaire autophagique. Les changements observés dans la culture de cellules 4T1 après traitement étaient bien orchestrés et ont conduit à une réduction du potentiel métastatique par affaiblissement des capacités d’adhésion, d’invasion, de migration et de formation de colonies in vitro. La production intracellulaire accrue d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote favorisée par le traitement pourrait interférer avec tous les effets observés. Outre l’effet direct sur les cellules tumorales, l’extrait d’A. vulgaris a significativement réduit la croissance tumorale dans le modèle solide orthotopique de carcinome mammaire par restitution d’une réponse immunitaire locale et systémique efficace, reflétée par le potentiel accru de présentation de l’antigène des cellules dendritiques (DC), ainsi que par l’étendue et l’activité des lymphocytes T effecteurs.
1 Introduction
Le cancer du sein constitue la forme de malignité la plus prévalente chez les femmes dans le monde et représente 24,5% de toutes les malignités dans la population féminine. Malgré de meilleures capacités diagnostiques, il cause environ 6,9% des décès liés au cancer. Jusqu’à récemment, le cancer du poumon était considéré comme le type de cancer le plus fréquemment diagnostiqué ; toutefois, en 2020, environ 2,26 millions de nouveaux cas de cancer du sein ont été enregistrés, dépassant le nombre de nouveaux cas de cancer du poumon et représentant 11,7% de tous les cas de cancer rapportés. Comme il s’agit d’une maladie multifactorielle, divers facteurs tels que les facteurs génétiques, la structure de la population, l’environnement et le mode de vie contribuent à sa survenue. La prévalence mondiale du cancer du sein a augmenté en raison de changements des facteurs de risque.
S’il est diagnostiqué à un stade précoce, l’objectif principal du traitement du cancer du sein est de guérir et de prévenir le risque de récidive ; ainsi, la thérapie implique une approche radicale. Dans la forme métastatique, en revanche, le but est d’obtenir le contrôle de la maladie et la survie la plus longue possible de la patiente tout en maintenant la qualité de vie. Plusieurs méthodes locales et systémiques sont utilisées pour le traitement. Les méthodes les plus couramment utilisées sont l’ablation chirurgicale, la radiothérapie, la chimiothérapie et la thérapie ciblée. La thérapie ciblée englobe le traitement endocrinien du cancer du sein à statut hormonal positif et la thérapie anti-HER2 du cancer du sein HER2+. Les approches innovantes montrant des résultats prometteurs comprennent l’immunothérapie, les anticorps conjugués et le ciblage des voies métaboliques.
Les formes histologiques prédominantes du cancer du sein comprennent les carcinomes apocrine, médullaire, cribriforme, métaplasique, lobulaire classique, neuroendocrine, mucineux, lobulaire pléomorphe et tubulaire. En plus de ces types, les cas les plus fréquemment diagnostiqués impliquent le type non spécifique de carcinome canalaire invasif. Actuellement, quatre sous-groupes moléculaires, luminal A, luminal B, HER2+ et triple négatif, sont largement reconnus et solidement établis dans la pratique clinique. Le terme cancer du sein triple négatif (TNBC) décrit un sous-type de cancer du sein dans lequel l’expression des trois principaux marqueurs tumoraux mammaires, notamment le récepteur des œstrogènes (ER), le récepteur de la progestérone (PR) et la protéine HER2, est absente. Cette forme de cancer du sein constitue environ 15 à 20% de tous les cas de cancer du sein et environ 40% des tumeurs de haut grade. Le TNBC présente un intérêt particulier pour les chercheurs car il pose un défi thérapeutique principalement en raison de sa faible réponse au traitement et de sa nature hautement invasive.
Outre la diversité initiale de la transformation néoplasique, le cancer comprend également de nombreux autres types cellulaires en plus des cellules tumorales, tels que les adipocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes), ainsi que les constituants non cellulaires de la matrice extracellulaire (fibronectine, collagène, hyaluronane, laminine, etc.). Tous créent le réseau du microenvironnement tumoral (TME). Les cellules tumorales et les autres composants du TME sont en communication constante et réciproque. Normalement, le système immunitaire agit comme un mécanisme de défense contre les entités étrangères, y compris les tumeurs, visant à prévenir leur croissance et leurs métastases. Cependant, de nombreux rapports ont montré que les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs peuvent aussi être impliquées dans la progression tumorale de nombreuses façons. Outre les stratégies bien connues d’échappement immunitaire tumoral, l’architecture du TME et la construction de la matrice extracellulaire permettent le recrutement de suppresseurs tumoraux tels que les MDSC et les Treg, qui orchestrent l’établissement d’une immunosuppression locale. En considérant le tissu tumoral comme une plaie qui ne guérit jamais, les points de contrôle de la régulation de la réponse immunitaire favorisent l’entrée des cellules effectrices dans l’état d’épuisement. Par conséquent, la thérapie anticancéreuse ne devrait pas seulement viser à détruire les cellules tumorales, mais aussi déclencher le flux d’événements menant à une réponse immunitaire antitumorale renouvelée.
Malgré de nombreuses options thérapeutiques, la récidive et les problèmes associés persistent chez les patientes, principalement en raison des nombreux effets secondaires, de la toxicité générale et du comportement agressif des tumeurs. Récemment, l’utilisation de certains types de phytothérapie chez les patientes atteintes de cancer du sein a augmenté de manière significative. Les plantes médicinales deviennent de plus en plus populaires car elles sont reconnues comme des sources efficaces et abordables de nouveaux agents chimiothérapeutiques. Suivant la règle selon laquelle la nature est le mieux complétée et équilibrée par la nature elle-même, le potentiel des composés naturels à interagir directement ou indirectement avec les cellules de l’hôte ouvre de nombreuses possibilités d’influencer l’écosystème tumoral. Lorsqu’il s’agit du mélange complexe de composés dans l’extrait organique, deux types d’interactions et le dialogue croisé entre elles peuvent être cruciaux : un effet direct sur les cellules tumorales et le potentiel d’affecter le phénotype et la fonction des cellules immunitaires. La mort immunogène des cellules tumorales induite par divers polyphénols végétaux entraîne la libération de signaux de danger et le renouvellement subséquent de la réponse immunitaire antitumorale grâce à un potentiel accru des cellules dendritiques présentatrices d’antigène et des réponses des lymphocytes T effecteurs. Enfin, les produits naturels peuvent perturber les signaux inhibiteurs responsables de la création d’un environnement immunosuppresseur dans les tumeurs et renouveler la performance effectrice des lymphocytes T.
Parmi les nombreuses plantes qui exercent diverses activités biologiques se trouve Alchemilla vulgaris, largement connue sous le nom de manteau de Notre-Dame, car de nombreux rapports ethnomédicinaux mentionnent ses effets bien connus contre les troubles du système reproducteur féminin (prurit vulvaire, dysménorrhée, flux menstruel abondant, troubles ménopausiques). En outre, son activité contre des maladies liées au système reproducteur (endométriose, kystes, fibromes et infertilité) a été décrite. L’activité anticancéreuse de cette plante a été rapportée contre des tumeurs des organes reproducteurs féminins (A2780 et HeLa), ainsi que contre des lignées cellulaires in vitro de cancer de la prostate humain (PC-3), de cancer du sein humain (MCF-7), de mélanome humain A375, de carcinome pulmonaire humain A549 et de cancer colorectal humain (Caco2, HCT116). Notre recherche précédente a montré de fortes propriétés anticancéreuses de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris contre le mélanome murin non invasif et hautement invasif. Sur la base des données ethnomédicinales relatives aux troubles et maladies féminins, l’objectif de cette recherche était d’évaluer l’activité directe de l’extrait d’A. vulgaris contre des cellules de cancer du sein triple négatif murin (4T1) dans un cadre in vitro et in vivo, ainsi que son effet sur le microenvironnement tumoral dans un cadre ex vivo. Les données obtenues ont montré qu’en plus de l’effet antitumoral direct de l’extrait d’A. vulgaris réalisé par inhibition de la division cellulaire, mort cellulaire apoptotique et diminution des caractéristiques métastatiques, l’extrait testé exerçait un fort impact sur la réponse immunitaire systémique et locale. Compte tenu de tous les points ci-dessus, nous concluons que l’extrait d’A. vulgaris réduit la croissance tumorale par un effet direct sur la viabilité des cellules tumorales et le rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale efficace.
