Profil phytochimique et activité anticancéreuse d’Anthemis tinctoria et d’Angelica sylvestris utilisées dans l’ethnomédecine estonienne
Source — PMCID : PMC9003001 · DOI : 10.3390/plants11070994 · Plants (2022) · Type : texte intégral
Note : cette étude porte conjointement sur deux espèces, Anthemis tinctoria (anthémis des teinturiers) et Angelica sylvestris (angélique des bois). Les données ci-dessous concernent les deux plantes ; elles sont conservées telles quelles pour rester fidèles à la source.
Objectif
Les parties aériennes d’Anthemis tinctoria L. et d’Angelica sylvestris L., ainsi que les racines d’A. sylvestris, ont été employées comme remèdes anticancéreux traditionnels dans l’ethnomédecine estonienne. L’étude visait à examiner la teneur en huiles essentielles (par chromatographie en phase gazeuse) et en composés polyphénoliques (au moyen de deux méthodes différentes de chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse, HPLC–MS) des deux espèces, ainsi que les effets anticancéreux in vitro de leurs huiles essentielles et de leurs extraits méthanoliques.
Selon l’estimation de l’Organisation mondiale de la santé, les quelque 12,7 millions de nouveaux cas de cancer survenus dans le monde en 2008 devaient passer à 21,3 millions d’ici 2030. Lorsque les plantes à activité anticancéreuse marquée utilisées dans l’ethnomédecine estonienne ont été étudiées, 44 espèces aux propriétés anticancéreuses potentielles ont été mises en évidence ; cinq d’entre elles — Anthemis tinctoria L., Angelica sylvestris L., Pinus sylvestris L., Sorbus aucuparia L. et Prunus padus L. — n’avaient pas été décrites auparavant dans la littérature scientifique quant à leur activité tumoricide. Par la suite, l’activité anticancéreuse de l’huile essentielle et de l’extrait méthanolique des aiguilles de P. sylvestris et de l’écorce de S. aucuparia a été étudiée. La présente étude s’est concentrée sur A. tinctoria (anthémis des teinturiers) et A. sylvestris (angélique des bois). Les deux espèces, qui poussent spontanément en Estonie, n’ont été utilisées que dans la médecine populaire locale et des régions voisines. Seules quelques études ont été publiées sur leur composition chimique, principalement sur la composition des huiles essentielles et des polyphénols.
La teneur en huile essentielle de l’herbe d’A. tinctoria est d’environ 0,1 %. Les principaux composés de l’huile essentielle sont l’α-eudesmol, le γ-cadinol, le γ-cadinène, l’acide décanoïque, le T-muurolol, le 1,8-cinéole et le β-pinène. De l’acide chlorogénique, de l’acide gentisique et de l’acide rosmarinique, ainsi que les flavonoïdes apigénine-7-glucoside, patulétine et quercétine, ont été trouvés dans les parties aériennes d’A. tinctoria. Un nouveau flavonoïde, la tinctoside, a été identifié. Quinze aglycones flavonoïdiques, douze glycosides et un caféoyl-O-flavonoïde ont été identifiés dans les extraits d’A. tinctoria. Les racines d’A. sylvestris contiennent 0,16 % d’huile essentielle, les fleurs 0,52 %, les feuilles 0,08 %, et les graines d’A. sylvestris contiennent 1,1 % d’huile essentielle dont les principaux constituants sont le limonène, l’α-pinène, le myrcène, le β-phellandrène, l’α-hamrigène et le β-sesquiphellandrène. L’huile essentielle des racines contient surtout des sesquiterpénoïdes, tandis que celle des graines contient des monoterpénoïdes. Des quantités modérées de composés phénoliques, et une faible quantité de flavonoïdes, ont été trouvées dans l’herbe d’A. sylvestris, mais leur composition exacte est inconnue.
Méthodes
Matériel végétal. Les herbes d’A. tinctoria ont été récoltées en juillet 2019 dans le Võrumaa, en Estonie (57,41594° ; 26,504845°). Les herbes et racines d’A. sylvestris ont été récoltées en juillet et septembre 2019 dans le Valgamaa, en Estonie (57,992805° ; 26,110812°). Le matériel végétal a été séché dans un endroit bien ventilé, à température ambiante, en l’espace de 10 jours. Les tiges ont été séparées du matériel séché, et le mélange restant de fleurs, feuilles et tiges plus fines a été analysé (195–200 g de chaque). Des spécimens de référence ont été déposés dans la collection de l’herbier de l’Institut de pharmacie, Faculté de médecine, Université de Tartu, sous les numéros d’acquisition AstA.t.1 et ApiA.s.1.