2 Résultats
2.1 L’extrait éthanolique d’A. vulgaris présente de fortes propriétés antitumorales contre toutes les lignées cellulaires in vitro
Afin d’évaluer le potentiel antitumoral de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris contre les lignées cellulaires de carcinome mammaire murin (4T1) et d’adénocarcinome mammaire humain (MDA-MB-468, MDA-MB-231 et MDA-MB-361), les cellules ont été traitées avec une large gamme de concentrations d’extrait éthanolique d’A. vulgaris. La détermination de la viabilité a été conduite au moyen des essais MTT et SRB après 72 h d’incubation ([ ]). Comme présenté dans [ ], l’extrait d’A. vulgaris a diminué de manière dose-dépendante la viabilité de toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude. En concordance avec les données précédentes, la viabilité des cellules primaires d’exsudat péritonéal dérivées de la cavité péritonéale de souris C57BL/6 a été entièrement préservée après traitement par l’extrait d’A. vulgaris, indiquant une forte sélectivité de l’extrait testé pour le phénotype malin.
2.2 L’extrait d’A. vulgaris induit la mort cellulaire programmée de type I et II dans la lignée cellulaire 4T1
Pour étudier le mécanisme d’action potentiel, des cellules de cancer du sein de souris (4T1) ont été traitées avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris et incubées pendant 72 h. Ensuite, l’analyse par cytométrie en flux a révélé que la majorité des cellules détectées après traitement par l’extrait d’A. vulgaris présentaient des caractéristiques d’apoptose précoce, comme le montre le profil Ann+/PI− ([ ]). L’examen microscopique a confirmé ce résultat et montré des signes morphologiques typiques d’apoptose après coloration au PI ([ ]). L’apoptose observée était accompagnée d’une activité caspase seulement légère dans les cellules traitées ([ ]). Considérant que les radicaux libres sont des médiateurs connus des lésions cellulaires qui conduisent finalement à la mort cellulaire lorsque leur production dépasse la protection redox, l’impact de l’extrait testé sur leur génération a été étudié. L’analyse cytofluorimétrique et microscopique a montré une stimulation puissante de la production intracellulaire de ROS/RNS, confirmant que ces molécules sont des médiateurs des effets cytocides observés de l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). Dans la même fenêtre temporelle, l’extrait d’A. vulgaris a fortement favorisé l’autophagie, qui a été visualisée par microscopie à fluorescence et quantifiée par cytométrie en flux ([ ]). En outre, le traitement concomitant avec l’extrait d’A. vulgaris et l’inhibiteur spécifique de l’autophagie chloroquine (20 µM) a entraîné une augmentation de la survie cellulaire d’environ 30% par comparaison avec les cellules traitées par l’extrait d’A. vulgaris seul (concentration IC50), confirmant que le processus autophagique sert de voie d’élimination cellulaire ([ ]). En résumé, l’extrait d’A. vulgaris a induit les morts cellulaires programmées de type I et de type II avec une forte poussée oxydative en arrière-plan.
2.3 L’extrait d’A. vulgaris abroge le potentiel métastatique de la lignée cellulaire 4T1
Il est largement reconnu que les cellules 4T1 présentent un taux de prolifération élevé, qui est l’une des caractéristiques étroitement liées à leur phénotype agressif. Pour explorer les effets antimétastatiques potentiels de l’extrait d’A. vulgaris, une série d’essais in vitro a été conduite. L’analyse par cytométrie en flux a révélé la perte du potentiel de division des cellules 4T1 après exposition à l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). L’évaluation de la motilité cellulaire au moyen d’un essai de cicatrisation de plaie a révélé qu’après un traitement de 48 h des cellules 4T1 avec une dose subtoxique (22,5 μg/mL) d’extrait d’A. vulgaris, la zone de plaie était significativement préservée par comparaison avec le groupe témoin ([ ]). En revanche, les cellules témoins ont complètement comblé l’espace dans la même fenêtre temporelle. La largeur moyenne de la plaie dans le témoin était de 0,11 ± 0,015 pouce contre 0,7 ± 0,02 pouce après traitement, indiquant un fort potentiel antimigratoire de l’extrait d’A. vulgaris (p = 0,000004). En parallèle, le potentiel de formation de colonies des cellules traitées a diminué d’environ 20% ([ ]). L’adhésion cellulaire à la fois aux surfaces plastiques et à la matrice extracellulaire (Matrigel®) a été fortement affectée par le traitement par A. vulgaris ([ ]). En outre, l’extrait d’A. vulgaris a réduit d’environ 60%, par rapport au témoin, la capacité des cellules 4T1 à passer à travers des pores de 8 μm avec ou sans couche de matrice extracellulaire ([ ]), confirmant que les potentiels migratoire et invasif étaient tous deux affectés.
Dans l’ensemble, la perte du potentiel de division des cellules 4T1, avec les diminutions significatives du potentiel de formation de colonies, de l’adhésion, de la migration et de l’invasion, indique le changement des caractéristiques métastatiques de ces cellules après traitement par l’extrait d’A. vulgaris.
2.4 L’extrait d’A. vulgaris régule négativement le profil d’expression protéique dans le processus métastatique
Pour confirmer au niveau intracellulaire la diminution du potentiel métastatique des cellules 4T1, l’impact de l’extrait d’A. vulgaris sur les voies de signalisation pertinentes pour la cascade métastatique a été examiné. Les données de la littérature confirment que l’invasivité et le potentiel migratoire des cellules tumorales dépendent de l’engagement des récepteurs intégrines et des cascades de signalisation en aval subséquentes. Ainsi, les cellules 4T1 ont été traitées avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris pendant 6, 12, 18, 24, 48 et 72 h, et l’expression protéique a été analysée par la méthode Western blot. Les résultats ont montré une diminution continue de l’expression relative de l’intégrine β-1, de la kinase d’adhésion focale (FAK) et de la vinculine, tandis que l’alpha-actine du muscle lisse (α-SMA), une protéine associée à un phénotype agressif, a montré une tendance similaire mais avec une signification moindre par comparaison avec les cellules non traitées ([ ]). Comme mentionné ci-dessus, la signature protéique intracellulaire a confirmé l’abolition du potentiel métastatique par l’extrait d’A. vulgaris.
2.5 L’extrait d’A. vulgaris supprime la croissance tumorale in vivo
Pour définir l’effet de l’extrait d’A. vulgaris in vivo, des tumeurs ont été induites chez des souris BALB/C par implantation orthotopique de cellules 4T1, et le traitement a commencé dès que les tumeurs sont devenues palpables. L’extrait d’A. vulgaris a significativement diminué le volume tumoral par comparaison avec le groupe témoin (p = 0,042) ([ ]). L’analyse histopathologique du tissu tumoral a montré que la quantité de nécrose était plus étendue dans le groupe traité avec l’extrait d’A. vulgaris que dans le témoin (30% et 25%, respectivement). La nécrose est survenue principalement sous forme de zones géographiques, et dans une moindre mesure sous forme de foyers nécroptotiques (environ 2% dans le groupe témoin et moins de 1% dans le groupe traité). Malgré le volume tumoral significativement réduit, aucun changement visuel des formes et tailles des cellules tumorales entre les groupes n’a été observé au microscope optique ([ ]).
Les échantillons de tissu hépatique dans les deux groupes ont montré pour la plupart les mêmes changements morphologiques. Une hématopoïèse extramédullaire sinusoïdale avec dilatation focale des veinules a été enregistrée, tandis que la présence d’inflammation ou de dégénérescence hépatocytaire n’a pas été observée. Il est important de noter que la présence de dépôts métastatiques sous-capsulaires a été détectée dans le groupe témoin mais pas dans les échantillons tissulaires du groupe traité par l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). En outre, aucun signe de toxicité tissulaire tel qu’atrophie, inflammation, œdème ou signatures de mort cellulaire n’a été observé dans l’un ou l’autre groupe. De manière similaire aux coupes hépatiques, la présence de foyers métastatiques a été détectée dans la région para-capsulaire dans quelques échantillons de tissu rénal témoin ([ ]). Les paramètres de toxicité n’ont pas été identifiés dans l’urine des animaux après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris ([ ]), ce qui concorde avec la préservation de la morphologie rénale. En résumant toutes les données obtenues, on peut conclure qu’A. vulgaris exerce un fort potentiel tumoricide avec une toxicité systémique minimale.
2.6 L’administration d’extrait d’A. vulgaris augmente le pourcentage de cellules dendritiques et les active dans la rate et le microenvironnement tumoral
Ensuite, l’impact du traitement par extrait d’A. vulgaris sur le microenvironnement tumoral a été évalué. Après induction tumorale, l’administration d’extrait d’A. vulgaris a significativement augmenté le pourcentage de cellules dendritiques CD11c+ dans la rate et la tumeur primaire, comme montré dans [ ]. Parallèlement, l’administration d’extrait d’A. vulgaris a significativement augmenté les pourcentages de cellules dendritiques CD40+ ([ ]) et MHCII+ ([ ]) ainsi que MHCII+CD86+ dans les rates de souris porteuses de tumeurs ([ ]). En ce qui concerne le microenvironnement tumoral, l’extrait d’A. vulgaris a significativement augmenté le pourcentage de cellules dendritiques CD40+ ([ ]). Une tendance similaire a été observée pour les pourcentages de cellules dendritiques MHCII+ ([ ]) et MHCII+CD86+ ([ ]).
2.7 L’extrait d’A. vulgaris déclenche une réponse immunitaire acquise dans la rate et au sein de la tumeur primaire en activant les lymphocytes T cytotoxiques
L’administration d’extrait d’A. vulgaris a significativement augmenté le pourcentage de lymphocytes T CD3+CD8+ dans les rates des souris porteuses de tumeurs ([ ]). En outre, le pourcentage de CD3+CD8+PD-1+ a été significativement diminué ([ ]). D’autre part, le pourcentage de lymphocytes T CD107a+, perforine+, granzyme+, CD3+CD8+ a été significativement augmenté dans la rate des souris porteuses de tumeurs en réponse à l’extrait d’A. vulgaris ([ ]).
Dans le microenvironnement tumoral, le pourcentage de CD3+CD8+ a été significativement augmenté chez les souris traitées ([ ]). De plus, le pourcentage de lymphocytes T CD107a+, perforine+ et granzyme+ CD3+CD8+ a également été significativement augmenté dans la tumeur primaire après administration d’extrait d’A. vulgaris ([ ]).
3 Discussion
Les données ethnobotaniques renvoient aux connaissances et pratiques traditionnelles de diverses cultures concernant l’utilisation des plantes et des remèdes à base de plantes à des fins médicinales. Tout au long de l’histoire, différentes sociétés se sont appuyées sur des connaissances héritées transmises de génération en génération pour traiter diverses affections, y compris le cancer. Le cancer du sein, étant l’un des types de cancer les plus prévalents affectant les femmes, fait également l’objet de recherches dans le monde de la médecine ethnobotanique. Les données ethnobotaniques peuvent fournir des informations précieuses et servir de point de départ à d’autres recherches scientifiques et à la découverte de nouveaux composés pouvant avoir un potentiel thérapeutique et/ou améliorer les protocoles actuels, principalement par la sensibilisation des cellules tumorales à la radio- ou chimiothérapie, ou par le renouvellement des activités des cellules immunitaires contre le phénotype malin. Il est important de noter que plusieurs plantes sont traditionnellement utilisées dans diverses cultures pour traiter les symptômes du cancer du sein et améliorer le bien-être général. Certaines d’entre elles sont des sources de médicaments utilisés avec succès dans la chimiothérapie moderne pour le traitement du cancer du sein, comme le paclitaxel. En général, une recherche scientifique rigoureuse a été nécessaire pour confirmer la sécurité et l’efficacité de ces remèdes dérivés de plantes contre le carcinome mammaire.
Les données de la littérature rapportent les effets bien connus d’Alchemilla vulgaris L. contre les troubles du système reproducteur féminin et les maladies associées, ainsi que son utilisation dans le traitement du diabète, de la sclérose en plaques, de l’anémie, des éruptions cutanées, des hernies, des ulcères, des plaies et des inflammations. Nos résultats précédents ont montré le potentiel anticancéreux de l’extrait d’A. vulgaris contre un panel de lignées cellulaires cancéreuses humaines in vitro ainsi que contre le mélanome murin de différentes agressivités in vivo.
Dans la présente recherche, l’impact de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris a été étudié sur un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, en commençant par la lignée cellulaire humaine de cancer du sein ER+ (MDA-MB-361) et en poursuivant avec des lignées cellulaires TNBC d’origine humaine (MDA-MB-468 et MDA-MB-231) et murine (4T1). En concordance avec les données précédemment rapportées, le traitement par extrait d’A. vulgaris a diminué de manière dose-dépendante la viabilité cellulaire de toutes les cellules testées observée avec les deux essais MTT et SRB. La sélectivité envers le phénotype malin a déjà été décrite, sans effet contre les cellules primaires extraites de la cavité péritonéale de souris C57BL/6. De manière concordante, Ibrahim et al. ont rapporté que l’extrait méthanolique de racine d’A. vulgaris n’avait pas d’influence sur les cellules Vero normales. Pour permettre le transfert de l’étude in vitro vers l’in vivo, l’efficacité du médicament a ensuite été testée en détail sur la lignée cellulaire de cancer du sein hautement agressive 4T1, permettant l’évaluation subséquente du potentiel antitumoral de l’extrait dans un modèle animal syngénique. Cette approche couvre de multiples aspects des influences de l’extrait sur la formation de tumeurs solides et les caractéristiques du microenvironnement tumoral. Pour atteindre cet objectif, il était essentiel de définir les principales voies d’influence directe de l’extrait en culture cellulaire. L’analyse par cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence ont montré que l’extrait d’A. vulgaris induisait l’apoptose des cellules 4T1 accompagnée d’une activation modérée des caspases, ce qui était conforme aux données précédentes montrant un mode d’action similaire sur les cellules de cancer du poumon humain (A549) et les cellules de mélanome murin hautement invasives (B16F10). Les données de la littérature rapportent de nombreux composés naturels isolés de plantes ayant un potentiel inducteur d’apoptose. L’autophagie significative observée dans les cellules 4T1 exposées à l’extrait d’A. vulgaris a été abolie par traitement concomitant avec l’inhibiteur d’autophagie chloroquine, entraînant une restauration de la viabilité cellulaire, vérifiant une fois de plus la contribution de ce processus à l’activité destructrice des cellules tumorales de l’extrait d’A. vulgaris. La forte poussée oxydative provoquée par le traitement peut être responsable des activités tumoricides du mélange de composés de l’extrait d’A. vulgaris et de leur interaction.