Hydrodistillation de l’huile essentielle. Les huiles essentielles ont été isolées des parties aériennes séchées d’A. tinctoria, ainsi que des parties aériennes et des racines d’A. sylvestris, par la méthode d’hydrodistillation modifiée décrite dans la Pharmacopée européenne, en utilisant 20–45 g de matériel végétal, un ballon à fond rond de 500 mL et 400 mL d’eau comme liquide de distillation, avec ajout de 0,5 mL de xylène dans le tube gradué pour recueillir l’huile essentielle. La durée de distillation était de 3 h à un débit de 3–4 mL/min. Pour améliorer les analyses chromatographiques successives, l’hexane a été utilisé à la place du xylène. Chaque matériel végétal a été distillé cinq fois afin d’obtenir une quantité suffisante d’huile essentielle pour les études anticancéreuses.
Extraits secs méthanoliques. Les extraits méthanoliques ont été préparés par double macération : 200 mL de méthanol ajoutés à 10 g d’échantillon broyé, laissés à l’obscurité à température ambiante pendant 72 h. Après filtration, le résidu végétal a été remis dans le ballon avec 100 mL de méthanol et laissé à l’obscurité pendant 24 h. Après filtration, les deux extraits méthanoliques ont été réunis. Le solvant a été évaporé au rotavapor dans un bain d’eau à 60 °C, rotation du ballon à 70 tr/min. La pression a d’abord été réduite à 300 mmHg, puis lentement portée à 10 mmHg jusqu’à évaporation complète du méthanol. Les extraits secs obtenus ont été conservés au congélateur et redissous dans 5 mL de méthanol avant analyse.
Analyse chromatographique en phase gazeuse. L’analyse GC des principaux composés de l’huile essentielle a été réalisée sur un chromatographe Agilent GC 7890a (logiciel Agilent Open Lab CDS ChemStation) avec détecteur FID sur deux colonnes capillaires en silice fondue de phases stationnaires DB-5 et HP-Innowax (30 m × 0,25 mm chacune). Le gaz vecteur était l’hydrogène avec un rapport de division 1:150 et un débit de 30 mL/min. Le programme de température allait de 50 à 250 °C à 2,92 °C/min, la température d’injecteur étant de 250 °C. L’identification des composants s’est faite par comparaison de leurs indices de rétention. La teneur (%) des composants a été déterminée à partir des temps de rétention moyens et des aires de pic de quatre chromatogrammes parallèles.
HPLC des composés polyphénoliques. Les composés de l’extrait sec méthanolique ont été séparés sur colonne à phase inverse Zorbax 300SB-C18 (2,1 × 150 mm ; 5 µm), thermostatée à +35 °C. Phase mobile A : acide formique 0,1 % dans l’eau ; phase mobile B : acétonitrile. Débit 0,3 mL/min, volume d’injection 5 µL, élution par gradient par paliers. La détection a été réalisée par piège à ions (1100 series LC/MSD Trap-XCT, Agilent) avec ionisation par électronébulisation en mode négatif. Les composants polyphénoliques ont été identifiés par temps de rétention HPLC et fragments MS/MS, comparés aux données de la littérature et à une base de données interne. Une seconde évaluation du profil phénolique a été menée par UPLC–MS/MS (système Aquity H-class, colonne YMC Triart C18 100 × 2,0 mm 1,9 µm, 40 °C), avec spectromètre de masse à triple quadripôle (Xevo, Waters), source d’ionisation par électronébulisation en mode négatif.
Cytotoxicité. Des lignées de cellules cancéreuses humaines — carcinome hépatocellulaire HepG2, carcinome gastrique MKN7, carcinome du côlon SW480, carcinome de la prostate LNCaP et carcinome de la bouche KB — ont été cultivées en milieu DMEM ou RPMI-1640 supplémenté de 10 % de sérum bovin fœtal, à 37 °C sous atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone. Les extraits secs méthanoliques ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer des solutions mères à 4 mg/mL, ensuite mélangées au milieu de culture. Les concentrations finales testées étaient de 0,8, 4, 20 et 100 μg/mL. Les effets des huiles essentielles et des extraits sur la viabilité des cellules malignes ont été déterminés par le test cytotoxique à la sulforhodamine B. L’ellipticine, agent anticancéreux puissant, a servi de témoin positif.