Les cellules 4T1 sont un modèle bien connu, considéré comme l’une des formes les plus redoutables de cancer du sein avec un fort potentiel à former des métastases à distance dans divers organes. En accord avec nos données précédentes, le traitement par extrait d’A. vulgaris a inhibé la prolifération des cellules 4T1 et réduit significativement leur capacité à combler un espace ou à migrer à travers des membranes poreuses lorsqu’elles étaient attirées par des chimio-stimuli. En outre, le potentiel des cellules 4T1 à franchir la barrière de membrane basale reconstruite a également été considérablement diminué, confirmant que le traitement affectait la capacité invasive des cellules, prédisant une pénétration diminuée des cellules après exposition à l’extrait d’A. vulgaris dans les tissus environnants in vivo. Dans l’ensemble, le prétraitement avec une dose subtoxique d’extrait d’A. vulgaris, qui n’affectait pas la viabilité des cellules 4T1, a nettement affecté toutes les caractéristiques importantes pour le processus métastatique : adhésivité, migration, invasion et potentiel de formation de colonies. Simultanément, l’expression relative des protéines intégrine β-1, FAK, vinculine et α-SMA a été inhibée par le traitement. Selon la littérature, l’adhésion à l’ECM est l’événement clé dans l’initiation de la cascade métastatique. Les protéines qui relient l’ECM au cytosquelette intracellulaire jouent un rôle important dans l’adhésion, la migration et l’invasion. La littérature soutient le fait que le potentiel migratoire des cellules et l’invasivité des tumeurs dépendent de la ligation des récepteurs intégrines et de la transmission d’un signal en aval qui relie le compartiment extracellulaire au cytosquelette intracellulaire, permettant ainsi une réponse adéquate au signal dicté depuis l’extérieur. Les protéines impliquées dans ce contact intime font partie de structures complexes appelées adhérences focales, dont la formation et la séparation sont dynamiquement régulées pendant le processus de migration cellulaire. À l’intérieur de la cellule, le cytosquelette représente un réseau protéique qui définit sa morphologie et son comportement. La surexpression de l’intégrine β-1 est un facteur de mauvais pronostic pour les patients atteints de cancer. En revanche, la régulation négative de l’intégrine β-1 est un bon signe et une réponse thérapeutique souhaitable, comme observé lors de l’exposition à l’extrait d’A. vulgaris, affectant chaque étape ultérieure du processus métastatique. La kinase d’adhésion focale est le régulateur clé de la survie, de la prolifération, de la migration et de l’invasion. Cette kinase transmet les signaux des adhérences focales à la machinerie cytosquelettique cellulaire. Il est bien connu que la surexpression de FAK est liée à une vaste gamme de cancers épithéliaux humains. En outre, le niveau d’expression de FAK est corrélé au potentiel invasif tumoral et au mauvais pronostic. En conséquence, dans cette étude, une inhibition continue de l’expression relative de FAK après traitement par A. vulgaris a été détectée. La vinculine est une partie importante de l’adhérence focale, et les perturbations de l’interaction vinculine-actine impactent la motilité, la morphologie et l’adhésion cellulaires. Sa suppression lors de l’exposition à l’extrait testé est étroitement liée aux propriétés migratoires et invasives diminuées des cellules 4T1. Enfin, A. vulgaris inhibe l’expression de l’α-SMA, la protéine associée au phénotype agressif et à la faible survie des patients atteints de formes avancées de cancer, réduisant ainsi au silence la nature agressive des cellules 4T1.
Le fait qu’une tumeur ne soit pas un simple groupe de cellules hautement proliférantes avec un phénotype anormal, mais une structure multicellulaire qui fonctionne à un niveau impressionnamment organisé, conduit à la conclusion que toute donnée in vitro a une valeur limitée jusqu’à ce qu’elle soit confirmée par un criblage in vivo adéquat. Le plus grand avantage du modèle syngénique concerne les constituants et activités préservés dans le TME, ainsi que le soutien de l’organisme entier dans la lutte contre la maladie, y compris l’immunité systémique et les activités des cellules non immunitaires pertinentes pour la réponse thérapeutique. Ainsi, l’action antitumorale de l’extrait d’A. vulgaris a été étudiée dans un modèle syngénique orthotopique de carcinome mammaire, le plus approprié pour simuler le comportement du cancer du sein de stade IV. Le régime appliqué du traitement par extrait d’A. vulgaris a conduit à une diminution significative de la croissance tumorale. De manière similaire, le même effet a été noté in vivo dans des modèles de mélanome non invasif et hautement invasif. Le TME, y compris la réponse immunitaire innée et acquise, a contribué de manière significative à l’efficacité de la thérapie antitumorale appliquée. L’évaluation de l’influence de l’extrait d’A. vulgaris sur les activités des cellules immunitaires systémiques et locales dans le TME du modèle de cancer du sein 4T1 a révélé des changements multiples et bien orchestrés, affectant la progression et la dissémination tumorales. Les cellules dendritiques sont des cellules professionnelles présentatrices d’antigène qui déclenchent et façonnent la réponse immunitaire. Lors de la reconnaissance de l’antigène, elles interagissent avec les cellules effectrices, telles que les cellules NK, NKT et les lymphocytes T, et tendent à orienter le cours ultérieur de la réponse immunitaire globale. L’importance des cellules dendritiques est également bien illustrée dans la réponse immunitaire antitumorale, car il est connu que les cellules dendritiques sont les premières cellules à rencontrer les antigènes tumoraux, migrent vers les ganglions lymphatiques et fournissent des signaux activateurs aux cellules effectrices (« cycle immunité-cancer »). Bien sûr, diverses malignités ont développé des mécanismes de défense pour échapper à la reconnaissance par les cellules dendritiques, soit en exprimant des signaux inhibiteurs, soit par altération métabolique. L’application d’extrait éthanolique d’A. vulgaris augmente significativement le pourcentage de cellules dendritiques et stimule puissamment leur maturation, ce qui est illustré par une élévation remarquable des molécules CD40, CD86 et MHCII. Des changements identiques du phénotype des cellules dendritiques ont été observés dans la rate et dans le microenvironnement tumoral. Ces résultats pourraient impliquer que l’extrait d’A. vulgaris pourrait être également important à la fois pour l’initiation et le maintien de la réponse immunitaire antitumorale au carcinome mammaire. Comme on le sait déjà, les cellules de cancer du sein 4T1 sont considérées comme faiblement à modérément immunogènes, et à ce titre, l’activation des lymphocytes cytotoxiques pourrait être entravée. Récemment, le faible nombre de cellules dendritiques et leurs formes immatures dans le tissu tumoral ont été considérés comme une autre caractéristique d’une tumeur faiblement immunogène. Les résultats présentés dans cette étude montrent que l’administration d’extrait d’A. vulgaris pourrait accroître l’immunogénicité d’une tumeur, rendant la réponse immunitaire antitumorale plus efficace. Il existe de plus en plus de preuves que les composés naturels sont de puissants inducteurs de mort cellulaire immunogène, déclenchant la libération de molécules associées au danger, et servent donc d’immunoadjuvants. Cette cascade d’événements amplifie les deux branches de la réponse immunitaire, innée et adaptative. Le puissant résultat immunogène du traitement par extrait d’A. vulgaris peut être lié à la complexité de son contenu et à l’effet pléiotrope de ses ingrédients bioactifs. En ce qui concerne les lymphocytes T cytotoxiques, l’administration d’extrait d’A. vulgaris augmente le pourcentage de cellules CD3+CD8+ dans la rate et le tissu tumoral. En plus d’une fréquence accrue des lymphocytes T cytotoxiques dans la rate et le microenvironnement tumoral, le phénotype de ces cellules est également modifié vers un phénotype plus cytotoxique, comme illustré par l’augmentation significative du marqueur de dégranulation CD107a suivie d’une augmentation significative de la production de perforine et de granzyme. En outre, l’expression du marqueur inhibiteur, PD-1, est significativement plus faible dans les lymphocytes T cytotoxiques spléniques, ce qui implique un effet positif de l’extrait d’A. vulgaris sur l’activation des lymphocytes T cytotoxiques spléniques. L’analyse histopathologique a montré une nécrose tumorale accrue dans la tumeur primaire des souris traitées par A. vulgaris. L’existence d’une nécrose tumorale peut renforcer une réponse immunitaire antitumorale, car la nécrose favorise la maturation des cellules dendritiques. L’extrait d’A. vulgaris peut stimuler l’immunité antitumorale d’au moins deux façons, en activant directement les cellules dendritiques et les lymphocytes T cytotoxiques, et indirectement via la facilitation, par la nécrose tumorale, de la maturation des cellules dendritiques, activant ensuite davantage les lymphocytes T cytotoxiques.
4 Matériels et méthodes
4.1 Réactifs et cellules
Les réactifs et les cellules ont été fournis par les fabricants listés ci-dessous : Capricorn Scientific GmbH (Hessen, Allemagne) — sérum bovin fœtal (FBS) et milieu de culture RPMI-1640 ; Sigma (St. Louis, MO, USA) — acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), solution saline tamponnée au phosphate (PBS), Triton X-100, diméthylsulfoxyde (DMSO), Fluoromount-G, trypsine, RNase, ester succinimidyl de carboxyfluorescéine diacétate (CFSE), iodure de propidium (PI), chlorhydrate de trisaminométhane (TRIS HCl), dithiothréitol (DTT), glycérol, fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), sulforhodamine B (SRB), chloroquine et orange d’acridine (AO) ; Biowest (Riverside, MO, USA) — cristal violet (CV) ; BD (Pharmingen, San Diego, CA, USA, États-Unis) — annexine V-FITC (AnnV) ; BD Bioscience (Bedford, MA, USA) — Matrigel® ; Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) — dihydrorhodamine 123 (DHR123) ; Fresenius Kabi AG Germany (Bad Homburg, Allemagne) — paclitaxel (PCT) ; Biological Industries (Cromwell, CT, USA) — solution pénicilline-streptomycine ; Serva (Heidelberg, Allemagne) — paraformaldéhyde (PFA) et N,N,NN-tétraméthyléthylènedi (TEMED) ; AppliChem (St. Louis, MO, USA) — albumine sérique bovine (BSA) et bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) ; AppliChem (Darmstadt, Allemagne) — Tween 20 et dodécylsulfate de sodium (SDS) ; R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) — ApoStat ; Lach-Ner (Neratovice, Tchéquie) — hydroxyde de sodium (NaOH). American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) — adénocarcinome mammaire humain (MDA-MB-231, MDA-MB-468 et MDA-MB-361).
Les cellules de cancer du sein de souris (4T1) ont été fournies comme don par le Prof. Dr. Ludger Wessjohan de l’Institut Leibniz de biochimie végétale, Halle (Saale), Allemagne. Cette lignée cellulaire avait été principalement achetée auprès de l’ATCC.
Toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude ont été entretenues de routine dans un milieu RPMI-1640 tamponné par HEPES. Le milieu a été supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 0,01% de pyruvate de sodium, pénicilline et streptomycine (100 unités/mL et 100 μg/mL, respectivement) et 10% de FBS inactivé par la chaleur. Les cellules ont été conservées dans l’incubateur (37 °C, 5% CO2). Pour la détermination de la viabilité en plaques 96 puits, les cellules ont été ensemencées aux densités suivantes : cellules 4T1, MDA-MB-361 et MDA-MB-468 (4 × 10^3 cellules/puits), et cellules MDA-MB-231 (7 × 10^3 cellules/puits). Pour la cytométrie en flux, les cellules 4T1 ont été ensemencées en plaques 6 puits à une densité de 1 × 10^5 cellules/puits.
La composition chimique détaillée de l’extrait éthanolique d’Alchemilla vulgaris L. utilisé dans cette étude et le processus d’extraction étaient tels que rapportés précédemment. Le matériel végétal a été collecté dans l’habitat naturel de l’espèce : la prairie vallonnée-montagneuse modérément humide dans la partie sud-est de la Serbie. Les parties végétales mentionnées ci-dessus ont été collectées en phase de floraison. Des échantillons typiques ont été identifiés taxonomiquement et conservés comme spécimens voucher (No. RS-120718-1). Le matériel végétal a été séché à l’air et extrait pendant deux heures dans de l’éthanol chaud. La composition chimique des extraits solides évaporés sous vide a été déterminée par UHPLC-HRMS. Au total, 45 composés ont été identifiés, appartenant principalement aux glycosides de flavonols et de flavones, avec une dominance de dérivés de quercétine et de kaempférol. La solution mère éthanolique d’A. vulgaris a été dissoute dans du DMSO pur (100%) à une concentration de 200 mg/mL. La solution mère a été préparée fraîchement avant chaque utilisation et la concentration finale de DMSO dans les solutions de travail ne dépassait pas 0,1% (in vitro) ou 4% (in vivo) à la concentration la plus élevée.
4.2 Animaux
Les souris utilisées dans cette étude (souche BALB/C, âgées de six à huit semaines, femelles) ont été obtenues auprès de l’Institut de recherche biologique « Siniša Stanković » — Institut national de la République de Serbie, Université de Belgrade. Les animaux ont été maintenus dans l’animalerie dans des conditions de laboratoire standard (exempts de pathogènes spécifiques, nourriture et eau ad libitum). La manipulation des souris et les protocoles utilisés dans l’étude in vivo étaient alignés sur les règles des lignes directrices de la Communauté européenne (Directive CEE de 1986 ; 86/609/CEE). De plus, le comité local institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) a autorisé tous les protocoles de l’étude. Enfin, les protocoles expérimentaux ont été autorisés et accordés par le comité national d’agrément du Département du bien-être animal, Direction vétérinaire, du ministère de l’Agriculture, des Forêts et de la Gestion de l’eau de la République de Serbie (permission No. 323-07-12008/2020-05).