Résultats
Teneur et composition des huiles essentielles. Le rendement moyen (n = 5 échantillons) en huiles essentielles était respectivement de 0,15 %, 0,13 % et 0,17 % pour les parties aériennes d’A. tinctoria, les parties aériennes d’A. sylvestris et les racines d’A. sylvestris. Les principaux composants de l’huile essentielle des parties aériennes d’A. tinctoria étaient l’acide palmitique (15,3 %), le p-cymène (12,6 %) et l’α-muurolène (12,5 %), les autres composés étant présents à moins de 10 %. Les ocimènes (Z et E), l’isobornéol, l’acétate de chrysanthényle, l’époxyde d’humulène, la 2-pentadécanone et l’acétate de nérolidone ont été trouvés pour la première fois dans l’huile essentielle d’A. tinctoria. Les composés principaux de l’huile essentielle des parties aériennes d’A. sylvestris étaient l’α-pinène (45,4 %), le p-cymène (15,5 %) et le β-myrcène (13,3 %), tandis que l’oxyde d’isocaryophyllène (31,9 %), l’α-bisabolol (17,5 %) et l’α-pinène (12,4 %) étaient les principaux constituants de l’huile de racine de cette même plante. L’huile essentielle des parties aériennes d’A. sylvestris contenait davantage de monoterpènes et de monoterpènes cycliques, mais moins de sesquiterpènes et de sesquiterpènes bicycliques, que l’huile hydrodistillée des racines.
Identification des composés polyphénoliques. Par les deux méthodes, 41 composés phénoliques ont été identifiés dans l’herbe d’A. tinctoria, 21 à 23 dans A. sylvestris, et 10 composés dans les racines d’A. sylvestris. Les plus abondants étaient des dérivés de l’acide caféique, de l’acide quinique et de la quercétine. Dans l’extrait de racine d’A. sylvestris, les 10 composés polyphénoliques détectés étaient surtout dominés par l’acide chlorogénique, l’acide quinique et la naringénine. Les substances communes aux herbes et aux racines analysées étaient la naringénine, l’acide chlorogénique, la quercétine et les acides coumarylquiniques. Les racines d’A. sylvestris contiennent un certain nombre de composés phénoliques en quantités notables restés non identifiés ; certains présentent un maximum d’absorption UV proche de 306 nm évoquant des hydroxystilbènes tels que le resvératrol ou le picéatannol, et six composés présentent un fragment de collision négatif à m/z = 201.
Les principaux polyphénols des parties aériennes d’A. tinctoria étaient les acides caféoylquinique (chlorogénique) et dicaféoylquiniques, ainsi que plusieurs glycosides de quercétine et de patulétine ; dans les parties aériennes d’A. sylvestris se trouvaient également des acides chlorogénique et caféoylquiniques et différents glycosides de quercétine. Les principaux polyphénols des racines d’A. sylvestris étaient l’acide néo-chlorogénique, des glucosides d’acide caféique, l’acide féruloylquinique et la naringénine avec la chalcone de naringénine. La teneur totale en polyphénols (TPC) des parties aériennes d’A. tinctoria était environ 3,1 et 4,5 fois supérieure à la TPC des parties aériennes d’A. sylvestris et des racines d’A. sylvestris, respectivement (estimation par comparaison des aires de chromatogramme UV à 280 nm). La teneur totale en glycosides de flavonols (TCF) des parties aériennes d’A. tinctoria était environ 4 et 8 fois supérieure à celle des parties aériennes d’A. sylvestris et des racines d’A. sylvestris, respectivement (aires à 360 nm). En conséquence, la TPC et surtout la TCF de l’extrait méthanolique des parties aériennes comme des racines d’A. sylvestris étaient trop faibles pour laisser attendre des effets notables sur les cellules cancéreuses.
Les parties aériennes accumulaient la plupart des composés phénoliques, tandis que dans les échantillons de racine certains composés n’étaient pas détectés et d’autres l’étaient en moindre abondance. Les composés les plus abondants étaient les acides phénoliques (acides chlorogénique et dicaféoylquiniques). La naringénine n’a été détectée que dans les échantillons d’A. sylvestris, et la lutéoline uniquement dans les échantillons d’A. tinctoria. Au total, le piège à ions a permis d’identifier et de semi-quantifier 47 substances, et le triple quadripôle 22, dans au moins un des extraits végétaux étudiés.