4.3 Essais colorimétriques de viabilité cellulaire
L’activité de la déshydrogénase mitochondriale a été évaluée par la réduction du MTT en formazan. Toutes les cellules ont d’abord été ensemencées pendant la nuit puis exposées à l’extrait d’A. vulgaris et au PCT (comme témoin positif). Après la période d’incubation (72 h), les cellules ont été lavées deux fois avec 200 μL de PBS et cultivées en présence de solution de MTT à une concentration finale de 0,5 mg/mL, puis maintenues dans l’incubateur (37 °C) jusqu’à ce que la solution passe du jaune au brun. Ensuite, le colorant a été retiré et du DMSO a été ajouté pour dissoudre le formazan formé. À l’aide d’un lecteur automatique pour plaques de microtitration (LKB 5060-006, LKB, Vienne, Autriche), l’absorbance a été mesurée à 540/670 nm. La viabilité cellulaire a ensuite été exprimée en pourcentage par rapport au témoin (cellules non traitées). Toutes les expériences ont été répétées trois fois indépendamment.
Pour l’essai SRB, après traitement avec l’extrait d’A. vulgaris et le PCT (comme témoin positif) pendant 72 h, les cellules ont été lavées au PBS avant fixation avec 10% de TCA pendant 2 h à 4 °C. Ensuite, les cellules ont été rincées à l’eau distillée et colorées avec une solution de SRB à 0,4% pendant 30 min à RT. Après la période d’incubation, le colorant a été dissous dans de l’acide acétique à 1%, lavé et laissé à sécher pendant la nuit. Enfin, le colorant a ensuite été dissous dans un tampon tris 10 mM pendant 20 min. L’absorbance a été mesurée au moyen d’un lecteur automatique pour plaques de microtitration (LKB 5060-006, LKB, Vienne, Autriche) à 540/670 nm. La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage des cellules témoins non traitées, fixé arbitrairement à 100%. Toutes les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. Les courbes dose-réponse ont été construites par analyse de régression non linéaire dans le logiciel GraphPad Prism 10.1.2 (San Diego, CA, USA). Les valeurs IC50, définies comme une réduction de 50% de la viabilité cellulaire, ont été calculées au moyen du logiciel SigmaPlot 15 et de Microsoft Excel 2013 avec la fonction logistique à quatre paramètres.
Un traitement combiné avec l’extrait d’A. vulgaris et la chloroquine (inhibiteur de l’autophagie) a été réalisé pour évaluer la nature de l’autophagie détectée. Les cellules 4T1 ont été ensemencées pendant la nuit et traitées avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris (45 μg/mL) et de chloroquine (20 µM) simultanément. Après 72 h d’incubation, la viabilité cellulaire a été évaluée au moyen de l’essai SRB.
4.4 Détection de l’apoptose (coloration Ann/PI)
Afin de détecter l’apoptose, les cellules 4T1 ont été ensemencées pendant la nuit et traitées avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris (45 μg/mL). Après 72 h d’incubation, les cellules ont été trypsinisées et colorées avec annexine V-FITC/PI (15 μg/mL) pendant 15 min à RT dans l’obscurité. Ensuite, un tampon de liaison annV (ABB) a été utilisé pour la remise en suspension des cellules 4T1. Enfin, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (CyFlow® Space Partec et logiciel PartecFloMax® 2.52 (Münster, Allemagne)).
4.5 Activation des caspases
Pour la détection de l’activation des caspases, les cellules 4T1 ont été ensemencées pendant la nuit et exposées à une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris (45 μg/mL). Après la période d’incubation (72 h), les cellules trypsinisées ont été colorées avec un inhibiteur pan-caspase (apostat) et incubées pendant 30 min à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées, remises en suspension dans du PBS et analysées avec le cytomètre en flux CyFlow® Space Partec au moyen du logiciel PartecFloMax® 2.52 (Münster, Allemagne).
Alternativement, les cellules 4T1 ont été ensemencées dans une lame à quatre chambres (Millicell® EZ SLIDES, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) à une densité de 5 × 10^3 cellules/puits et laissées adhérer pendant la nuit, suivies d’une exposition à l’extrait d’A. vulgaris (concentration IC50) et d’une incubation de 72 h. Enfin, les cellules ont été colorées par coloration apostat et analysées par microscopie à fluorescence à un grossissement de 400× avec un Leica DM4 B équipé d’une caméra de microscope DFC7000 T (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Allemagne).
4.6 Détection de l’autophagie
Les cellules 4T1 ont été ensemencées pendant la nuit et exposées à une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris (45 μg/mL). Après la période d’incubation de 72 h, les cellules ont été colorées pendant 15 min à 37 °C avec 10 µM de solution d’AO. Le colorant a été retiré par lavage avec du PBS. Enfin, les cellules ont été remises en suspension avec du PBS et analysées avec le cytomètre en flux CyFlow® Space Partec au moyen du logiciel PartecFloMax® 2.52 (Münster, Allemagne).
De plus, les cellules 4T1 ont été analysées par microscopie à fluorescence après traitement avec une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris. Les cellules ont été ensemencées pendant la nuit dans la lame à quatre chambres (Millicell® EZ SLIDES, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) à une densité de 5 × 10^3 cellules/puits et exposées à l’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Après la période d’incubation, le traitement a été éliminé et les cellules ont été lavées avec du PBS, suivies d’une incubation de 15 min avec coloration AO à une concentration finale de 10 µM. Enfin, les cellules ont été lavées avec du PBS et évaluées par microscopie à fluorescence à un grossissement de 400× au moyen du Leica DM4 B équipé d’une caméra de microscope DFC7000 T (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Allemagne).
4.7 Détection de la prolifération cellulaire
Les cellules 4T1 ont été précolorées avec du CFSE (1 μM) et maintenues dans l’incubateur pendant 10 min à 37 °C. Après la période d’incubation, du milieu 10% FBS-RPMI a été ajouté et les cellules ont été centrifugées, lavées avec du PBS, remises en suspension dans le milieu, ensemencées et exposées à une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris (45 μg/mL). Après la période d’incubation de 72 h, les cellules 4T1 ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et analysées avec le cytomètre en flux CyFlow® Space Partec au moyen du logiciel PartecFloMax® 2.52 (Münster, Allemagne).
4.8 Évaluation de la production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS)
À l’aide du colorant sensible au redox DHR123, la production de ROS/RNS a été détectée. Avant l’ensemencement, les cellules 4T1 ont été colorées avec DHR123 (1 μM) et incubées pendant 20 min à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été exposées à une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris. Après la période d’incubation de 72 h, les cellules ont été lavées avec du PBS, trypsinisées et analysées avec le cytomètre en flux CyFlow® Space Partec au moyen du logiciel PartecFloMax® 2.52 (Münster, Allemagne).
Afin de détecter par microscopie à fluorescence la production de ROR/RNS dans les cellules 4T1 après exposition à l’extrait d’A. vulgaris (concentration IC50), les cellules ont été précolorées avec DHR123 à une concentration finale de 1 µM, ensemencées dans une lame à quatre chambres (Millicell® EZ SLIDES, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) à une densité de 5 × 10^3 cellules/puits, laissées adhérer pendant la nuit et traitées avec l’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Enfin, les cellules ont été lavées avec du PBS et analysées à un grossissement de 400× au moyen d’un Leica DM4 B équipé d’une caméra de microscope DFC7000 T (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Allemagne).
4.9 Coloration à l’iodure de propidium (PI) sur lames à chambres
Pour l’analyse par microscopie à fluorescence, les cellules 4T1 ont été ensemencées pendant la nuit sur des lames de microscope en verre stériles à 4 chambres (Millicell® EZ SLIDES, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) à une densité de 3 × 10^4 cellules/puits dans 400 µL de milieu. Ensuite, les cellules 4T1 ont été exposées à une concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris et incubées pendant 72 h. Après incubation, le surnageant a été éliminé des chambres, les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, puis elles ont été fixées dans du PFA à 4% pendant 15 min à RT. Par la suite, les cellules ont été lavées plusieurs fois dans du PBS et colorées avec une solution de 50 μg/mL de PI, 0,1 mM d’EDTA pH 8,0, 85 μg/mL de RNase et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1–2 min. Enfin, un milieu de montage fluorescent (Fluoromount-G) a été utilisé pour recouvrir les lames. Un microscope à fluorescence inversé Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) a été utilisé pour l’analyse des lames formées à un grossissement de 400×.
4.10 Essai clonogénique — essai de formation de colonies
L’évaluation de la capacité des cellules 4T1 à former des colonies in vitro après traitement avec une concentration subtoxique d’extrait d’A. vulgaris impliquait une évaluation au moyen d’un essai clonogénique (formation de colonies). Les cellules 4T1 ont été cultivées en monocouche dans des flacons de 75 cm^2, exposées à une concentration subtoxique (22,5 μg/mL) d’extrait d’A. vulgaris et incubées pendant 72 h. Après la période d’incubation, les cellules ont été trypsinisées, comptées et ensemencées à un faible nombre de cellules par puits (1 × 10^3 cellules/puits) dans des plaques 6 puits. Les cellules 4T1 ont été autorisées à croître et à former des colonies pendant 7 jours, avec un changement de milieu le quatrième jour. Après la période d’incubation, le milieu a été éliminé et les colonies formées ont été lavées avec du PBS puis fixées (PFA à 4% pendant 30 min à RT). Les colonies ont finalement été colorées avec une solution de CV à 0,02% à RT pendant 15 min. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS pour retirer le colorant restant. La quantification des colonies a été réalisée au moyen du logiciel d’analyse ImageJ 1.51j8. Afin de calculer l’efficacité d’ensemencement (PE) et la fraction survivante (SF), la valeur moyenne du nombre de colonies obtenues à partir de trois puits a été utilisée. La PE, qui est une mesure du nombre de colonies formées à partir de cellules individuelles, a été calculée comme le nombre de colonies comptées divisé par le nombre de cellules plantées × 100. La SF a été calculée comme la PE des cellules traitées divisée par la PE des cellules témoins × 100 et représentée graphiquement en pourcentage.
4.11 Essai de cicatrisation de plaie (scratch)
Le test de rayure, dans lequel les cellules présentent une migration bidirectionnelle depuis les bords d’une plaie de rayure, a été utilisé pour l’évaluation de la motilité des cellules. Après atteinte de la confluence des cellules 4T1 dans les plaques 6 puits, une rayure a été tracée avec un embout de pipette stérile (200 μL) à travers le centre des puits pour créer une zone de plaie nette. Après création de la plaie, les cellules ont été lavées plusieurs fois avec du PBS afin de retirer les cellules endommagées puis exposées à une dose subtoxique (22,5 μg/mL) d’extrait d’A. vulgaris pendant 48 h. Après la période d’incubation, les cellules ont été lavées, fixées avec du PFA à 4% pendant 30 min à RT, colorées avec 0,02% de solution de CV pendant 15 min et photographiées numériquement avec un stéréomicroscope Nikon (SMZ800N, Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA) à un grossissement de 6×.
4.12 Essai de quantification de l’adhésion cellulaire in vitro
Pour l’évaluation de l’adhésion cellulaire in vitro, les cellules 4T1 ont été ensemencées dans des flacons de 75 cm^2 et traitées avec une dose subtoxique (22,5 μg/mL) d’extrait d’A. vulgaris. À 72 h, les cellules ont été trypsinisées, récoltées et laissées pendant 30 min à RT pour reconstruire les membranes cellulaires. Des plaques stériles 96 puits ont été pré-enduites avec 20 μg/mL de Matrigel® (50 μL/puits) et laissées à 4 °C pendant la nuit pour polymériser. Les puits enduits de gel ont été lavés 3 fois avec du PBS, puis les cellules ont été ensemencées (3 × 10^4 cellules/puits). En parallèle, l’adhésion cellulaire a été estimée sur plastique (plaques 96 puits non enduites de Matrigel®). Ensuite, les cellules ont été maintenues à 37 °C pendant 1 h pour adhérer. Les cellules qui ne s’étaient pas attachées dans cette fenêtre temporelle ont été retirées par lavage au PBS, tandis que le nombre de cellules adhérentes restantes a été déterminé par essai SRB. L’adhésion cellulaire relative a été évaluée en mesurant l’absorbance à 570/670 nm au moyen d’un lecteur automatique de plaques de microtitration.
4.13 Essais de quantification de la migration et de l’invasion cellulaires in vitro
Pour l’évaluation quantitative de l’influence du traitement par extrait d’A. vulgaris sur la migration et le potentiel invasif des cellules 4T1 in vitro, des essais de transmigration et d’invasion ont été utilisés. À ces fins, des inserts d’un diamètre de 6,4 mm et d’un diamètre de pores de 8 μm ont été placés dans des plaques stériles 24 puits. Afin de réaliser l’essai d’invasion, la surface membranaire supérieure de ces inserts a été recouverte d’une fine couche de Matrigel® (500 μg/mL dans PBS, 20 μL/membrane) qui a été autorisée à polymériser à 4 °C pendant la nuit, tandis que pour l’essai de migration, la membrane est restée non couverte de Matrigel®. Les cellules 4T1 ont été cultivées dans des flacons de 75 cm^2 et exposées à une dose subtoxique d’extrait d’A. vulgaris (22,5 μg/mL) pendant 72 h. Avant que les cellules 4T1 ne soient ensemencées, les inserts enduits de gel polymérisé ont été lavés deux fois avec du PBS. Après incubation, les cellules ont été trypsinisées, puis 7 × 10^4 cellules ont été remises en suspension dans 200 μL de milieu 0,1% BSA-RPMI et ensemencées dans la partie supérieure de chaque puits. Comme chimioattractant pour les cellules, du 10% FBS-RPMI a été utilisé, versé depuis l’extérieur des chambres, précisément dans les puits de la plaque de culture cellulaire. Les plaques 24 puits ont ensuite été incubées à 37 °C pendant 3 h pour évaluer l’invasivité et la migration. Les cellules qui n’avaient pas migré à travers les pores de la membrane (dans l’essai de migration) ou la couche de matrice extracellulaire (dans l’essai d’invasion) ont été méticuleusement éliminées à l’aide de cotons-tiges. À l’inverse, les cellules envahissantes ou migrantes ont subi une fixation avec du PFA à 4% pendant 10 min puis ont été colorées avec une solution de CV à 0,02% pendant 20 min à RT. Après coloration, les cellules ont été lavées avec H2O, séchées à l’air, puis les membranes ont été détachées des chambres et montées sur des lames de microscope. Les cellules ont été observées et photographiées numériquement au moyen de l’imageur cellulaire fluorescent ZOE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Le nombre moyen de cellules de 5 champs indépendants choisis au hasard sur chaque membrane est montré. Chaque expérience a été conduite en triplicat.