Teneurs totales. La plupart des composés phénoliques des trois matériels végétaux étaient des dérivés de l’acide quinique (acides chlorogéniques, di- et caféoylquiniques, acide féruloylquinique). Le deuxième plus grand groupe, totalement absent des racines d’A. sylvestris, était constitué de glycosides de différents flavonols (quercétine, myricétine, isorhamnétine, kaempférol et patulétine). Étaient également représentés, surtout en petites quantités, des glycosides d’acides phénoliques (acides caféique et coumarique), des flavanones (naringénine et ériodictyol), des flavones (lutéoline) et des stilbénols (pinosylvine). L’herbe d’A. tinctoria se distinguait par son abondance en polyphénols, tant qualitativement que quantitativement ; ses parties aériennes contenaient beaucoup plus de phénols totaux, d’acides chlorogéniques totaux et de flavonols totaux que l’herbe d’A. sylvestris, dont les racines montraient les concentrations les plus faibles de ces composés.
Activité anticancéreuse. Les effets anticancéreux les plus forts ont été observés avec les huiles essentielles des racines et des parties aériennes d’A. sylvestris sur les cellules KB (CI50 de 19,73 μg/mL et 19,84 μg/mL, respectivement). Ces mêmes échantillons ont montré des effets forts à modérés sur d’autres lignées cellulaires, avec des CI50 de 24,69 à 38,06 μg/mL. L’huile essentielle d’A. tinctoria a montré un effet fort sur les cellules KB et LNCaP (CI50 de 27,75 à 29,96 μg/mL) et un effet modéré sur les autres cellules (CI50 de 43,04 à 55,45 μg/mL). L’extrait méthanolique des deux plantes n’a eu aucun effet sur les cellules cancéreuses (CI50 > 100 μg/mL). L’extrait méthanolique des racines d’A. sylvestris a eu un effet modéré sur toutes les cellules cancéreuses (CI50 : 40,08–66,06 μg/mL).
Discussion (points saillants)
L’huile essentielle d’A. tinctoria ne présente pas un composant dominant unique : trois composants majeurs y ont typiquement été trouvés, et l’espèce semble exister sous plusieurs chimiotypes. Contrairement à des études menées en Serbie et en Turquie, le limonène n’a pas été détecté ici, ce qui peut refléter le chimiotype propre à A. sylvestris poussant en Estonie ; la concentration en α-pinène (12,4 %) était en revanche comparable à celle rapportée ailleurs. De nombreuses études rapportent les propriétés anticancéreuses des polyphénols végétaux (inhibition de la prolifération, de l’expansion tumorale, de l’angiogenèse, de l’inflammation et des métastases). La quercétine et le kaempférol, présents surtout sous forme de glycosides dans les parties aériennes des deux espèces, ont divers effets anticancéreux ; l’acide chlorogénique aussi. L’absence d’effet anticancéreux des extraits dans ces essais peut s’expliquer par le fait qu’ils contenaient les polyphénols sous formes glycosidiques, généralement moins actives que les aglycones correspondants ; il conviendrait de répéter les essais avec des extraits hydrolysés enzymatiquement. À la connaissance des auteurs, il n’existait aucune étude antérieure sur la composition polyphénolique d’A. sylvestris, étudiée ici pour la première fois.
Conclusion
Les ocimènes Z et E, l’isobornéol, l’acétate de chrysanthényle, l’époxyde d’humulène, la 2-pentadécanone et l’acétate de nérolidone ont été trouvés pour la première fois dans l’huile essentielle d’A. tinctoria. La teneur totale en polyphénols des parties aériennes d’A. tinctoria était environ 3,1 et 4,5 fois supérieure à celle des parties aériennes d’A. sylvestris et des racines d’A. sylvestris. Les principaux polyphénols des parties aériennes des deux espèces étaient les acides caféoylquinique et dicaféoylquiniques ainsi que plusieurs glycosides de quercétine et de patulétine. Les effets anticancéreux les plus forts ont été observés avec les huiles essentielles des racines et des parties aériennes d’A. sylvestris sur les cellules KB (CI50 19,73 et 19,84 μg/mL), avec des effets forts à modérés sur d’autres lignées (CI50 24,69–38,06 μg/mL). L’huile essentielle d’A. tinctoria a montré un effet fort sur les cellules KB et LNCaP (CI50 27,75–29,96 μg/mL). L’extrait méthanolique des parties aériennes des deux plantes n’a eu aucun effet sur les cellules cancéreuses (CI50 > 100 μg/mL). Les huiles essentielles d’A. tinctoria et d’A. sylvestris pourraient offrir des perspectives pour le développement de composés anticancéreux naturels.