4.14 Induction des cellules 4T1 et traitement expérimental in vivo
Afin d’évaluer l’effet de l’extrait d’A. vulgaris in vivo, des tumeurs ont été induites par implantation orthotopique de cellules 4T1 (2 × 10^4 dans 50 μL de PBS) dans le quatrième coussinet adipeux mammaire droit de souris femelles de la souche BALB/C. À l’apparition de la tumeur (10 jours après l’induction tumorale), les souris ont été traitées avec l’extrait d’A. vulgaris par injection i.p. (50 mg/kg de poids corporel dans 4% DMSO/PBS), selon un régime de 5 jours de traitement, 2 jours de pause. Le groupe témoin a reçu un traitement par véhicule (4% DMSO/PBS). Les animaux ont été sacrifiés 23 jours après l’implantation tumorale, les tumeurs ont été collectées et leur volume a été calculé au moyen de la formule : (longueur × largeur^2) × 0,52.
4.15 Histopathologie
Après 23 jours d’expérience in vivo, les animaux ont été sacrifiés par dislocation cervicale et les tumeurs, reins et foies ont été examinés macroscopiquement, isolés et fixés dans du formol tamponné à 10% de pH neutre, pendant 24 h. Tous les tissus ont ensuite été sectionnés à travers le plus grand plan tissulaire et fixés en plus pendant 24 h. Le traitement tissulaire a été réalisé dans un processeur tissulaire automatisé (Milestone SRL LOGOS ONE, Sorisole, BG, Italie). Ensuite, à l’aide de la console d’inclusion (SAKURA Tissue-Tek TEC 5, Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), les tissus ont été inclus dans des blocs de paraffine. L’épaisseur des coupes tissulaires était de 4 µm et a été obtenue avec un microtome LEICA RM 2245 (Leica Biosystems, Nussloch, Allemagne). Puis, les coupes tissulaires ont été montées sur lames de verre et une coloration hématoxyline-éosine (H/E) a été appliquée au moyen du colorateur automatique de lames MYREVA SS-30H (Especialidades Médicas MYR, S.L., Tarragone, Espagne). Pour l’analyse histopathologique des lames, un microscope Olympus BX43 (OLYMPUS EUROPA HOLDING GMBH, Hambourg, Allemagne) a été utilisé. À des fins d’analyse et de documentation, un scanner de lames Leica Aperio AT2 (Leica Biosystems, Nussloch GmbH, Allemagne) a en outre été utilisé. De plus, pour l’analyse morphométrique des lames virtuelles, Leica AperioImageScope (version 12.4.6, Leica Biosystems, Nussloch GmbH, Allemagne) et le logiciel FIJI-ImageJ 1.51j8 ont été utilisés.
4.16 Analyse Western blot
Les cellules 4T1 ont été traitées avec la concentration IC50 d’extrait d’A. vulgaris pendant des périodes de 6, 12, 18, 24, 48 et 72 h. Après incubation, les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse protéique qui contenait 62,5 mM Tris-HCL pH 6,8, 10% de glycérol, 50 mM de dithiothréitol et 2% p/v de SDS. La méthode de Lowry a été utilisée pour mesurer le contenu protéique. Ensuite, les lysats cellulaires (30 μg) ont été séparés sur un gel de SDS-polyacrylamide à 12% avec un marqueur de poids moléculaire protéique (échelle PageRuler précolorée (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)). Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) au moyen d’un transfert semi-sec (Fastblot B43 ; BioRad, Göttingen, Allemagne). Après transfert, les membranes ont subi un blocage avec 5% de BSA dans du PBS contenant 0,1% de Tween 20 pendant 1 h à RT, puis ont été sondées avec un anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C. Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires (IgG-HRP de chèvre anti-lapin et IgG-HRP bovine anti-souris (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)) pendant 1 h. La présence de bandes a été confirmée avec un système d’imagerie iBright™ FL1500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et analysée au moyen du logiciel iBright Analysis 5.2.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Dans cette étude, les anticorps primaires suivants ont été utilisés : β-actine (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), intégrine β-1, FAK, vinculine et alpha-actine du muscle lisse (α-SMA) (Elabscience Biotechnology Inc., Huston, TX, USA).
4.17 Préparation des suspensions unicellulaires et analyse par cytométrie en flux
Afin d’obtenir les suspensions unicellulaires de la rate, une dispersion mécanique a été utilisée. Dans le même temps, comme décrit précédemment, une digestion enzymatique a été utilisée afin d’obtenir les suspensions unicellulaires des tumeurs primaires. Des anticorps anti-souris marqués par fluorochrome et spécifiques de CD11c, CD40, MHCII, CD86, CD3, CD8, PD-1, ou des témoins appariés par isotype (BD Pharmingen, NJ/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ont été utilisés. Pour la coloration intracellulaire, du phorbol 12-myristate 13-acétate (50 ng/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), de l’ionomycine (500 ng/mL, Sigma-Aldrich) et du GolgyStop (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA) ont été utilisés pour la stimulation pendant 4 h. Enfin, les cellules ont été colorées avec des anticorps anti-souris marqués par fluorochrome spécifiques de la perforine, CD107a et granzyme (BD Pharmingen/BioLegend/eBiosciences), et 2 × 10^4 à 5 × 10^4 cellules ont été acquises pour l’analyse FACS. La cytométrie en flux a été réalisée au moyen d’un cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), et les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo 10.0.7r2.
4.18 Analyse statistique
Le progiciel statistique Statistica 12 (Informer Technologies, Inc., Los Angeles, CA, USA) a été utilisé pour l’analyse des données. La signification entre les groupes a été évaluée par test t de Student ou alternativement par ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de différence honnêtement significative (HSD) de Tukey, et des valeurs p bilatérales inférieures à 0,05 ont été considérées comme indiquant une signification statistique. Pour les expériences in vivo, un test non paramétrique U de Mann-Whitney a été utilisé.
5 Conclusions
Le potentiel antitumoral de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris évalué dans le modèle TNBC in vitro et in vivo présente un ensemble d’activités bien orchestrées influençant la viabilité des cellules néoplasiques, le potentiel métastatique et l’expression de protéines impliquées dans le dialogue croisé entre l’ECM et le cytosquelette intracellulaire. L’efficacité globale de cet extrait végétal est en outre connectée à sa capacité à provoquer l’immunogénicité des cellules tumorales grâce à un potentiel accru de présentation de l’antigène par les cellules dendritiques et à la quantité/efficacité des lymphocytes cytotoxiques dans le microenvironnement tumoral et la rate, limitant ainsi la progression et la dissémination tumorales. En conséquence, l’extrait d’A. vulgaris a efficacement supprimé la croissance tumorale chez des souris BALB/C syngéniques par de multiples activités aux niveaux local et systémique, pertinentes pour la progression et la propagation tumorales, suggérant l’importance d’investigations supplémentaires dans le domaine de la biologie et du traitement avancés du cancer. Indépendamment du fait que cet extrait et d’autres extraits ne peuvent pas être acceptés comme thérapie standard en raison de leur complexité ainsi que du manque de contrôle qualité strict pendant la préparation, les résultats de cette étude peuvent constituer une bonne base pour l’identification de nouveaux composants ou de traitements combinés dont l’effet peut être amplifié par de nouvelles stratégies d’administration telles que la nanotechnologie. L’effet immunogène évident du traitement appliqué peut servir de sensibilisant pour les thérapeutiques standard au moyen de protocoles combinés ou de thérapies néoadjuvantes.